曹明芳 石楠楠 李婧 袁智 王大池 姜洲洲

摘 要：532 nm激光光凝是誘導(dǎo)嚙齒類動物脈絡(luò)膜新生血管（CNV）的一種既定方法。本研究旨在評價激光誘導(dǎo)CNV在體內(nèi)和體外隨時間變化的形態(tài)變異程度，為今后CNV相關(guān)研究提供觀察指標(biāo)。本實驗首先對棕色挪威（BN）大鼠進(jìn)行激光造模，隨后，根據(jù)不同時間點(diǎn)對其進(jìn)行體內(nèi)眼底照相、光學(xué)相干斷層掃描（OCT）、眼底熒光血管造影（FFA）和吲哚菁綠血管造影（ICGA），最后，應(yīng)用組織病理檢查進(jìn)行體外驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光凝后第7天出現(xiàn)CNV，第21天的CNV總發(fā)生率最高。FFA呈典型圓盤狀強(qiáng)熒光滲漏，ICGA顯示光凝區(qū)周邊強(qiáng)熒光，中央低熒光，呈花環(huán)狀形態(tài)。光學(xué)顯微鏡下可見，造模后第7天，視網(wǎng)膜下CNV形成，第7～21天，CNV中央厚度逐漸增加，第28天，CNV中央厚度保持相對穩(wěn)定。這提示，532 nm激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV模型造模時間短，成功率高。這種造模方式可以廣泛應(yīng)用于臨床前實驗研究，為進(jìn)一步研究CNV發(fā)病機(jī)制提供了思路。

關(guān)鍵詞：激光誘導(dǎo)；532 nm；脈絡(luò)膜新生血管；動物模型；BN大鼠

中圖分類號：R774；Q95-3 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.04.005

Laser-induced Morphological Variability of Choroidal NeovasculaRization in Rats： in vivo and in vitro Characterization Studies

CAO Mingfang1， SHI Nannan1， 2*， LI Jing 1， YUAN Zhi1， 2， WANG Dachi1， 2， JIANG Zhouzhou1， 2

（1. Peoples Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350004， China; 2. First Clinical Medical College， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China）

Abstract： 532 nm laser photocoagulation is an established method to induce choroidal neovascularization （CNV） in rodents. 532 nm laser photocoagulation is an established method for inducing CNV in rodents. The aim of this study was to evaluate the degree of morphological variation of laser-induced CNV in vivo and in vitro over time so as to provide an observational metric for future CNV-related experiments. In this experiment， brown Norway rats were first laser-molded. Subsequently， in vivo fundus photography， optical coherence tomography （OCT）， fundus fluorescence angiography （FFA） and indocyanine green angiography （ICGA） were performed according to different time points， and finally histopathological examination was applied for in vitro validation.The results showed that CNV appeared at 7th day after photocoagulation， with the highest total incidence of CNV at 21th day. FFA showed typical disc-like strong fluorescence leakage， while ICGA displayed strong fluorescence at the periphery of the photocoagulation area and low fluorescence in the center with a wreath-like morphology. Subretinal CNV were formed 7th day after molding as seen under optical microscope. The central thickness of the CNV gradually increased from 7th to 21th day and remained relatively stable until 28th day. This suggests that the modeling approach utilizing 532 nm laser-induced BN rats with CNV exhibits a short duration and high success rate， rendering it applicable for preclinical experimental studies and providing insights for further research on the pathogenesis of CNV.

Key words： laser-induced; 532 nm; choroidal neovascularization; animal model; brown Norway rats

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（4）： 321-329）

脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）又稱視網(wǎng)膜下新生血管，是來自脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的增殖血管，通過Bruch膜裂口而擴(kuò)展，在Bruch膜與視網(wǎng)膜色素上皮之間、神經(jīng)視網(wǎng)膜與視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）之間或RPE與脈絡(luò)膜之間增殖形成。CNV是多種病理血管相關(guān)疾病的常見表現(xiàn)，包括年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）、眼組織胞漿菌病綜合征、近視和特發(fā)性CNV［1-2］。AMD是一種退行性病變，可導(dǎo)致視力不可逆地下降或喪失，目前在我國致盲性眼病中位列第三［3］。其中濕性AMD（wet AMD，wAMD）主要病理表現(xiàn)為CNV形成，它是導(dǎo)致嚴(yán)重視力喪失的最主要的原因之一。由于AMD是一種復(fù)雜的老年性疾病，其確切的發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚。然而，CNV動物模型能夠重現(xiàn)wAMD 的組織病理學(xué)、生化和病理生理學(xué)變化的某些關(guān)鍵特征，可能為其潛在的分子機(jī)制提供新見解［4］。

