收稿日期：2021-12-17

基金項(xiàng)目：成都市重點(diǎn)研發(fā)支撐計(jì)劃（2020-YF09-00039-SN）

通信作者：沈 飛（1980—），男，博士、教授、博士生導(dǎo)師，主要從事生物質(zhì)能源方面的研究。fishen@sicau.edu.cn

DOI：10.19912/j.0254-0096.tynxb.2021-1554 文章編號(hào)：0254-0096（2023）04-0247-06

摘 要：以重金屬污染土壤種植的菊芋塊莖為原料經(jīng)過磷酸水解后發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，對(duì)水解條件、轉(zhuǎn)化性能及重金屬在乙醇生產(chǎn)各環(huán)節(jié)的歸趨進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：水解磷酸濃度4%、溫度90 ℃、時(shí)間180 min，固液比1∶6時(shí)，還原糖產(chǎn)率高達(dá)92.40%。水解糖液發(fā)酵48 h后乙醇產(chǎn)量達(dá)53.04 g/L，轉(zhuǎn)化率高達(dá)理論轉(zhuǎn)化率的94.00%。乙醇生產(chǎn)中，40%～90%的重金屬物質(zhì)進(jìn)入廢渣廢液系統(tǒng)，進(jìn)入乙醇的部分小于2%，表明重金屬污染土壤種植菊芋對(duì)后續(xù)乙醇轉(zhuǎn)化無影響，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)加強(qiáng)廢渣的重金屬管控。

關(guān)鍵詞：生物乙醇；水解；發(fā)酵；重金屬；菊芋塊莖

中圖分類號(hào)：S216；X53 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

0 引 言

面對(duì)石化能源的枯竭困境和不斷增長(zhǎng)的能源消耗及其所帶來的環(huán)境問題，開發(fā)利用生物質(zhì)能源具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。中國(guó)對(duì)生物能源的政策堅(jiān)持“不與人爭(zhēng)糧、不與人爭(zhēng)地”，同時(shí)《生物質(zhì)能發(fā)展“十三五”規(guī)劃》指出，可利用邊際性土地開展非糧能源植物的種植，促進(jìn)生物乙醇的發(fā)展［1］?？梢?，合理開發(fā)利用重金屬污染土地是一條重要途徑。

中國(guó)重金屬污染土壤面積總量較大，治理與修復(fù)較難。對(duì)于污染輕、面積大的區(qū)域，采用植物修復(fù)是最有效的方法之一，而植物材料的選擇或獲取是修復(fù)中最為關(guān)鍵的步驟［2］。菊芋生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng)、生物量大、塊莖含糖量高，是乙醇的非糧原料之一，對(duì)Cu、Cd、Hg等吸收富集能力較強(qiáng)［3］。目前，菊芋的生物乙醇轉(zhuǎn)化和重金屬污染土壤修復(fù)的單獨(dú)研究較多，技術(shù)較為成熟，菊芋磷酸水解糖化，有利于重金屬向固定態(tài)轉(zhuǎn)化［4］。因此，高效進(jìn)行乙醇轉(zhuǎn)化的同時(shí)控制重金屬流向，對(duì)利用菊芋開展重金屬污染土壤的修復(fù)和生物乙醇轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建具有重要意義。

基于此，本文研究菊芋水解條件、轉(zhuǎn)化性能以及菊芋-乙醇全轉(zhuǎn)化途徑中典型重金屬的歸趨，以期為邊際土地的利用、菊芋的生物乙醇轉(zhuǎn)化及菊芋-乙醇生產(chǎn)過程中重金屬管控提供技術(shù)參考和理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

菊芋塊莖種植并采收于某中度重金屬污染農(nóng)田。采收后的菊芋塊莖經(jīng)切塊、60 ℃烘干粉碎至40目，密封置于4 ℃冰箱中備用，菊芋塊莖所含重金屬含量如表1。發(fā)酵采用耐高溫干酵母，購(gòu)于湖北安琪酵母公司；葡萄糖、果糖、濃磷酸等試劑均為分析純，購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠。

