吳婷 王馳 韓艷紅

摘 要：磷酸化是真核細(xì)胞中常見(jiàn)的一種翻譯后修飾方式，它對(duì)生物體內(nèi)多種代謝活動(dòng)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程起著調(diào)控作用。植物病毒蛋白通過(guò)磷酸化和去磷酸化修飾調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物活性，從而影響細(xì)胞內(nèi)的生物信號(hào)傳遞。磷酸化修飾的植物病毒蛋白參與調(diào)控病毒的侵染、病毒RNA的合成、病毒的RNA沉默以及調(diào)控宿主基因的表達(dá)。近年來(lái)，植物病毒蛋白磷酸化的分子機(jī)制得到了廣泛和深入的研究。本文總結(jié)了植物病毒蛋白磷酸化修飾的位點(diǎn)、磷酸化鑒定方法及其生物學(xué)功能，為磷酸化在植物和病毒相互作用中的生物學(xué)功能提供了參考。

關(guān)鍵詞：植物病毒蛋白；磷酸化；蛋白激酶；病毒侵染；翻譯后修飾

中圖分類號(hào)：Q291 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.04.003

Advances in Phosphorylation of Plant Virus Proteins

WU Tinga#， WANG Chib#， HAN Yanhongb*

（Fujian Agriculture and Forestry University a. College of Life Sciences; b. Vector Virus Research Center， College of Plant Protection， Fuzhou 350002， China）

Abstract： Phosphorylation， a widespread post-translational modification observed in eukaryotic cells， plays a crucial role in regulating various metabolic activities and cell signal transduction processes. In organisms， plant viral proteins have the ability to modulate the biological activity of proteins through phosphorylation and dephosphorylation modifications， thereby controlling the transmission of biological signals within cells. The phosphorylation-modified plant viral proteins actively participate in regulating viral infection， viral RNA synthesis， RNA silencing and host gene expression. In recent years， extensive research has been conducted to unravel the molecular mechanisms underlying the phosphorylation of plant virus proteins. This article provides an overview of phosphorylation modification sites， methods for identifying phosphorylation， and the biological functions of plant viral proteins， aiming to offer valuable insights into the role of phosphorylation in plant-virus interactions.

Key words： plant viral proteins; phosphorylation; protein kinases; viral infection; posttranslational modification

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（4）： 304-311）

植物病毒蛋白的磷酸化是一種翻譯后修飾，具有高效性和可逆性，對(duì)目標(biāo)蛋白的功能也有重要的調(diào)節(jié)作用。翻譯后修飾主要包括磷酸化［1］、糖基化［2］、泛素化［3］、乙?；?］等，其中磷酸化是最常見(jiàn)且研究最深入的修飾方式。磷酸化通常通過(guò)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化作為分子內(nèi)或分子間蛋白質(zhì)相互作用的對(duì)接部位，調(diào)節(jié)病毒蛋白的活性、亞細(xì)胞定位以及與胞內(nèi)蛋白的相互作用。激酶的磷酸化和磷酸酶的去磷酸化是高效的分子調(diào)節(jié)劑，可直接或間接地改變病毒的積累量。磷酸化的調(diào)節(jié)功能參與植物病毒生活史的多個(gè)步驟，包括蛋白質(zhì)翻譯［5］、病毒基因組材料的合成［6］、病毒的細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)［7］、病毒粒子組裝［8］等。此外，對(duì)于所研究的不同種植物病毒，磷酸化病毒蛋白的生物學(xué)功能是獨(dú)立且不同的。因此，總結(jié)植物病毒蛋白磷酸化修飾位點(diǎn)、鑒定方法和植物病毒蛋白磷酸化的生物學(xué)功能，對(duì)深入了解病毒蛋白在侵染過(guò)程中的多種功能有重要意義。本文總結(jié)了部分發(fā)生磷酸化修飾的植物病毒蛋白磷酸化位點(diǎn)、病毒磷酸化檢測(cè)方法及磷酸化病毒蛋白的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步研究植物病毒蛋白磷酸化的分子機(jī)制和病毒防治提供參考。

