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收稿日期：2023-04-20

基金項目：貴州省教育廳自然科學研究項目（黔教合KY字〔2020〕193號）；黔南州科技計劃項目（黔南科合〔2018〕14號）。

作者簡介：周爽爽（1988—），女，貴州甕安人，碩士，講師，從事植物保護教學和研究。E-mail：zhoushuangshuang@sgmtu.edu.cn。

周爽爽.小貫小綠葉蟬氣味結(jié)合蛋白EnouOBP17與食誘劑成分的分子對接研究[J].南方農(nóng)業(yè)，2023，17（21）：1-6，11.

摘 要 為探究小貫小綠葉蟬氣味結(jié)合蛋白EonuOBP17與13種食誘劑成分的結(jié)合模式和結(jié)合能力，給小貫小綠葉蟬氣味結(jié)合蛋白分子識別機制研究和食誘劑的廣泛篩選提供新路徑，采用MOE軟件進行了分子對接實驗。結(jié)果表明：EonuOBP17與12種食誘劑成分有較好的結(jié)合能力，僅與DMNT結(jié)合較弱。其中，十六烷與EonuOBP17的結(jié)合能最低，親和力最強；苯甲醛與EonuOBP17的結(jié)合能最高，親和力較弱。并探明了EonuOBP17蛋白與化合物分子作用的氨基酸位點情況。EnouOBP17可以作為食誘劑進一步篩選的靶標蛋白。

關(guān)鍵詞 小貫小綠葉蟬；氣味結(jié)合蛋白；食誘劑；分子對接

中圖分類號：S435.711；[Q816] 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.21.001

在中國茶樹栽培生產(chǎn)中，各茶產(chǎn)區(qū)均有茶小綠葉蟬分布，為害較重[1]，其中小貫小綠葉蟬（Empoasca onukii Matsuda）又名假眼小綠葉蟬，是為害尤為突出的主要種群[2-3]；其成蟲、若蟲刺吸茶樹汁液，常致茶樹葉片焦黃、枯萎，是導致茶樹生長遲滯、減產(chǎn)的重要因素[4-5]。小貫小綠葉蟬的防控研究一直是茶園植物保護領(lǐng)域的重點[1，6]。

以茶樹揮發(fā)物為研究基礎(chǔ)的食誘劑開發(fā)是當前茶樹害蟲綠色防控的研究熱點之一[7-10]。隨著分子技術(shù)和計算機綜合應用的發(fā)展，利用蛋白模型與配體進行分子對接是一種便利高效地研究蛋白質(zhì)結(jié)合功能的方法，可在分子計算層面顯示受體蛋白與配體分子的相互作用[11-13]。由此比較不同蛋白質(zhì)與配體結(jié)合的差異性，也可以比較不同化合物與同一蛋白的結(jié)合能力，進一步篩選有利用價值的蛋白和化合物分子[14-15]。在昆蟲嗅覺感受系統(tǒng)中，氣味結(jié)合蛋白（odorant-binding proteins，OBPs）是一類主要行使化合物分子識別和運輸功能的水溶性蛋白[16-17]。OBPs蛋白氨基酸序列具有保守性和多變性，研究表明不同OBPs蛋白與環(huán)境中的揮發(fā)性化合物結(jié)合存在一定的特異性[18-20]。以O(shè)BPs蛋白為靶標，采用分子對接技術(shù)研究其與不同揮發(fā)性化合物的結(jié)合能力，可為引誘劑或驅(qū)避劑開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，提高篩選效率。

本實驗對EnouOBP17蛋白模型與食誘劑成分開展分子對接研究，旨在闡明EnouOBP17與食誘劑分子的結(jié)合模式和結(jié)合能力。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 蛋白模型準備

通過AlphaFold蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（https：//www.alphafold.ebi.ac.uk/）獲得小貫小綠葉蟬氣味結(jié)合蛋白EnouOBP17的三維結(jié)構(gòu)模型[21]。在UCLA網(wǎng)站（http：//services.mbi.ucla.edu/）上利用評估程序?qū)Φ鞍啄Ｐ偷馁|(zhì)量進行檢測。ERRAT程序主要是統(tǒng)計0.35 nm范圍內(nèi)蛋白質(zhì)不同類型原子間形成的非共價鍵數(shù)據(jù)，結(jié)果必須大于50%[22]。Verify-3D程序主要統(tǒng)計大于或等于0.2氨基酸3D-1D的相容性分值，結(jié)果必須超過80%[23]。ProCheck程序以拉氏構(gòu)象圖體現(xiàn)蛋白質(zhì)模型立體化學質(zhì)量，處于最佳區(qū)域和額外允許區(qū)域的氨基酸殘基數(shù)量超過90%，視為模型結(jié)構(gòu)可靠[24]。

1.1.2" 配體化合物準備

查閱文獻收集了13種茶小綠葉蟬食誘劑成分[25-30]，列于表1；通過有機小分子生物活性數(shù)據(jù)PubChem分子庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢，獲得13種化合物的二維結(jié)構(gòu)（SDF格式文件）用于分子對接實驗。