1.2 磷酸水解

取2.5 g（干質(zhì)量）粉碎后的菊芋塊莖粉，置入一定濃度的磷酸溶液中，在設(shè)定的溫度、酸濃度和固液比條件下，以轉(zhuǎn)速150 r/min水解180 min。水解過程中取1.0 mL溶液，定量加入NaOH溶液（5 mol/L）混勻中和后，在4 ℃下，10000 r/min離心1 min，取上清液進(jìn)行還原糖（果糖和葡萄糖）測(cè)定。對(duì)磷酸濃度、水解溫度以及菊芋塊莖粉與磷酸溶液的固液比3個(gè)重要工藝參數(shù)進(jìn)行研究。研究磷酸濃度時(shí)，將其設(shè)定為2%、3%、4%和5%，水解溫度和固液比分別設(shè)置為90 ℃和1∶6；研究水解溫度時(shí)，設(shè)定為30、50、70、90 ℃，磷酸濃度和固液比分別設(shè)置為4%和1∶6；研究固液比時(shí)，設(shè)定為1∶4、1∶6、1∶8和1∶10，磷酸濃度和水解溫度分別為4%和90 ℃。

1.3 乙醇發(fā)酵

基于所獲得的較優(yōu)菊芋塊莖磷酸水解條件，取100 g菊芋粉置入1000 mL三角瓶中水解180 min。水解結(jié)束后，冷卻至室溫，加入1 mL NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值為5.0，經(jīng)離心后的底渣留存。獲得的糖液經(jīng)滅菌后，以質(zhì)量濃度1.0%接入活化后的干酵母進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵液中酒精含量值達(dá)到最大時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)酒精含量和還原糖含量達(dá)到平衡［5］，乙醇發(fā)酵效率不再增加［6］，此時(shí)可認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程中，在設(shè)定時(shí)間周期內(nèi)定時(shí)取1.0 mL樣品，經(jīng)4 ℃，10000 r/min離心10 min后，上清液用于還原糖和乙醇濃度測(cè)定；發(fā)酵結(jié)束后，取100 mL發(fā)酵醪液添加100 mL高純水進(jìn)行蒸餾，蒸餾獲得100 mL的乙醇溶液留存。蒸餾后的醪液，經(jīng)離心固液分離獲得殘?jiān)蜌堃海ㄉ锨逡海┝舸?。留存的樣品，用于重金屬含量檢測(cè)。

1.4 分析方法

采用高效液相色譜儀（Flexar-10，Perkin-Elmer，美國(guó)）測(cè)定葡萄糖、果糖和乙醇濃度，色譜柱為Shodex糖柱（SH1011，Showa Denko，日本），流動(dòng)相為0.05 mol/L稀硫酸溶液，流速0.8 mL/min，色譜柱和檢測(cè)器溫度為60和50 ℃，以0.5 g/L乳糖為內(nèi)標(biāo)物，測(cè)試過程中每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)2次，取平均值。

原料以及菊芋-乙醇轉(zhuǎn)化各環(huán)節(jié)留存固體樣品中重金屬總量，由樣品經(jīng)鹽酸-硝酸-高氯酸聯(lián)合消煮后，采用ICP-MS測(cè)定［7］（NexION 350，Perkin-Elmer，美國(guó)），留存液體樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，直接用于測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件（Ver. 20.0）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，Duncan多重比較用于判斷處理間的差異顯著性（[P=0.05]）。

2 結(jié)果與討論

2.1 磷酸水解主要工藝條件對(duì)還原糖產(chǎn)出的影響

菊芋塊莖轉(zhuǎn)化乙醇產(chǎn)率與其菊糖通過酸或酶水解轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖有關(guān)［8］。磷酸水解菊芋塊莖作為一種重要的獲取可發(fā)酵糖的方式，其中涉及的磷酸濃度、水解溫度以及菊芋塊莖與磷酸溶液的固液比等是主要的工藝條件，因此在磷酸水解過程中測(cè)得它們對(duì)可發(fā)酵糖產(chǎn)出的影響如圖1所示。由圖1可知，磷酸濃度、水解溫度和固液比對(duì)水解還原糖產(chǎn)出均有顯著影響（[Plt;0.05]）。