高效、穩(wěn)定、可重復(fù)的動物模型對研究疾病的病理機(jī)制及藥物療效觀察十分重要。前期閱讀文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，激光誘導(dǎo)的CNV大鼠模型已成為世界上最成熟和最常用的研究CNV發(fā)病機(jī)制及其治療反應(yīng)的重要模型［5-6］。該模型通過對RPE和Bruch膜進(jìn)行靶向激光損傷，誘導(dǎo)血管生成，模擬wAMD的標(biāo)志性病理。這種方法相對容易創(chuàng)建，并且表現(xiàn)出與人類相似的病理結(jié)果。本實驗擬通過532 nm激光誘導(dǎo)棕色挪威（brown Norway，BN）大鼠（Rattus norvegicus）CNV模擬wAMD的發(fā)病過程，通過體內(nèi)眼底照相、光學(xué)相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）、眼底熒光血管造影（fundus fluorescence angiography，F(xiàn)FA）、吲哚菁綠血管造影（indocyanine green angiography，ICGA）及體外組織病理學(xué)特性研究觀察CNV隨時間推移的形態(tài)學(xué)變異程度，進(jìn)一步驗證并評估該模型建立的可行性與穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用6～8周齡的BN大鼠30只，雌雄各半，每只體重約190～210 g，全部購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。動物許可證號：SCXK（京）2021-0011。動物實驗設(shè)施許可證號：SYXK（閩）2019-0007。所有動物被飼養(yǎng)在（22±2）℃的房間中，進(jìn)行12 h的明/暗循環(huán)，可以自由獲得水和食物。涉及動物的研究都按照涉及動物實驗的報告指南（ARRIVE2.0指南）進(jìn)行報告。所有實驗動物都得到了依照實驗動物服務(wù)倫理法規(guī)和各項規(guī)定的人道關(guān)懷。本研究中動物飼養(yǎng)與實驗程序嚴(yán)格遵守實驗動物福利倫理相關(guān)法規(guī)和各項規(guī)定。本研究中描述的所有程序均得到了福建中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：FJTCMIACUC2022156）。

1.2 試劑與儀器

試劑：2%戊巴比妥鈉（湖北鴻運(yùn)隆生物科技有限公司）、4%多聚甲醛（金克隆北京生物技術(shù)有限公司）、美多麗復(fù)方托吡卡胺滴眼液［參天制藥（中國）有限公司］、卡波姆凝膠（山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司）、吲哚菁綠（丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責(zé)任公司）、熒光素鈉（廣州白云山明興制藥有限公司）。

儀器：多波段眼底激光治療儀532 nm激光機(jī)（雙子星Viridis-twin，法國光太公司）、眼底血管造影儀（Spectralis HRA，德國海德堡公司）、視網(wǎng)膜光學(xué)相干斷層掃描儀（Cirrus HD OCT，德國蔡司公司）、眼科免散瞳眼底攝像儀（VISUCAM PRONM，德國蔡司公司）、前置鏡（美國Volk公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及CNV模型的建立

將大鼠隨機(jī)分為5組（包括正常組、7天組、14天組、21天組、28天組）。大鼠全身麻醉，采用2%戊巴比妥鈉注射液（4.0～5.0 mg/100 g）進(jìn)行腹腔注射，局部美多麗滴眼液頻點(diǎn)散瞳。等待大鼠瞳孔散開、完全麻醉后，前置鏡涂抹適量卡波姆凝膠，手持前置鏡經(jīng)裂隙燈對大鼠眼底進(jìn)行激光光凝［位置在兩根血管之間，距視盤1～2視盤直徑（papillary diameter，PD），光斑直徑為50 μm，能量為280～320 mW，激光時間為100 ms］。以觀察到眼底激光光凝處有氣泡產(chǎn)生或伴有輕度出血為Bruch膜破裂的標(biāo)志，以此為度，每只大鼠共光凝16～25個點(diǎn)不等。