1 植物病毒蛋白的磷酸化修飾位點(diǎn)

病毒蛋白磷酸化修飾主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸殘基上。宿主蛋白激酶和病毒自身的蛋白激酶通常通過(guò)磷酸化病毒蛋白來(lái)調(diào)節(jié)病毒的侵染性和致病性。在單鏈DNA病毒中，番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）的βC1蛋白是一個(gè)致病因子。番茄蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白1激酶［Solanum lycopersicum sucrose-nonfermenting-1（SNF1）-related kinase，SlSnRK1］主要在第33位絲氨酸和第78位蘇氨酸上對(duì)βC1進(jìn)行磷酸化。用丙氨酸替代βC1的S33和T78磷酸化位點(diǎn)，模擬去磷酸化狀態(tài)下的βC1，突變體植株體內(nèi)積累的病毒DNA水平升高。用天冬氨酸替代βC1蛋白的第33位絲氨酸和第78位蘇氨酸，模擬持續(xù)磷酸化狀態(tài)下的βC1蛋白，突變體植株表現(xiàn)出延遲和緩解的癥狀，病毒DNA的積累降低［9］。這些結(jié)果表明，SlSnRK1蛋白是通過(guò)與βC1蛋白相互作用發(fā)生磷酸化來(lái)減輕病毒的侵染的。在雙鏈DNA病毒中，花椰菜花葉病毒（cauliflower mosaic virus，CaMV）的外殼蛋白（coat protein，CP）CP44、CP39、CP37是由外殼蛋白前體加工而來(lái)的。其中，CP44可被酪蛋白激酶I（casein kinase I，CK1）磷酸化，磷酸化位點(diǎn)為絲氨酸殘基S82、S86和S88。CP44蛋白磷酸化位點(diǎn)的突變可以消除CaMV的侵染性［10］。在單鏈正義RNA病毒中，大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus，BSMV）γb蛋白在體內(nèi)和體外都可以發(fā)生磷酸化。本氏煙體內(nèi)的STY蛋白激酶46［Nicotiana benthamiana the autophosphorylated cytosolic serine/threonine/tyrosine（STY）protein kinase 46，NbSTY46］是一種PKA樣激酶，可以直接與γb的堿性基序結(jié)構(gòu)域相互作用。野生型NbSTY46的過(guò)表達(dá)可抑制BSMV的復(fù)制并減輕病毒癥狀，而沉默NbSTY46會(huì)促進(jìn)病毒復(fù)制且加重病毒癥狀。此外，NbSTY46的抗病毒作用需要它的激酶活性，因?yàn)镹bSTY46T436A突變體缺乏激酶活性，不僅失去了與γb相互作用和磷酸化的能力，而且在植物中表達(dá)時(shí)也無(wú)法減輕BSMV的侵染［11］。在單鏈負(fù)義RNA病毒中，水稻條紋病毒（rice stripe virus，RSV）是影響水稻生產(chǎn)的最具破壞性的病毒病之一。類固醇（brassinosteroids，BR）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）在響應(yīng)各種逆境中起著關(guān)鍵作用，增加BR和JA的水平或信號(hào)可以增強(qiáng)水稻對(duì)RSV的抗性。RSV侵染抑制了BR信號(hào)通路，增加了水稻糖原合成激酶2（Oryza sativa Glycogen synthase kinase-2，OsGSK2）的積累。OsGSK2可使水稻髓細(xì)胞組織增生蛋白類轉(zhuǎn)錄因子2（Oryza sativa myelocytomatosis proteins 2，OsMYC2）磷酸化并使其降解，抑制JA介導(dǎo)的RSV抗性反應(yīng)，促進(jìn)病毒侵染［12］。在雙鏈RNA病毒中，水稻黑條矮縮病毒（rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）的P10蛋白可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)。RBSDV的P10蛋白與AMP依賴的蛋白激酶（amp-activated protein kinase，AMPK）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）相互作用，促進(jìn)蛋白激酶AMPK和GAPDH的磷酸化。磷酸化的GAPDH定位到細(xì)胞核內(nèi)，激活自噬途徑［13］。由此可見(jiàn)，在植物病毒蛋白中普遍存在磷酸化修飾現(xiàn)象，且參與調(diào)控病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制、增殖等生理過(guò)程（圖1）。