c. 固液比影響

基于圖1a，當(dāng)磷酸濃度由2%增至4%時(shí)，菊芋塊莖的水解速率顯著提高。水解結(jié)束時(shí)還原糖的產(chǎn)出由496.9 mg/g增至924.0 mg/g（[Plt;0.05]）。這主要?dú)w因于菊糖中的β-2，l-D-果聚糖苷鍵對(duì)酸較敏感，在H+和適當(dāng)溫度作用下，其發(fā)生斷裂且聚合度下降，酸濃度增加使這種反應(yīng)加劇［9］。然而當(dāng)磷酸濃度提升至5%時(shí)，水解速率無明顯變化，且180 min時(shí)還原糖產(chǎn)出量出現(xiàn)明顯降低（848.7 mg/g）。這可能是因?yàn)樵谒岫容^高的情況下，還原糖發(fā)生了復(fù)合反應(yīng)或分解反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成其他化合物［7］，從而影響還原糖的浸出。

圖1b顯示：當(dāng)磷酸水解溫度由30 ℃升至90 ℃時(shí)，塊莖的水解速率不僅明顯提升，而且在180 min時(shí)的還原糖產(chǎn)出率也由109.0 mg/g增至924.0 mg/g，且差異顯著（[Plt;0.05]）。這可能是因?yàn)樯邷囟瓤墒顾馑俾食?shù)增大。但有研究表明果糖在高溫和酸性介質(zhì)中易分解［10］，且在酸性條件下，當(dāng)果糖和葡萄糖作為糖產(chǎn)率的評(píng)定時(shí)非常敏感，因?yàn)樵诟哂?7 ℃的溫度下果糖和葡萄糖易降解［11］。故90 ℃較為合適的水解溫度。

固液比的提升有利于提高塊莖酸水解后體系的還原糖濃度，但隨著體系中磷酸體積比的增加會(huì)降低在酸水解過程中的固體與酸的混合與傳質(zhì)效率，進(jìn)而影響水解效率，且水解生成的還原糖（包括果糖、葡萄糖及一些二聚糖）會(huì)分解成其他物質(zhì)，即體系中存在連串反應(yīng)：菊糖→還原糖→分解［12］。圖1c可見，固液比由1∶10增至1∶6時(shí)，塊莖的水解速率有一定提升，180 min時(shí)的還原糖產(chǎn)率由736.0 mg/g明顯增至924.0 mg/g（[Plt;0.05]）。然而繼續(xù)增加塊莖比例，使固液比達(dá)1∶4時(shí)，可明顯觀察到水解速率和糖產(chǎn)率的下降。這可能是由于基質(zhì)濃度的增加使水解體系中的游離水量降低，不利于磷酸與基質(zhì)接觸，導(dǎo)致磷酸水解率降低從而使還原糖濃度下降。

目前常見用于菊芋塊莖酸水解轉(zhuǎn)化還原糖的研究多以硫酸、鹽酸等強(qiáng)酸為主。有研究分別采用濃硫酸和稀硫酸水解菊芋塊莖得到菊芋粉轉(zhuǎn)化率分別為94.86%和80.30%［12-13］。對(duì)比Saengkanuk等［10］采用稀鹽酸水解菊芋塊莖所得還原糖產(chǎn)率，可看出3種酸（HCl、H2SO4和H3PO4）中的任何一種都能成功地將菊粉轉(zhuǎn)化為單體糖［14］，且從菊糖轉(zhuǎn)化率角度，未看出磷酸水解對(duì)結(jié)果有顯著影響。同時(shí)表明菊芋塊莖的含糖量未受到重金屬的影響，這與許多其他作物的結(jié)果一致［15］。

2.2 菊芋塊莖水解液乙醇轉(zhuǎn)化性能研究

基于磷酸水解菊芋塊莖工藝條件的影響，選擇磷酸濃度4%、反應(yīng)溫度90 ℃、固液比1∶6，水解180 min所獲得的糖液進(jìn)行乙醇發(fā)酵。發(fā)酵過程中葡萄糖、果糖與乙醇濃度及乙醇轉(zhuǎn)化率如圖2所示。