1.3.2 眼底照相與OCT

眼底彩照是通過眼底照相機(jī)直接獲取眼底彩色照片的方法。OCT利用眼內(nèi)不同組織對入射光束的反射性不同，根據(jù)不同角度的線性掃描顯示組織的斷面結(jié)構(gòu)。按照1.3.1的方式進(jìn)行麻醉和散瞳，并分別于光凝后即刻、第7天、第14天、第21天、第28天行眼底照相和OCT檢查。應(yīng)用德國蔡司視網(wǎng)膜光學(xué)相干斷層掃描儀對大鼠CNV的病灶區(qū)域進(jìn)行線性掃描。

1.3.3 FFA/ICGA

根據(jù)熒光染料的不同，眼底血管造影分為FFA和ICGA兩種。FFA主要反映視網(wǎng)膜血管及RPE屏障的異常，而ICGA可以更好地評價脈絡(luò)膜血管的情況。完成1.3.2步驟后，用2 mL滅菌注射用水溶解25 mg吲哚菁綠，使用5 mL注射器，按照體積比1：1抽取熒光素鈉和吲哚菁綠注射液，按照大鼠體重每100 g 0.05～0.10 mL的注射用量進(jìn)行尾靜脈注射。充分暴露大鼠眼球于眼底血管造影儀器前，保持眼球表面滋潤，同時進(jìn)行FFA與ICGA檢查。參考Ashikari等［7］的方法，F(xiàn)FA滲漏分級如下：0級無滲漏表示無滲漏，微弱強(qiáng)熒光，或斑駁熒光無滲漏；1級可疑滲漏表示大小或強(qiáng)度無進(jìn)行性增加的強(qiáng)熒光病變；2級滲漏表示強(qiáng)熒光強(qiáng)度增加，但大小不變，無明確滲漏；3級病理上顯著滲漏表示過度熒光的強(qiáng)度和大小增加，有明確的滲漏（圖1）。CNV發(fā)生率=3級滲漏點(diǎn)/總激光點(diǎn)數(shù)。熒光滲漏面積采用Image J 2.1.0圖像分析系統(tǒng)對造影中晚期5 min之后的圖像的滲漏面積進(jìn)行測量。

1.3.4 HE染色

大鼠激光光凝行FFA/ICGA，每組各取BN大鼠2只。采用2%戊巴比妥鈉麻醉后，進(jìn)行頸椎脫臼法處死，立即摘取眼球，用眼科顯微鑷與組織剪沿角鞏膜緣去除眼前節(jié)，留下視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體；多聚甲醛固定24 h后，用常規(guī)梯度酒精固定脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，沿著視網(wǎng)膜近赤道部矢狀面平行于視神經(jīng)的方向連續(xù)切片，厚約4 μm；切片后水浴數(shù)秒，用載玻片將組織固定于載玻片上，于低倍顯微鏡下觀察，尋找有明確激光斑的玻片；用蘇木素和1%伊紅染色，二甲苯脫水透明，中性樹膠封片，光鏡放大200倍觀察CNV的形態(tài)，測量RPE到視網(wǎng)膜內(nèi)最高點(diǎn)的距離，即CNV的中央厚度。

1.4 統(tǒng)計方法

用Image J 2.1.0軟件對CNV的厚度及熒光滲漏面積進(jìn)行測量，所得數(shù)據(jù)利用Graphpad Prism9.0.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析及作圖，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）來表示。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)行參數(shù)檢驗，同時根據(jù)方差齊性檢驗判斷，若方差齊，選取one-way ANOVA，反之則選取Welch ANOVA；如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布則進(jìn)行Kruskal-Waills test。

2 結(jié)果與分析

2.1 體內(nèi)評估

2.1.1 眼底彩照

532 nm激光光凝BN大鼠，以中央有氣泡產(chǎn)生或伴有輕響（表明Bruch膜被擊破）視為有效光斑，激光過程中可伴有少量出血。造模完成后，于光凝后即刻、第7天、第14天、第21天、第28天全麻下行眼底照相，結(jié)果如下所示（圖2）。