2 常見(jiàn)的調(diào)控植物病毒蛋白磷酸化的激酶

蛋白質(zhì)磷酸化是一種可逆的翻譯后修飾，其中蛋白激酶（protein kinase，PK）將供體ATP的γ磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體蛋白側(cè)鏈上，而蛋白磷酸酶（protein phosphatase，PP）則使磷酸化蛋白去磷酸化［14］。磷酸化和去磷酸化參與調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和衰老等生物學(xué)過(guò)程，如植物的生物和非生物脅迫、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)和物質(zhì)代謝等。不同的激酶常在靶蛋白中介導(dǎo)不同類型的磷酸化，幾種常見(jiàn)的使植物病毒蛋白磷酸化的激酶總結(jié)如下。

2.1 酪蛋白激酶家族

酪蛋白激酶I家族是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，從酵母（Saccharomyces cerevisiae）到人類都高度保守?，F(xiàn)有的研究結(jié)果顯示，它們參與了激素調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)變化、DNA修復(fù)和胞質(zhì)分裂等多種生理過(guò)程［15］。目前對(duì)CK1的研究在動(dòng)物和酵母中較多，在植物中的研究較少。不過(guò)，現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，CK1對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育也有重要的影響。從煙草（Nicotiana tabacum）中分離到的胞間連絲相關(guān)蛋白（plasmodesmal-associated protein kinase，PAPK）是酪蛋白激酶I家族的成員，可以特異性地磷酸化煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）運(yùn)動(dòng)蛋白的羧基末端殘基，并且可能在植物細(xì)胞之間的大分子運(yùn)輸中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［16］。大麥黃條點(diǎn)花葉病毒（barley yellow striate mosaic virus，BYSMV）是一種侵染糧食作物的植物細(xì)胞鏈球病毒，主要由灰飛虱（Laodelphax striatellus）傳播。BYSMV的P蛋白在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中以兩種不同的形式存在，分別為P42和P44。來(lái)自植物和昆蟲(chóng)載體的CK1蛋白激酶可以磷酸化大麥黃條花葉病毒的P蛋白，并誘導(dǎo)病毒從復(fù)制到轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)變。磷酸化的P44形式可促進(jìn)病毒轉(zhuǎn)錄，而非磷酸化的P42形式可促進(jìn)病毒復(fù)制［17］。

酪蛋白激酶Ⅱ（casein kinase Ⅱ，CK2）可磷酸化多種植物病毒蛋白，在病毒侵染調(diào)控和寄主防御中發(fā)揮重要作用。CK2的α催化亞基和β調(diào)節(jié)亞基在真核細(xì)胞中既以四聚體全酶的形式存在，也以單體的形式存在［18］。CK2的高度多效性以及多種異構(gòu)體的存在，使得獲得功能完全喪失的突變體來(lái)研究CK2在生物體中的影響變得困難［19］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，有兩種策略被用來(lái)研究CK2α亞基的作用：創(chuàng)造更高順序的敲除突變體和產(chǎn)生顯性的負(fù)向轉(zhuǎn)基因植株［20］。研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯A病毒（potato virus A，PVA）的CP蛋白在侵染植物時(shí)會(huì)發(fā)生磷酸化，體外試驗(yàn)也驗(yàn)證了這一現(xiàn)象，使用凝膠內(nèi)激酶分析和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀技術(shù)鑒定到CK2為其激酶，CK2主要磷酸化CP蛋白的第242位蘇氨酸，影響CP蛋白與RNA的結(jié)合以及病毒在細(xì)胞間的長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)［21］。

