摘 要：針對牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）的5′非翻譯區(qū)（5′UTR）和牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）的gB基因分別選取2對引物，建立這2種病毒的二重二溫式PCR檢測方法，該方法特異性高，可檢出BVDV與IBRV，與牛輪狀病毒等均無交叉反應(yīng)；對BVDV與IBRV的最低檢測質(zhì)量濃度為1.32、0.047 mg/L。使用該方法對采集自寧夏地區(qū)的113份具有BVDV與IBRV臨床癥狀的牛的糞便進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示BVDV與IBRV的陽性檢出率分別為12.39%、22.12%，2種病原體混合感染的陽性檢出率為7.08%。與單重二溫式PCR檢測結(jié)果進(jìn)行比較，得出BVDV陽性符合率為93.33%，IBRV陽性符合率為92.53%，2種病原體混合感染的陽性符合率為100%。

關(guān)鍵詞：牛病毒性腹瀉病毒；牛傳染性鼻氣管炎病毒；二重二溫式PCR；檢測

中圖分類號：S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）和牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）是牛群中常見的病原體，二者所引起的疾病制約著全球養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展[1]。BVDV是單股RNA病毒，屬于黃病毒科瘟病毒屬，在臨床上可引起牛呼吸道癥狀和消化道癥狀，還可造成黏膜糜爛、生產(chǎn)性能下降及生殖障礙等一系列問題[2]。IBRV屬于皰疹病毒科，常導(dǎo)致奶牛流產(chǎn)、呼吸道感染、結(jié)膜炎、腦炎、產(chǎn)奶量下降、子宮炎、腸炎、傳染性膿皰性外陰陰道炎等臨床癥狀[3]。BVDV和IBRV混合感染在臨床較為多見且臨床癥狀難以區(qū)分，故急需建立一種快速檢測方法，為牛病毒性腹瀉（BVD）與牛傳染性鼻氣管炎（IBR）的防控提供一定技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

BVDV與IBRV陽性樣品均由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室鑒定保存。從寧夏不同牛場采集113份疑似感染BVDV和IBRV且出現(xiàn)明顯癥狀的牛的糞樣。

1.2 主要試劑及設(shè)備

病毒DNA/RNA提取試劑盒SE Viral DNA/RNA Kit購自O(shè)MEGA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Ⅲ 1st Strand Cdna Synthesis Kit（+Gdna wiper）購自Vazyne公司；2×Taq PCR MasterMix Ⅱ和DL 500 DNA Marker均購自TIANGEN公司；PCR儀為BIO-RAD公司產(chǎn)品；凝膠成像儀為BioTek公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參照Deng等[4]BVDV 5′UTR序列，IBRV的特異性引物是參照中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《牛傳染性鼻氣管炎聚合酶鏈反應(yīng)操作規(guī)程》（SN/T 1918—2007）中提供的引物。選定好引物后由上海生工生物工程有限公司合成。引物信息和目的片段見表1。

1.4 核酸提取

所有陽性樣品以及113份經(jīng)處理后的糞樣均參照DNA/RNA提取試劑盒提取病毒DNA/RNA，-20 ℃保存病毒DNA，-80 ℃保存病毒RNA。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA后于-20 ℃保存。

1.5 二重二溫式PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

對退火溫度（55～65 ℃）、引物濃度（0.05～0.40 μmol/L）進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 特異性試驗(yàn)

用優(yōu)化后的二重二溫式PCR方法對牛輪狀病毒（BRV）、牛冠狀病毒（BCoV）、牛星狀病毒（BAstV）、牛細(xì)小病毒（BPV）、牛呼吸道合胞體病毒（BRSV）的核酸樣品進(jìn)行檢測，用ddH₂O設(shè)置陰性對照，以確定方法特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)