如圖2所示：正常大鼠眼底視盤呈橢圓形，色橘紅，視網(wǎng)膜血管分布均勻，視網(wǎng)膜中央動脈位置深，管徑細(xì)，視網(wǎng)膜中央靜脈位置淺，管徑粗，動靜脈管徑比約為2：3；激光造模后即刻可見視網(wǎng)膜急性水腫，光斑處呈白堊樣改變，光斑彌散部分融合成片，邊界不清，少量光斑出現(xiàn)視網(wǎng)膜下出血；第7天可見視網(wǎng)膜水腫較之前減輕，光斑大小局限，部分光斑出現(xiàn)瘢痕組織外觀；光凝后第14天，視盤周邊水腫消退，光凝部位瘢痕化持續(xù)發(fā)展，呈黃白色；光凝后第21天，光凝部位呈典型黃白色瘢痕，中央見色素沉著；光凝后第28天的眼底情況與之前大致相同，無明顯改變。

2.1.2 FFA/ICGA

大鼠造模前、光凝后第7天、第14天、第21天、第28天于全麻下同步進(jìn)行FFA/ICGA，依據(jù)熒光滲漏分級方法，觀察并記錄各級熒光滲漏點(diǎn)數(shù)，計算CNV發(fā)生率，并使用Image J 2.1.0計算熒光滲漏面積，具體結(jié)果如下（圖3）。

圖3a1～3a3為正常大鼠的FFA/ICGA眼底成像。圖3a1為造影早期，F(xiàn)FA顯示視網(wǎng)膜管徑大小均勻，管壁完整，管腔內(nèi)熒光素充盈，呈放射狀分布，無熒光滲漏及熒光遮蔽。此時期表現(xiàn)為視網(wǎng)膜動靜脈開始充盈，亦可見脈絡(luò)膜血管網(wǎng)充盈并融合成彌漫的背景熒光；ICGA無灌注呈低熒光。圖3a2為造影中期，F(xiàn)FA/ICGA均可見動靜脈高熒光充盈，ICGA脈絡(luò)膜背景熒光明顯。圖3a3為造影晚期，F(xiàn)FA/ICGA均表現(xiàn)為視網(wǎng)膜血管高熒光減退，脈絡(luò)膜背景熒光基本消失。圖3b1～3b3為造模后第7天BN大鼠的眼底血管成像。圖3b1為造影早期，F(xiàn)FA表現(xiàn)為光凝區(qū)圓盤狀強(qiáng)熒光滲漏，ICGA示光凝區(qū)無灌注，呈弱花環(huán)狀高熒光。圖3b2為造影中期，F(xiàn)FA表現(xiàn)為圓盤樣強(qiáng)熒光增強(qiáng)，邊界不清，ICGA顯示花環(huán)狀高熒光逐漸增強(qiáng)，邊緣模糊不清；圖3b3為造影晚期，F(xiàn)FA表現(xiàn)為圓盤樣高熒光逐漸減弱，ICGA顯示光凝區(qū)花環(huán)狀高熒光進(jìn)一步增強(qiáng)，標(biāo)志CNV開始形成。圖3c1～3c3為造模后第14天BN大鼠的眼底血管成像。圖3c1為造影早期，F(xiàn)FA表現(xiàn)為光凝區(qū)圓盤狀強(qiáng)熒光滲漏，ICGA示光凝區(qū)周邊強(qiáng)熒光，中央低熒光，呈花環(huán)狀形態(tài)。圖3c2為造影中期，熒光滲漏較第7天時明顯。圖3c3為造影晚期，熒光持續(xù)滲漏。圖3d1～3d3為造模后第21天BN大鼠的眼底血管成像，可見造影早、中、晚期熒光滲漏明顯，邊緣模糊，范圍擴(kuò)大，持續(xù)強(qiáng)熒光滲漏。圖3e1～3e3為造模后第28天BN大鼠的眼底血管成像，熒光滲漏范圍較之前局限，情況大致與光凝后第21天類似。

對上述結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩名實驗以外的工作者基于FFA滲漏分級方法對造影結(jié)果進(jìn)行閱片，記錄下各級光斑的點(diǎn)數(shù)及熒光滲漏面積（圖4a），結(jié)果顯示：光凝后第7天、第14天、第21天、第28天CNV總的發(fā)生率分別為4.43%、26.04%、58.42%、40.78%，其中光凝第21天時CNV發(fā)生率最高，與第7天、第14天相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但是與第28天比較無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4b）；不同時間點(diǎn)的熒光滲漏面積分別為（1.47±0.26）、（3.55±0.44）、（11.54±0.48）、（11.17±0.29）PD，其中可見第28天滲漏面積最大，與第7天、第14天相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但是與第21天相比較無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4c）。