圖2顯示酵母可利用菊芋塊莖水解后的葡萄糖和果糖，發(fā)酵過程中初始還原糖濃度為110.18 g/L，其中果糖濃度為72.05 g/L，葡萄糖濃度為38.14 g/L。由圖2可知，發(fā)酵過程中果糖利用率明顯高于葡萄糖利用率，這可能是由碳源代謝阻遏效應(yīng)使菌體優(yōu)先利用果糖，而葡萄糖代謝受到抑制［16］。發(fā)酵24 h后果糖被消耗完全，而葡萄糖還有剩余。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乙醇不斷積累，在48 h時(shí)基本達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，剩余還原糖濃度約為21.7 g/L，此時(shí)乙醇濃度為53.04 g/L。轉(zhuǎn)化率高達(dá)理論轉(zhuǎn)化率的94%。國(guó)內(nèi)外對(duì)利用菊芋塊莖生產(chǎn)乙醇進(jìn)行了大量的文獻(xiàn)報(bào)道。如文獻(xiàn)［17］采用重組釀酒酵母發(fā)酵菊芋塊莖干粉所得乙醇轉(zhuǎn)化率約為90%。Razmovski等［18］采用鹽酸水解菊芋塊莖乙醇發(fā)酵所得乙醇轉(zhuǎn)化率為理論轉(zhuǎn)化率的93.89%。對(duì)比已有研究［12，19］可知，雖然菊芋塊莖中的還原糖可通過酸或酶實(shí)現(xiàn)利用，但酸水解依賴于高成本和長(zhǎng)時(shí)間，且兩者所得的乙醇轉(zhuǎn)化率并無較大差異，故本研究選擇磷酸水解成本低且反應(yīng)時(shí)間短。此外，也表明污染土壤上種植對(duì)菊芋塊莖用于能源轉(zhuǎn)化未產(chǎn)生明顯影響。

2.3 菊芋塊莖乙醇轉(zhuǎn)化過程重金屬分布特征

通過上述酸水解和乙醇發(fā)酵的研究可發(fā)現(xiàn)，雖然重金屬的存在并未對(duì)菊芋塊莖乙醇轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)生影響，但在整個(gè)過程中，主要重金屬的流向與分布特征需進(jìn)一步明確，以便為后續(xù)工藝過程管控重金屬風(fēng)險(xiǎn)提供必要參考。本研究選擇菊芋塊莖磷酸水解和乙醇轉(zhuǎn)化過程中涉及的主要環(huán)節(jié)產(chǎn)物，包括酸水解后的糖液、糖渣以及乙醇發(fā)酵后的乙醇、醪液以及醪渣為主要研究對(duì)象。通過分析其重金屬濃度，并計(jì)算其在各環(huán)節(jié)的流向情況，結(jié)果如表2和圖3所示。

表2和圖3顯示：Cu在菊芋塊莖中的含量為7.58 μg/g，通過水解發(fā)酵后，其在醪渣和糖渣殘?jiān)袧舛容^高，分別為75.73 μg/g和9.98 μg/g。通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)Cu在磷酸水解和乙

hydrolysis-ethanol fermentation

醇發(fā)酵過程中，分別有11.84%和52.05%進(jìn)入了醪渣和糖渣，僅0.13%進(jìn)入乙醇。Pb在菊芋塊莖中含量為0.67 μg/g，其在糖渣中濃度最高為0.99 μg/g，計(jì)算得出有87.73%的Pb進(jìn)入了糖渣，0.26%進(jìn)入乙醇。菊芋塊莖中Zn含量最高，在乙醇中Zn濃度最高達(dá)到108.60 μg/L，但通過計(jì)算得到Zn在乙醇中的含量也小于2%。菊芋塊莖中Cd含量為0.37 μg/g，磷酸水解-乙醇發(fā)酵后，糖渣和醪渣中濃度最高為0.39 μg/g和0.61 μg/g，但乙醇中Cd含量同樣較低，僅為0.35%。

