摘 要：通過(guò)對(duì)古代經(jīng)典名方二陳湯基礎(chǔ)方的研究，建立現(xiàn)代劑型二陳顆粒中橙皮苷含量的測(cè)定方法。運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定經(jīng)典名方二陳顆粒中橙皮苷的含量，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，本檢測(cè)方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，陰性無(wú)干擾，橙皮苷在10.11～202.2 μg的范圍內(nèi)與峰面積積分值的線性關(guān)系良好，R2=0.999" 9，平均回收率99.89%，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性均符合要求。研究表明，高效液相色譜法測(cè)定二陳經(jīng)方顆粒中橙皮苷含量結(jié)果準(zhǔn)確可靠，精密度高，重現(xiàn)性好，可用于二陳經(jīng)方顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：二陳湯；經(jīng)典名方；顆粒；橙皮苷；HPLC；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

中圖分類(lèi)號(hào)：R283.6

經(jīng)典名方作為中醫(yī)理論的載體，是中醫(yī)藥傳承發(fā)展的突破口之一，目錄管理的經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑研發(fā)、上市經(jīng)典名方產(chǎn)品的二次開(kāi)發(fā)、源于經(jīng)典名方的中藥新藥研發(fā)是經(jīng)典名方研發(fā)的3條路徑[1]。二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，被公認(rèn)為是中醫(yī)方劑學(xué)中祛痰劑之代表方[2]，古代同名異方及同方異名較多。且后世醫(yī)家常以二陳湯為基礎(chǔ)加減變化，形成諸多衍化方，不但針對(duì)濕痰、還可治療熱痰、寒痰、燥痰、風(fēng)痰[3]。為方便臨床上隨癥加減用藥，文章以二陳古籍經(jīng)方為基礎(chǔ)；以傳統(tǒng)中藥理論為指導(dǎo)以水為提取溶劑，保證經(jīng)典名方原有的湯劑藥效；以現(xiàn)代制劑工藝為抓手，將原湯劑或丸劑改變?yōu)轭w粒劑，以提升中藥的生物利用度，提高穩(wěn)定性，同時(shí)有利于工業(yè)生產(chǎn)，且服用方便。文章對(duì)二陳經(jīng)方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行深入研究分析。

1 儀器與試藥

儀器：UPH-I-10T 純水系統(tǒng)（成都超純科技公司）；SK250HP超聲清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器公司）；SHIMADZU Prominence高效液相色譜、LC Solution工作站（日本島津）、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器。

試劑：甲醇（色譜純）；水（純化水）；其余試劑（分析純）。

對(duì)照品：橙皮苷（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110721-201115）。

供試品：前期二陳經(jīng)方顆粒工藝研究過(guò)程中小試及中試樣品。

2 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠填充；色譜柱（phenomenex" Luna" C18" 150×4.60mm、5μm。）

流動(dòng)相：以2種流動(dòng)相分別進(jìn)行試驗(yàn)：1. 甲醇-醋酸-水（42：4：54） 2.甲醇-醋酸-水（35：4：61），試驗(yàn)結(jié)果表明，2種流動(dòng)相中，以甲醇-醋酸-水（35：4：61）作為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min時(shí)橙皮苷峰與雜質(zhì)峰分離效果更好，因此確定以甲醇-醋酸-水（35：4：61）為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定。

檢測(cè)波長(zhǎng)：以甲醇-醋酸-水（35：4：61）為流動(dòng)相，使用二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)得到橙皮苷的紫外全波長(zhǎng)掃描圖譜，橙皮苷在以上色譜條件下有一吸收峰，最高峰處波長(zhǎng)為284 nm。參考2020版《中國(guó)藥典》二陳丸橙皮苷含量測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm，故確定本方法檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm。

橙皮苷紫外全波長(zhǎng)掃描圖譜見(jiàn)圖1。

柱溫、流速：試驗(yàn)結(jié)果表明，采用柱溫40 ℃，流速為1 mL/min時(shí)。橙皮苷與其他雜質(zhì)峰分離較好。

3 試驗(yàn)方法

3.1 制備對(duì)照品溶液

在50 mL稱(chēng)量瓶?jī)?nèi)精稱(chēng)橙皮苷對(duì)照品約10 mg，加甲醇溶解稀釋至刻線，搖勻，于10 mL稱(chēng)量瓶中精密量取2 mL橙皮苷對(duì)照溶液，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得每l mL含橙皮苷40 μg[4]。

3.2 制備供試品溶液

于具塞三角瓶?jī)?nèi)精稱(chēng)二陳經(jīng)方顆粒約0.2 g，將50 mL甲醇精密加入瓶?jī)?nèi)，密塞，稱(chēng)重，超聲30 min（功率120 W，頻率40 kHz），放冷，再稱(chēng)重，以甲醇補(bǔ)足減重，混勻過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

3.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱的理論板數(shù)、分離度、拖尾因子應(yīng)符合“高效液相色譜法”中國(guó)藥典各項(xiàng)下的要求。

3.4 理論板數(shù)的計(jì)算

在上述條件下，將供試品溶液注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，量出供試品溶液橙皮苷峰的保留時(shí)間Tr（以分鐘或長(zhǎng)度計(jì)算）和半峰高寬（Wh/2），按n=5.54（Tr/Wh/2）2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1 500。

3.5 分離度

“高效液相色譜法”中國(guó)藥典中規(guī)定待測(cè)峰與其他峰的分離度應(yīng)不小于1.5，按分離度的計(jì)算公式計(jì)算供試品色譜中橙皮苷的峰與其他峰的分離度，試驗(yàn)表明樣品的分離度均符合規(guī)定。