2.1.3 OCT

大鼠激光造模完成后，于光凝后即刻、第7天、第14天、第21天、第28天全麻下行OCT檢查，結(jié)果如下所示（圖5）。

圖5a顯示了OCT的不同切面。掃描結(jié)果如圖5b～5f所見。圖5b為光凝后即刻行OCT的圖像，病灶中心在眼底重建，被視為低反射區(qū)。OCT顯示，激光應(yīng)用不久后視網(wǎng)膜下產(chǎn)生氣泡，可作為Bruch膜破裂的標(biāo)志（紅色箭頭）。圖5c為光凝后第7天，激光斑周圍視網(wǎng)膜色素上皮層離斷，周邊呈現(xiàn)新生血管性高反射團(tuán)塊，視網(wǎng)膜高反射率獲得了獨(dú)特的蝴蝶樣形狀（黑色箭頭）。光凝后第14天，OCT掃描示光凝區(qū)視網(wǎng)膜色素上皮脫離，可見少數(shù)神經(jīng)上皮淺脫離，光凝斑局部增厚、隆起，出現(xiàn)團(tuán)塊狀不規(guī)則高反射病灶（圖5d黃色箭頭）。光凝后第21天，激光斑處視網(wǎng)膜增厚，光斑周圍視網(wǎng)膜相對變薄，視網(wǎng)膜下腔可見不規(guī)則多層次的高反射病灶，邊界不清，其病灶范圍較第14天時擴(kuò)大（圖5e黃色箭頭）。光凝后第28天可見視網(wǎng)膜色素上皮層/Bruch膜復(fù)合體明顯增厚，向視網(wǎng)膜內(nèi)層隆起，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)紊亂，范圍局限，邊界清晰（圖5f黃箭頭）。

2.2 體外評估

正常大鼠的視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰、完整（圖6a）。激光光凝后第7天，視網(wǎng)膜水腫、隆起，Bruch膜和RPE層被破壞，增殖細(xì)胞自脈絡(luò)膜向視網(wǎng)膜內(nèi)層生長，早期CNV開始形成（圖6b）。光凝后第14天，視網(wǎng)膜水腫逐漸消退，CNV增殖，Bruch膜和RPE層連續(xù)被破壞，遷移增殖的RPE細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞形成新生血管腔（圖6c）；隨時間推移，光凝后第21天 CNV進(jìn)一步增殖，CNV中央厚度達(dá)到最大（圖6d）。至第28天，CNV逐漸保持穩(wěn)定（圖6e）。光凝后第7天、第14天、第21天、第28天的CNV中央厚度見表1，各組間相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=54.854，P<0.05）。光凝后第14天、第21天、第28天與第7天相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；第28天與第21天相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.354>0.05）。

3 討論

理想的CNV實驗?zāi)Ｐ捅仨毞€(wěn)定、高效、可復(fù)制，并表現(xiàn)出與人類CNV病變相似的病理特征。激光誘導(dǎo)的CNV模型是最廣泛應(yīng)用的模型之一，該過程誘導(dǎo)血管生成，形成新生血管性AMD的標(biāo)志性病理模型。激光誘導(dǎo)的CNV模型發(fā)展和建立較快，采用激光光凝損傷視網(wǎng)膜外膜，破壞Bruch膜，形成浸潤視網(wǎng)膜下間隙的CNV。人類最初認(rèn)識到CNV是從人類尸體的眼中發(fā)現(xiàn)的，然而人類標(biāo)本不易獲取，因此，實驗受到了極大的限制。1979年，由Ryan等［8］創(chuàng)建的第一個CNV模型是實驗性靈長類模型，當(dāng)時被稱為“視網(wǎng)膜下新生血管化”。受他們的啟發(fā)，Dobi等［9］于1989年建立了CNV大鼠模型。自此，人們對CNV動物模型開展了廣泛的研究。