2.2 蛋白激酶A和蛋白激酶C

PKA激酶家族可以催化三磷酸腺苷的γ磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)底物上的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上進(jìn)行磷酸化。該酶由兩個(gè)催化亞基（catalytic subunit，C）和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基（regulatory subunit，R）組成一個(gè)四聚體全酶R2C2［22］。PKA參與調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、糖原和脂類代謝［23］。BSMV基因組包含RNAα、RNAβ和RNAγ三條鏈，其中RNAγ編碼的γb蛋白是一種多功能蛋白，磷酸化修飾位點(diǎn)為S96，可被PKA樣激酶磷酸化。非磷酸化的突變病毒BSMVS96A或BSMVS96R可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡反應(yīng)，將病毒限制在壞死區(qū)，從而減少病毒在本氏煙草中的積累。S96A突變體還降低了其與21nt dsRNA的結(jié)合活性，從而減弱了局部和系統(tǒng)的病毒沉默反應(yīng)。因此，PKA介導(dǎo)的γb蛋白磷酸化可以抑制RNA沉默和宿主細(xì)胞的死亡反應(yīng)。植物病毒學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，PKA樣蛋白在植物中是普遍存在的，它可以磷酸化植物病毒蛋白，并調(diào)節(jié)其在病毒生命周期中的功能［24］。

PKC也是一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸激酶，由氨基端調(diào)節(jié)區(qū)（約20～40 kD）和羧基端催化區(qū)（約45 kD）組成［25］。PKC參與多種信號(hào)通路，可以使絲氨酸/蘇氨酸殘基的底物磷酸化，對(duì)細(xì)胞增殖和基因表達(dá)有重要的調(diào)節(jié)作用［26］。黃瓜壞死病毒（cucumber necrosis virus，CNV）正鏈RNA的復(fù)制需要兩個(gè)病毒編碼的重疊的復(fù)制蛋白P33和P92，蛋白激酶C可以使P33蛋白中靠近RNA結(jié)合位點(diǎn)的蘇氨酸/絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化，對(duì)病毒RNA復(fù)制和亞基因組RNA合成起著重要的調(diào)節(jié)作用［27］。

3 常用的植物病毒蛋白磷酸化鑒定方法

3.1 植物病毒蛋白的放射性同位素32P體外標(biāo)記

在激酶催化下，作為能源的放射性同位素32P標(biāo)記的三磷酸腺苷（γ-磷酸基團(tuán)）通過(guò)激酶轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)上［28］。體外磷酸化反應(yīng)完成后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離反應(yīng)混合物中的蛋白［29］。抽干凝膠后，用X-光片放射自顯影或用磷儲(chǔ)屏檢測(cè)磷酸化蛋白。該方法具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于植物病毒蛋白磷酸化的鑒定中，是目前最直接的體外蛋白質(zhì)磷酸化檢測(cè)方法。但放射性同位素有輻照傷害，安全性低，易產(chǎn)生環(huán)境污染，需復(fù)雜的放化設(shè)備及防輻射防護(hù)措施。

3.2 Phos-TagTM gel電泳-免疫印跡相結(jié)合檢測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化方法

Phos-TagTM試劑在與Mn2+或Zn2+結(jié)合后，可以特異性地與磷酸化蛋白質(zhì)上的磷酸基團(tuán)結(jié)合，形成相對(duì)穩(wěn)定的化合物［28］。當(dāng)在常規(guī)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中加入Mn2+或Zn2+和Phos-TagTM時(shí)，磷酸化的蛋白質(zhì)與Phos-TagTM結(jié)合，形成比未磷酸化的蛋白質(zhì)更大的復(fù)合體，電泳時(shí)，磷酸化蛋白質(zhì)在凝膠中的電泳遷移率降低［30］。因此，Phos-TagTM試劑可以將磷酸化的蛋白質(zhì)與非磷酸化的蛋白質(zhì)特異性地分離。如果反應(yīng)體系中磷酸化蛋白的含量少，在電泳結(jié)束后，通常用特異性抗體進(jìn)行免疫印跡分析，以區(qū)分磷酸化及非磷酸化蛋白。