1.2" 方法

分子對接：本研究采用MOE（Molecular Operating Environment）軟件進行對接。對接模式選擇Induced Fit，Placement選擇Alpha PMI，Rescoring1選擇Alpha HB，Refinement選擇GridMin，Refinement2選擇ASE[31]。

親和力判斷：根據(jù)結(jié)合能評分（S）和相互作用情況綜合判斷受體和配體間的親和力。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型評估分析

在AlphaFold蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫下載得到EonuOBP17的三維結(jié)構(gòu)模型。ProCheck程序顯示處于最佳區(qū)域和額外允許區(qū)域的氨基酸殘基數(shù)量為99.4%，模型結(jié)構(gòu)可靠（見圖1）；Verify-3D程序結(jié)果超過80%，表明蛋白模型質(zhì)量合理（見圖2）；ERRAT 程序結(jié)果為82.68%，說明蛋白模型整體合理（見圖3）。綜合評估表明，EonuOBP17的蛋白三維結(jié)構(gòu)模型可以用于分子對接研究。

2.2" 分子對接結(jié)果分析

2.2.1" 分子對接相互作用

對接結(jié)果（見表2）顯示，EonuOBP17與十六烷、α-法呢烯、壬醛、芳樟醇、牻牛兒醇、苯甲酸乙酯、（E）-羅勒烯、檸檬烯、（Z）-3-己烯醇、（E）-2-己烯醛、（Z）-3-己烯醇醋酸酯、苯甲醛等12種化合物具有實際的相互作用；EonuOBP17與DMNT在不同構(gòu)象下都未檢測到分子間的相互作用。

2.2.2" 分子對接結(jié)合能

由表2可知，EonuOBP17與12個食誘劑成分分子對接的結(jié)合能得分（S）均為負值，說明EonuOBP17與這些化合物分子間的相互作用都是自發(fā)的、穩(wěn)定的。且結(jié)合能越低，說明受體蛋白與配體間的結(jié)合越好。此次對接實驗結(jié)果表明，在12種有實際分子間相互作用的食誘劑成分中，十六烷與EonuOBP17的結(jié)合能最低，親和力最強；苯甲醛與EonuOBP17的結(jié)合能最高，親和力較弱。

2.2.3" 分子間結(jié)合位點和作用方式

由表2可知，十六烷、檸檬烯2種化合物與EonuOBP17相互作用的氨基酸位點都是極性氨基酸His55，相互作用方式都是H-pi；壬醛、牻牛兒醇、（E）-2-己烯醛3種化合物與EonuOBP17相互作用的氨基酸位點一致，均涉及非極性氨基酸Ala37和極性氨基酸His191兩個氨基酸位點，但相互作用方式有差異，壬醛和（E）-2-己烯醛都是H-acceptor，牻牛兒醇是H-acceptor和H-donor兩種。（Z）-3-己烯醇與EonuOBP17相互作用的氨基酸位點只有極性氨基酸His191，相互作用方式為H-acceptor。α-法呢烯、芳樟醇、苯甲酸乙酯、（E）-羅勒烯、（Z）-3-己烯醇醋酸酯、苯甲醛與EonuOBP17相互作用的氨基酸位點與上述化合物均不相同，這6個化合物與蛋白結(jié)合的氨基酸位點也互不相同。

EonuOBP17蛋白與化合物分子作用的氨基酸位點情況統(tǒng)計列于表3，涉及5種氨基酸，非極性氨基酸3種，3個Ala，2個Phe，2個Pro；極性氨基酸2種，6個His，2個Lys。

3" 討論與結(jié)論

3.1" 討論

本研究用的EnouOBP17蛋白三維結(jié)構(gòu)模型是由AlphaFold預測的。AlphaFold是DeepMind的AlphaFold團隊開發(fā)的一種人工智能程序，旨在使用深度學習技術(shù)預測蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)是關(guān)鍵的生物分子，在人體中發(fā)揮各種作用，包括催化化學反應的酶和傳遞信息的信號蛋白。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，即其氨基酸的折疊和相互作用方式，決定了它的功能。與此相對應的實驗方法，如X射線晶體學和核磁共振（NMR）光譜學，非常耗時、昂貴，且常常產(chǎn)生低質(zhì)量的結(jié)果。AlphaFold旨在通過快速、準確地預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來解決這個問題。該程序使用深度神經(jīng)網(wǎng)絡在公開蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)上進行訓練，以基于氨基酸序列進行預測。AlphaFold的預測已通過實驗數(shù)據(jù)進行基準測試，并表現(xiàn)出卓越的準確性，超過了該領(lǐng)域中其他方法的表現(xiàn)。AlphaFold的發(fā)展在生物化學領(lǐng)域具有重要意義，因為它可以通過提供更準確、更具成本效益的方法來確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，加速新藥物和療法的發(fā)現(xiàn)。