盡管近年來CNV的治療方法有所改進(jìn)，但其確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）藥物徹底改變了CNV的治療，然而，許多患者對抗VEGF的反應(yīng)不完全［10］。目前抗VEGF藥物的治療效果不穩(wěn)定，需要每月重復(fù)注射，所以患者整體依從性不高，且頻繁的眼內(nèi)注射增加了副作用的累積風(fēng)險。因此，仍然需要一個臨床前模型更準(zhǔn)確地再現(xiàn)疾病的組織和功能變化［11］。本實驗采用532 nm激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV形成來模擬wAMD的發(fā)病過程。BN大鼠的脈絡(luò)膜組織與人脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)相似，含有大量色素細(xì)胞，可吸收大量光能量，故選用其作為模型動物［12］。其中，532 nm綠激光主要經(jīng)玻璃體和視網(wǎng)膜到達(dá)光感受器的外界層面反射回去，它對葉黃素基本不吸收，而主要吸收黑色素，因而對于RPE細(xì)胞和脈絡(luò)膜細(xì)胞的吸收是有益的［13］。實驗中使用的激光參數(shù)為光斑直徑50 μm，能量280～320 mW，激光時間100 ms。實驗中我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)能量過高時容易發(fā)生視網(wǎng)膜出血，低能量又不易打破Bruch膜，無法產(chǎn)生氣泡。既往研究者們在進(jìn)行動物造模時，采用了不同波長的激光和不同參數(shù)功率，成模效果各異。Dobi等［9］最早使用647 nm氪激光來建立大鼠CNV模型（功率為50～160 mW，光凝斑直徑為100 μm，曝光時間為0.1 s）。實驗中他們發(fā)現(xiàn)，能量低于120 mW時不易產(chǎn)生氣泡，最后在120 mW損傷病灶中觀察到熒光滲漏率為28%。隨后，國內(nèi)研究者在上述基礎(chǔ)上進(jìn)行波長和激光參數(shù)的改良。趙世紅等［14］用647 nm氪激光（功率為360 mW，光凝斑直徑為50 μm，曝光時間為0.05 s）創(chuàng)建BN大鼠CNV模型，熒光滲漏率高達(dá)76.0%。張舒陽等［15］研究了不同功率532 nm激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，300 mW的成模率最高，是較為理想的激光功率。由此可見，不同的波長和激光參數(shù)會產(chǎn)生不同的效果。

在實驗眼科中，組織學(xué)仍然是視網(wǎng)膜病理研究的金標(biāo)準(zhǔn)［16］，而眼底成像技術(shù)的使用可以提供視網(wǎng)膜在體內(nèi)和縱向的病理生理信息。在該研究中，我們評估了不同的體內(nèi)成像方式，包括眼底照相、OCT和FFA/ICGA，與體外組織學(xué)結(jié)果相比較，動靜結(jié)合，從橫向和縱向研究CNV形態(tài)變異性。本實驗研究結(jié)果顯示：光凝后即刻，視網(wǎng)膜下產(chǎn)生氣泡，伴有周邊水腫；第7～14天，CNV逐漸開始形成；直至第21天，CNV形成達(dá)到高峰，CNV發(fā)生率（3級熒光滲漏光斑數(shù)/總光斑數(shù)）達(dá)58.42%；隨時間推移，到第28天，CNV逐漸趨于穩(wěn)定，少量形成纖維瘢痕化。這與廖華萍等［17］的報道結(jié)果相符合。然而，Giani等［2］應(yīng)用532 nm激光誘導(dǎo)大鼠CNV模型時發(fā)現(xiàn)，CNV在第5天達(dá)到最大規(guī)模，到第7天開始下降，持續(xù)到第28天。王洵等［18］在造模過程中發(fā)現(xiàn)，光凝后第7天，CNV開始形成，到第14天時已大量形成。這些研究結(jié)果的不同可能與實驗過程中設(shè)置的不同激光參數(shù)以及觀察的時間點(diǎn)有關(guān)。

本實驗成功利用532 nm激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV模型，并通過體內(nèi)眼底成像技術(shù)和體外病理組織學(xué)評估了CNV的形態(tài)變異性。該模型成模率高，省時，具有高度可重復(fù)性且相對容易操作。然而，作為一種急性損傷模型，它并不能完全概括AMD的衰老方面，且老鼠的眼球較小，眼底缺少黃斑，這也是動物模型的局限性［19］。雖然此模型與AMD的發(fā)生機(jī)制不完全相同，但在CNV形成的自然過程中是相同的。此模型作為基礎(chǔ)應(yīng)用實驗和人類臨床實驗的中間步驟，是一個重要的科研實驗?zāi)Ｐ停哂休^高的實用價值。

綜上所述，該研究從體內(nèi)外評估了CNV形態(tài)變異性的發(fā)生發(fā)展過程。該模型的成功建立為我們進(jìn)一步研究CNV的發(fā)病機(jī)制及評價藥物對wAMD的作用療效奠定了基礎(chǔ)。

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