3.3 蛋白質(zhì)印跡法鑒定磷酸化植物病毒蛋白

蛋白質(zhì)印跡是由Taylor等［31］提出的。自1979年以來(lái)，該技術(shù)已成為實(shí)驗(yàn)室用于免疫檢測(cè)和確定復(fù)雜細(xì)胞勻漿中特定蛋白質(zhì)的常用方法，尤其是那些豐度較低的蛋白質(zhì)［32］。通過(guò)凝膠電泳法分離天然或變性的蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)結(jié)合膜上，最后通過(guò)特定的抗體檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)。盡管蛋白質(zhì)印跡技術(shù)是一種半定量且容易出錯(cuò)的技術(shù)，但是可以通過(guò)設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)方案、預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)特性和選擇特異性抗體，以確保該方法的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和特異性［33］。蛋白質(zhì)印跡分析相對(duì)容易進(jìn)行，并且沒(méi)有設(shè)備或位置限制。

4 磷酸化植物病毒蛋白的功能

越來(lái)越多的研究表明，植物病毒蛋白［包括CP蛋白、運(yùn)動(dòng)蛋白（movement protein，MP）、RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）和病毒RNA沉默抑制子（viral suppressors of RNA silencing，VSRs）］在病毒侵染過(guò)程中都發(fā)生了磷酸化。病毒蛋白的磷酸化狀態(tài)對(duì)于病毒在宿主植物中的穩(wěn)定侵染非常重要。在體內(nèi)，磷酸化可以調(diào)節(jié)復(fù)制酶大小亞基之間的相互作用、病毒基因組RNA或DNA催化復(fù)制酶合成的活性、病毒復(fù)制復(fù)合體的穩(wěn)定性、病毒蛋白與宿主因子的相互作用以及病毒蛋白與RNA或DNA的結(jié)合活性等［34］。磷酸化病毒蛋白的主要功能有：影響病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、調(diào)控病毒粒子的包裝、影響病毒的侵染性和致病能力。

4.1 影響病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄

蕪菁黃花葉病毒（turnip yellow mosaic virus，TYMV）是一個(gè)正鏈RNA病毒，正鏈RNA病毒基因組的復(fù)制依賴于包含病毒和宿主成分的復(fù)雜復(fù)制復(fù)合體的組裝［35］。它的ORF1編碼一個(gè)大小為206 kD的RdRp，在病毒RNA復(fù)制中起重要作用。在體內(nèi)，ORF1TYMV通過(guò)自身切割產(chǎn)生140 kD的p140蛋白和66 kD的p66蛋白。p66可以在植物中被磷酸化，并且通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)鑒定到了三個(gè)主要的磷酸化位點(diǎn)：T64、S80和S326。對(duì)這三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單突變和多突變，其中磷酸化雙突變體p66T64D/S80D和單個(gè)突變體p66S326A、p66S326D和p66S326T對(duì)病毒的侵染性有顯著影響，降低了病毒基因組RNA和CP蛋白的積累水平，并且影響病毒的侵染［36］。還有研究表明，p66的磷酸化并不影響其與p140的相互作用，但在病毒侵染周期中，p140和p66亞基之間的相互作用抑制了p66的磷酸化［37］。這些結(jié)果表明，p66的磷酸化是一個(gè)分子開(kāi)關(guān)，以自我優(yōu)化的方式調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制速度，平衡病毒與寄主植物之間的相互作用。在共同進(jìn)化方面，適當(dāng)?shù)牟《净蚪MRNA復(fù)制速度可以保證病毒能在宿主植物中長(zhǎng)期共存。

絲裂原活化蛋白激酶和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（evolutionarily conserved mitogen-activated protein kinase or extracellular signal-regulated kinase，MAPK-ERK）是高度保守的信號(hào)通路，可以將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞及其核內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡［38］。BYSMV的核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，NP）能與大麥絲裂原活化蛋白激酶（the barley evolutionarily conserved mitogen-activated protein kinase，HvMPK3）蛋白和灰飛虱胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（the planthopper extracellular signal-regulated kinase，LsERK）蛋白相互作用并被磷酸化，磷酸化位點(diǎn)是NP蛋白第290位絲氨酸。過(guò)表達(dá)的HvMPK3抑制了BYSMV的侵染，而用MAPK途徑抑制劑U0126處理后，大麥對(duì)BYSMV表現(xiàn)出更強(qiáng)的敏感性。此外，敲除LsERK基因可以促進(jìn)病毒侵染。NP蛋白的一個(gè)磷酸化突變體S290D可以完全消除病毒的侵染［39］。這些結(jié)果表明，保守的MAPK和ERK直接磷酸化病毒核衣殼蛋白，在寄主植物及其昆蟲(chóng)媒介中觸發(fā)對(duì)BYSMV跨域侵染的免疫。