利用酶標(biāo)儀測得BVDV的cDNA質(zhì)量濃度為1 320.55 mg/L，IBRV的DNA質(zhì)量濃度為47.59 mg/L。將BVDV的cDNA和IBRV的DNA混合液分別進(jìn)行梯度稀釋，以10⁰～10⁶倍比進(jìn)行稀釋，共7個梯度。分別用優(yōu)化后的單重二溫式PCR檢測方法和二重二溫式PCR檢測方法進(jìn)行反應(yīng)，同時用ddH₂O作為陰性對照，以檢測單重二溫式PCR方法和二重二溫式PCR方法的最低檢測限。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的BVDV與IBRV單重二溫式PCR檢測方法和二重二溫式PCR檢測方法分別對BVDV和IBRV進(jìn)行3次檢測，觀察3次檢測結(jié)果是否一致，是否具有較好的重復(fù)性。

1.9 多重PCR檢測方法的應(yīng)用

用建立的二重二溫式PCR檢測方法對采集的113份樣品進(jìn)行檢測，并與單重PCR方法進(jìn)行對照，比較這2種方法之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 二重二溫式PCR最佳退火溫度的確定

建立20 μL反應(yīng)體系：2×Taq PCR預(yù)混劑10 μL，各上、下游引物0.5 μL，模板各1 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55.0～65.0 ℃退火45 s，變性-退火階段循環(huán)33次，最后72 ℃終延伸5 min。將二重二溫式PCR檢測方法的退火溫度分別設(shè)為55.0、55.7、56.9、58.8、61.1、63.0、64.3、65.0 ℃共8個梯度。結(jié)果顯示，各退火溫度均能擴(kuò)增出目的條帶（圖1）。最終結(jié)合2對引物的Tm值，選取二重二溫式PCR反應(yīng)最佳退火溫度為61.1 ℃。

2.2 二重二溫式PCR最佳引物濃度的確定

將體系中BVDV引物和IBRV引物濃度設(shè)置8個濃度梯度，為0.05～0.40 μmol/L，以0.05 μmol/L依次遞增，其他條件不變。選取2條目的條帶中各引物用量最少且最清晰的濃度做為二重二溫式PCR反應(yīng)的最佳引物濃度，最終確定二重二溫式PCR的最佳引物濃度為0.25 μmol/L（圖2）。

通過對退火溫度、引物濃度的優(yōu)化，確定最終的反應(yīng)體系為：2×Taq PCR預(yù)混劑10 μL，各上下游引物0.5 μL，模板各1 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，61.1℃ 退火45 s，預(yù)變性與退火階段33個循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。

2.3 特異性試驗(yàn)

利用優(yōu)化后的二重二溫式PCR檢測方法分別對BRV、BCoV、BAstV、BPV、BRSV的核酸樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示BVDV與IBRV二重二溫式PCR僅能檢測出相應(yīng)陽性模板，擴(kuò)增出的條帶與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小相符，經(jīng)膠回收并測序后發(fā)現(xiàn)目的條帶與參考株序列一致性達(dá)到98%以上。其他病毒均未擴(kuò)增出條帶，表明BVDV與IBRV單重二溫式PCR具有良好的特異性（圖3）。

2.4 敏感性試驗(yàn)

將BVDV與IBRV的陽性模板等比例混合，將混合液以100～106倍液分別進(jìn)行梯度稀釋，利用建立好的二重二溫式PCR方法分別進(jìn)行檢測。結(jié)果表明二重二溫式PCR檢測方法對BVDV和IBRV的最低檢測限分別為1.32、0.047 mg/L（圖4）。這表明該方法敏感度較高。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的二重二溫式PCR檢測方法分別對BVDV和IBRV進(jìn)行檢測，3次檢測結(jié)果一致（圖5）。這表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 多重PCR檢測方法的應(yīng)用

用建立的二重二溫式PCR檢測方法對采集自寧夏各地區(qū)牧場的113份牛糞樣進(jìn)行檢測，并與單重二溫式PCR檢測結(jié)果進(jìn)行比較，其中二重二溫式PCR檢測結(jié)果表明BVDV與IBRV的陽性檢出率分別為12.39%（14/113）、22.12%（25/113），2種病原體混合感染的陽性檢出率為7.08%（8/113）。與單重PCR檢測結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)BVDV陽性符合率為93.33%，IBRV陽性符合率為92.53%，2種病原體混合感染的陽性符合率為100%（表2）。這表明該方法能比較準(zhǔn)確地檢測BVDV與IBRV感染，具有一定的臨床應(yīng)用價值。