分離度的計(jì)算公式為：

R=2（tR2-tR1）/（W1+W2）

式中：tR2為相鄰兩峰后一峰的保留時(shí)間；tR1為相鄰兩峰前一峰的保留時(shí)間；W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。

3.6 拖尾因子

“高效液相色譜法”中國(guó)藥典中規(guī)定：除另有規(guī)定外，峰高法測(cè)定時(shí)T應(yīng)在0.95～1.05，峰面積法測(cè)定時(shí)，未作明確規(guī)定。本法用峰面積法測(cè)定含量，因此不予考慮拖尾因子影響。

3.7 重復(fù)性

“高效液相色譜法”中國(guó)藥典中規(guī)定，連續(xù)進(jìn)樣5次，對(duì)照品峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。

精密量取橙皮苷對(duì)照品溶液（107.0 μg/L），進(jìn)樣量l0 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次（依照上述色譜條件），結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果的RSD為分別為0.12%、0.56％ （n=5），表明本法的重復(fù)性較好，能滿足定量分析要求，見(jiàn)表1。

4 結(jié)果與討論

4.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照品3種溶液各2份，每份分別10 μL，分別注入色譜儀。供試品與對(duì)照品溶液圖譜在相同保留時(shí)間位置均出現(xiàn)了色譜峰，而陰性對(duì)照品圖在此處并無(wú)出現(xiàn)色譜峰，因此無(wú)干擾，見(jiàn)表2及圖2—圖4。

4.2 線性關(guān)系考察（同一對(duì)照品精密稀釋至少5個(gè)濃度）

分別精密吸取橙皮苷對(duì)照品溶液（202.20 μg/L）0.5、1、2、4、6 mL，置于l0 mL稱(chēng)量瓶，加甲醇至刻度線，搖勻，制成濃度分別為10.11、20.22、40.44、80.88，

121.32 μg/L系列對(duì)照品溶液。精密量取原對(duì)照品溶液（202.20 μg/L）及上述5份稀釋后對(duì)照品溶液，各l0 μL，分別注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，橫坐標(biāo)（X）為橙皮苷質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)（Y）為峰面積積分值，得Y=17 761X+2 411.5，R2=0.999 9的線性回歸方程。結(jié)果表明，橙皮苷在10.11～202.2 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系，見(jiàn)表3及圖5。

4.3 重復(fù)性試驗(yàn)（供試品同一濃度連續(xù)進(jìn)樣6次）

取同一批樣品，依法制備供試品溶液6份，各進(jìn)樣10 μL。平均含量為12.95 mg/g，RSD為1.84％（n=6），見(jiàn)表4。

4.4 準(zhǔn)確度（加樣回收）

精稱(chēng)6份已知含量的樣品（12.95 mg/g）約0.02 g，按供試品溶液方法制備。并各加入橙皮苷對(duì)照品溶液（40.44 μg/L）7.5 mL，對(duì)照品加入量即為0.303 3 mg，制加樣回收供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

回收率%=[（實(shí)測(cè)橙皮苷量-樣品中橙皮苷量）/添加橙皮苷量]×100%

4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24/h各進(jìn)樣10 μL。橙皮苷的不同時(shí)段的峰面積見(jiàn)表6。RSD為1.35％（n=7），表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

4.6 耐用性試驗(yàn)

為了確保本方法在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響，現(xiàn)通過(guò)單因素分析，分別對(duì)柱溫（40 ℃±2 ℃）、流動(dòng)相組成（甲醇：醋酸水=35±2：65±2）、流速（1.0±2 mL/min）做微小調(diào)整后，分別按照含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。取橙皮苷對(duì)照品溶液濃度為40.44 μg/L，精密稱(chēng)取樣品一份樣品0.219 8 g處理后，分別在上述色譜條件下各進(jìn)樣10μL，所得結(jié)果RSD為0.49%，見(jiàn)表7（As為對(duì)照品峰面積；At為樣品峰面積）。說(shuō)明本方法具有可靠性。

4.7 二陳顆粒含量測(cè)定

取二陳經(jīng)方顆粒不同批次各3批，各批分別精稱(chēng)2份，每份0.2 g左右，制備供試品溶液后，并分別進(jìn)樣2針，各10 μL，測(cè)定，計(jì)算樣品含量。3份樣品的平均值為14.206 9 mg/g，由于樣品量較少，所以將平均含量下浮60%：14.20 mg/g×60%=10.57 mg/g≈8.52 mg/g。每袋裝量為3 g，所以限度暫定為：本品每袋含陳皮以橙皮苷（C28H34O15）計(jì)，不得少于0.025 g，見(jiàn)表8。

本法以陳皮中有效成分橙皮苷為含量測(cè)定指標(biāo)，采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，專(zhuān)屬性強(qiáng)，可有效控制二陳經(jīng)方顆粒的質(zhì)量，因此將該方法收入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]" 楊洪軍，黃璐琦. 經(jīng)典名方的研發(fā)：中醫(yī)藥傳承發(fā)展的突破口之一[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥，2018，20（7）：775-779.

[2]" 張紅麗. 二陳湯的文獻(xiàn)學(xué)研究[D]. 石家莊：河北中醫(yī)院，2005，1.

[3]" 彭欣. 二陳湯及其類(lèi)方研究[D]. 濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2001.

[4]" 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020.

*基金項(xiàng)目：甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目“中藥經(jīng)典名方復(fù)方制劑工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究”（22JR5RA802）；甘肅省藥品監(jiān)督管理局科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目“植物源中藥材農(nóng)藥殘留檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)研究”（2022GSMPA-KL08）。

△通信作者：崔建軍（1974-），男，高級(jí)工程師，研究方向：中藥材資源開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。E-mail：412143587@qq.com。