4.2 調(diào)控病毒粒子的組裝

甜菜黑色焦枯病毒（beet black scorch virus，BBSV）于20世紀(jì)80年代末在中國(guó)北部首次被報(bào)道。BBSV是一種對(duì)稱的球狀病毒，屬于壞死病毒屬Necrovirus的一個(gè)新種［40-41］。BBSV的CP蛋白在體內(nèi)和體外都可以被PKA樣激酶磷酸化。CP蛋白的T41的非磷酸化狀態(tài)不影響病毒RNA復(fù)制的初始階段，但隨著病毒的侵染，病毒基因組RNA的積累會(huì)受到影響。由此推測(cè)，BBSV的CP蛋白磷酸化可能參與了基因組RNA復(fù)制的后期階段，有效地干擾了宿主的防御系統(tǒng)。CP蛋白第41位氨基酸T41A和T41E突變體在病毒侵染期間產(chǎn)生了不穩(wěn)定的17 nm病毒粒子，無(wú)法組裝病毒基因組RNA。因此，CP蛋白T41的磷酸化狀態(tài)可以調(diào)節(jié)植物中的病毒粒子的組裝，從而精細(xì)地調(diào)節(jié)植物中的BBSV侵染［42］。TMV的CP蛋白也有類似的功能。CPTMV蛋白的第148位絲氨酸可以發(fā)生磷酸化，在S148A突變體的情況下，提取的S148A突變體病毒粒子比野生型病毒粒子更穩(wěn)定［8］。

4.3 影響病毒的侵染性和致病能力

竹子花葉病毒（bamboo mosaic virus，BaMV）是一種正單鏈的RNA病毒，它的CP蛋白第241位氨基酸可以被CK2磷酸化。體外結(jié)合試驗(yàn)表明，突變株CPS241A的RNA結(jié)合能力沒(méi)有受到明顯的影響，但細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)能力降低。如果S241位突變?yōu)镈（CPS241D），其與RNA的結(jié)合能力會(huì)顯著減弱，且細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)能力會(huì)降低［7］。這些結(jié)果表明，煙草中的NbCK2通過(guò)磷酸化第241位絲氨酸來(lái)調(diào)節(jié)病毒CP蛋白與RNA的結(jié)合能力，進(jìn)而影響病毒細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)能力。

黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）的2b蛋白是一種VSRs，是CMV致病性的主要決定因素。在2b蛋白中發(fā)現(xiàn)，磷酸化位點(diǎn)S28可以影響2b蛋白的VSRs活性。S28突變?yōu)楸彼岷螅琕SR活性甚至比野生型2b蛋白更強(qiáng)。2b蛋白在細(xì)胞核中去磷酸化，并可能以非磷酸化的形式轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中。這些結(jié)果表明，2b蛋白在RNA沉默途徑中通過(guò)磷酸化和去磷酸化的平衡追蹤其靶點(diǎn)——小RNA和AGO蛋白，從而操縱其核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，發(fā)揮VSRs活性［43］。