3 討論與結(jié)論

國內(nèi)外學(xué)者已建立了針對BVDV與IBRV的PCR檢測方法，但大多為常規(guī)三溫式PCR法，二溫式PCR法鮮有報道。二溫式PCR是一種將退火與延伸溫度合并且僅執(zhí)行2步溫度程序的PCR反應(yīng)。常規(guī)三溫式PCR分為變性、退火、延伸3個溫度程序，而二溫式PCR將退火與延伸過程合并為一步，不僅省略了反復(fù)升溫降溫的時間消耗，節(jié)省了時間，提高了疾病診斷效率，而且因?yàn)橥嘶饻囟容^高可以使反應(yīng)的特異性大大提高[5-6]。目前，對于BVDV與IBRV的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）、實(shí)時熒光定量PCR法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）和膠體金免疫層析技術(shù)（GICA）等[7-8]。這些檢測方法各有優(yōu)劣性，如ELISA法具有良好的特異性、靈敏性和重復(fù)性，但該方法過于昂貴，在大規(guī)模檢測中存在一定局限性[9]；AGID法雖然省時省力且操作簡便，但是準(zhǔn)確性與敏感性較差[10]；實(shí)時熒光定量PCR法具有靈敏、快速、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好以及能夠定量檢測等優(yōu)點(diǎn)，但因受限于儀器設(shè)備，目前只有相關(guān)科研機(jī)構(gòu)和高校用于研究，在基層獸醫(yī)檢測中并未普及[11]；LAMP法具有高效、簡便、快捷、靈敏性高、特異性強(qiáng)、可視化等優(yōu)點(diǎn)，而且對實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件要求不高，但其引物設(shè)計(jì)相對復(fù)雜，需要反復(fù)優(yōu)化條件才能在實(shí)際操作過程中達(dá)到最優(yōu)效果[12]；GICA操作方便，無需任何儀器，樣本不用做前處理，結(jié)果易于判定，特異性好、靈敏度高、速度快捷，在設(shè)施簡單、工作量大的動物檢疫工作中具有很強(qiáng)的實(shí)用性，但在具體操作過程中須嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，以免出現(xiàn)假陽性，對診斷結(jié)果造成誤判，而且GICA試紙條制備困難、價格也較高，在大規(guī)模檢樣中仍存在一定局限性[13]。本試驗(yàn)建立的二重二溫式PCR檢測方法綜合了以上方法的優(yōu)點(diǎn)，具有特異性高、敏感性強(qiáng)、重復(fù)性好，操作簡單、實(shí)用性強(qiáng)、價格低廉的特點(diǎn)，能夠?yàn)锽VD與IBR的防控提供一定技術(shù)支持。

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Establishment and application of a dual two-temperature PCR assay

for BVDV and IBRV

Zhao Hui， Liang Xiaoshan， Wang Xueyan， Gao Rui， Xie Yujie， Xu Lihua

（School of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan 750021，China）

Abstract： Two pairs of primers were selected for the 5′ untranslated region （5′ UTR） of bovine viral diarrhea virus （BVDV） and the gB gene of infectious bovine rhinotracheitis virus （IBRV）， respectively， to establish a dual two-temperature PCR assay for both viruses. This method was highly specific and could detect BVDV and IBRV without cross-reactivity with bovine rotavirus， with the minimum mass concentrations of BVDV and IBRV being 1.32 mg/L and 0.047 mg/L. It was used to test 113 cattle faeces with clinical signs of BVDV and IBRV collected from Ningxia， and the results showed that the positive detection rates for BVDV， IBRV and both were 12.39% （14/113）， 22.12% （25/113） and 7.08%（8/113）， respectively. Compared with the results of the single two-temperature PCR， the positive compliance rate was 93.33% for BVDV， 92.53% for IBRV and 100% for mixed infections of both.

Key words： bovine viral diarrhoea virus； infectious bovine rhinotracheitis virus； dual two-temperature PCR； detection

（責(zé)任編輯 魏 樂）