蛋白功能的研究方法多樣，分子對接已成為常用方法之一。由于同一家族或同一類蛋白，氨基酸序列一般具有相似性和保守性，因此可利用同源模建原理模擬得到蛋白質(zhì)模型[32]。蛋白三維結(jié)構(gòu)模型可經(jīng)第三方軟件對模型評分（SAVES v5.0），共六個評估程序，三個或三個以上的程序評估通過才算合格的模型。本研究用的EnouOBP17蛋白三維結(jié)構(gòu)模型在SAVES v5.0中，同時經(jīng)過ERRAT、Verify-3D、ProCheck三個程序的評價要求，確保了結(jié)構(gòu)模型合理性，為分子對接實驗增加可靠度。

在食誘劑成分的篩選中，對傳統(tǒng)的電生理實驗、行為選擇實驗、熒光競爭結(jié)合實驗等已有較多研究報道[33]。這些實驗方法對實驗平臺的要求較高，且較為耗時費力。應用計算生物學技術(shù)模擬得到蛋白模型，在虛擬狀態(tài)下測算受體蛋白與化合物小分子間的親和力，也可以篩選有潛在利用價值的蛋白或化合物。本研究的分子對接實驗表明，EnouOBP17與大部分已報道的小貫小綠葉蟬食誘劑均有較好的結(jié)合能力，說明EnouOBP17可以作為食誘劑進一步篩選的靶標蛋白。

分子對接的基本原理是對接計算，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和物理參數(shù)，利用計算機計算預測分子間的相互作用。在多種結(jié)構(gòu)變換下，受體和配體間分子接觸面最大程度發(fā)生相互作用，結(jié)構(gòu)和分子間作用力都處于最優(yōu)狀態(tài)。因此，蛋白與配體化合物結(jié)合能大小與蛋白的三維結(jié)構(gòu)、小分子配體的相對分子質(zhì)量及其所含有的官能團有關(guān)[34]。表1中食誘劑成分化合物的分子量排序與表2中對接結(jié)合能的排序相似度極大，例如分子量最大的十六烷，與EnouOBP17對接有實際的分子間相互作用，且結(jié)合能也是12種物質(zhì)中最高的。這與常延斌等[34]研究得出的配體和受體親和力大小與配體相對分子質(zhì)量的大小有關(guān)的觀點相一致。

一般極性氨基酸（親水）是在蛋白結(jié)構(gòu)性和功能性方面發(fā)揮重要作用，非極性氨基酸（疏水）在蛋白結(jié)構(gòu)形成中較為關(guān)鍵，常位于核心區(qū)域。對接結(jié)果顯示，His、Ala、Lys、Phe、Pro這5種氨基酸可能是EnouOBP17的關(guān)鍵氨基酸殘基，在EnouOBP17結(jié)合氣味分子中發(fā)揮著重要作用。

十六烷、α-法呢烯、壬醛、芳樟醇、牻牛兒醇、苯甲酸乙酯、（E）-羅勒烯、（Z）-3-己烯醇醋酸酯、檸檬烯、（Z）-3-己烯醇、（E）-2-己烯醛、苯甲醛等與EnouOBP17有實際的分子作用，且親和力較好的12種化合物，在茶樹揮發(fā)物及鮮葉成分研究中都有大量報道[35]。在茶樹自然生長條件下?lián)]發(fā)的化合物，往往在害蟲寄主定位中發(fā)揮嗅覺吸引和驅(qū)避的作用[36-37]。任倩倩等研究表明，健康茶樹釋放一定量的揮發(fā)性物質(zhì)，但種類和含量都較低，害蟲為害誘導會產(chǎn)生順-β-羅勒烯、DMNT、芳樟醇、法尼烯等10種主要揮發(fā)物[38]。這些物質(zhì)可吸引天敵控制害蟲[39]。EnouOBP17除與DMNT無分子間的相互作用外，與其他物質(zhì)都有較好的結(jié)合。推測EnouOBP17主要在寄主定位中發(fā)揮作用，在天敵逃避行為中可能發(fā)揮一定的作用。

在蘋果蠹蛾、桔小實蠅等多種害蟲研究中，應用分子對接技術(shù)研究氣味結(jié)合蛋白與揮發(fā)物化合物間的結(jié)合能力和結(jié)合模式，為驅(qū)避劑和引誘劑的篩選提供理論基礎(chǔ)已得到實踐[40-41]。

3.2" 結(jié)論

本文利用MOE軟件，探究了小貫小綠葉蟬氣味結(jié)合蛋白EnouOBP17與13種食誘劑成分的結(jié)合能力和結(jié)合模式，結(jié)果表明：EonuOBP17與12種食誘劑成分有較好的結(jié)合能力，僅與DMNT結(jié)合較弱；EnouOBP17可以作為食誘劑進一步篩選的靶標蛋白。并探明了EonuOBP17蛋白與化合物分子作用的氨基酸位點情況。研究結(jié)果為小貫小綠葉蟬氣味結(jié)合蛋白分子識別機制研究和食誘劑的廣泛篩選提供了新路徑。

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（責任編輯：丁志祥）