以上結(jié)果表明：所研究的菊芋塊莖具有較強(qiáng)的重金屬富集能力。通過計(jì)算可知，Cu、Zn、Pb、Cd進(jìn)入固相（糖渣+醪渣）中的含量分別為63.89%、89.81%、43.82%、44.40%，可見約一半的重金屬進(jìn)入了廢渣系統(tǒng)，這可能是由于磷酸將重金屬離子轉(zhuǎn)化為不溶性磷酸鹽，使重金屬在此過程中以更加穩(wěn)定的形態(tài)存在［20］，且計(jì)算發(fā)現(xiàn)90%以上的Cu、Zn、Pb和Cd主要?dú)埩粼趶U渣廢液系統(tǒng)。由此可見，重金屬主要?dú)埩粼诰圃憷?，乙醇中殘留微量，這與曹喜煥等［21］采用木薯乙醇發(fā)酵，檢測(cè)進(jìn)入酒精中的重金屬發(fā)現(xiàn)結(jié)果相似，其考察進(jìn)入乙醇中的重金屬小于2%。對(duì)比Vintila等［22］用甜高粱進(jìn)行乙醇發(fā)酵過程中重金屬在乙醇中分布結(jié)果相似。該結(jié)果表明菊芋作為一種非糧作物，能在受污染的土壤上生長(zhǎng)，其塊莖水解所得發(fā)酵糖用于乙醇發(fā)酵后，并未在乙醇部分檢測(cè)到較多重金屬。結(jié)合菊芋產(chǎn)出特征、重金屬污染土壤修復(fù)能力以及邊際性土地生產(chǎn)生物乙醇潛力巨大的特點(diǎn)，為菊芋塊莖的安全增值提供了理論依據(jù)。

3 結(jié) 論

1）重金屬污染土壤上種植的菊芋可作為生物乙醇的生產(chǎn)原料，其塊莖含糖量及乙醇產(chǎn)率均未受到不利影響。當(dāng)水解條件為固液比1∶6、磷酸濃度4%、反應(yīng)溫度90 ℃、反應(yīng)時(shí)間180 min，水解還原糖產(chǎn)率為92.40%。發(fā)酵48 h得到乙醇產(chǎn)量為53.04 g/L，轉(zhuǎn)化率為理論轉(zhuǎn)化率的94%。

2）菊芋塊莖中吸收富集的Cu、Zn、Pb、Cd等重金屬，在磷酸水解階段，分別以47.95%、12.27%、57.72%、57.54%進(jìn)入糖液，在乙醇發(fā)酵階段，乙醇系統(tǒng)中僅分別殘留0.13%、0.26%、1.52%、0.35%，其余進(jìn)入廢渣廢液系統(tǒng)，實(shí)際生產(chǎn)中需加強(qiáng)廢液廢渣的重金屬管控。

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ETHANOL CONVERSION PERFORMANCE AND HEAVY METAL TREND OF Jerusalem artichoke TUBER IN MINE HEAP AREA

Fan Zhanhui1，2，Zeng Lijuan3，Qi Minghui3，Xiao Wenxiong4，Shen Fei1

（1. College of Environmental Science， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China；

2. Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Chengdu 611130， China；

3. Keyuan Engineering Technology Testing Centre of Sichuan Province， Chengdu 610073， China；

4. Sichuan Tianfujincheng Circular Economy Institute Limited Co.， Chengdu 610000， China）

Abstract：In this work， Jerusalem artichoke tubers harvested from the heavy metal polluted soil were employed to produce ethanol via phosphoric acid hydrolysis and fermentation. The hydrolysis conditions， ethanol fermentation performance and the distribution of heavy metals in each stream of ethanol production were investigated. Results indicated that the suitable conditions for yielding the reducing sugar from tuber is phosphoric acid concentration of 4%， temperature of 90 ℃， hydrolysis duration of 180 min， and solid-liquid ratio of 1∶6， by which the reducing sugar yield reachs 92.40%. The subsequent ethanol yield reachs 53.04 g/L within 48 h with the conversion rate of 94.00%. In the whole process of ethanol production， 40%-90% of heavy metals enter the waste residue and waste liquid system， and less than 2% enter the ethanol part， thus， it should be paid more attentions on the fermented mash， especially on the solid part of the fermented residues.

Keywords：bioethanol； hydrolysis； fermentation； heavy metal； Jerusalem artichoke tuber