馬鈴薯帚頂病毒（the potato mop-top virus，PMTV）編碼的三基因塊（triple - gene block，TGB）蛋白TGB1參與病毒核糖核蛋白復(fù)合體的形成和病毒粒子的長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)。通過(guò)對(duì)TGB1與寄主煙草蛋白相互作用的分析發(fā)現(xiàn)，TGB1與重金屬相關(guān)異戊二烯化植物蛋白家族（isoprenylated plant protein family，HIPP）的一個(gè)成員HIPP26相互作用，HIPP26在非生物脅迫期間充當(dāng)質(zhì)膜到細(xì)胞核的信號(hào)分子。下調(diào)HIPP26的表達(dá)抑制了病毒的長(zhǎng)距離移動(dòng)，但不影響其細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)。HIPP26與TGB1的共表達(dá)致使HIPP26在核中積累。這些數(shù)據(jù)支持一種機(jī)制，即與TGB1的相互作用減弱了HIPP26的磷酸化，從而釋放與膜相關(guān)的HIPP26，并通過(guò)微管將其定向移動(dòng)到細(xì)胞核，從而激活干旱脅迫反應(yīng)，促進(jìn)病毒的長(zhǎng)距離移動(dòng)［44］。

中國(guó)小麥花葉病毒（chinese wheat mosaic virus，CWMV）是一種具有兩個(gè)正向單鏈基因組的RNA病毒［45］。CWMV的富含半胱氨酸蛋白（cysteine-rich protein，CRP）有兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為S162和S165，能夠被小麥絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（the serine/threonine-protein kinase SAPK7，SAPK7）蛋白在體內(nèi)和體外磷酸化。突變分析表明，磷酸化突變病毒（CWMV-CRPS162D/165D）通過(guò)抑制細(xì)胞死亡和過(guò)氧化氫的產(chǎn)生增強(qiáng)了病毒在植物中的侵染性。此外，CWMV-CRPS162D/165D與小麥中的RNA結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白2C（RNA-binding protein UBP1-associated protein 2C，TaUBA2C）相互作用，而非磷酸化突變病毒（CWMV-CRPS162A/165A）不與之互作。TaUBA2C的沉默促進(jìn)了病毒對(duì)小麥的侵染，而TaUBA2C的過(guò)表達(dá)則抑制了病毒的侵染。這一作用可以被CWMV-CRPS162D/165D通過(guò)與TaUBA2C的結(jié)合而抑制，導(dǎo)致植物中TaUBA2C與RNA或DNA的結(jié)合活性減弱，促進(jìn)CWMV的侵染［46］。

5 總結(jié)與展望

磷酸化作為廣泛的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，參與了幾乎所有的植物生理過(guò)程，并在調(diào)節(jié)多種生物學(xué)活動(dòng)中發(fā)揮了重要作用，包括細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)的相互作用、染色質(zhì)組裝和亞細(xì)胞定位等過(guò)程。許多植物病毒進(jìn)化出了利用相關(guān)激酶的活性來(lái)啟動(dòng)自身基因組復(fù)制、逃避或中和宿主免疫反應(yīng)的能力。因此，深入了解植物病毒蛋白磷酸化的分子機(jī)制有助于建立高效精準(zhǔn)的病毒防治策略。

在真核生物中，靶蛋白的絲氨酸和蘇氨酸殘基上的側(cè)鏈羥基除了發(fā)生磷酸化外，還可能發(fā)生糖基化修飾。李痘病毒（plum pox virus，PPV）CP蛋白的絲氨酸殘基（S25、S81、S101和S118）被磷酸化的同時(shí)也會(huì)發(fā)生葡糖酰胺（O-linked β-N-acetylglucosamine，O-GlcNAc）修飾，阻止了病毒在桃樹(shù)上的侵染，并減弱了對(duì)煙草和其他草本植物寄主的侵染［5］。云南番茄曲葉病毒（tomato leaf curl Yunnan virus，TLCYnV）的C4蛋白可以與本氏煙中糖原合成酶激酶-3的同系物［a homolog of glycogen synthesis kinase-3（GSK3）in Nicotiana benthamiana，NbSKη］蛋白相互作用。TLCYnV的C4蛋白被細(xì)胞核中的NbSKη磷酸化，從而促進(jìn)病毒蛋白的肉豆蔻?；姿峄腿舛罐Ⅴ；腃4蛋白有利于其與核輸出蛋白1（exportin-α，XPO I）的相互作用，反過(guò)來(lái)又促進(jìn)C4/NbSKη復(fù)合體的核輸出，增強(qiáng)病毒的侵染能力，導(dǎo)致植物發(fā)育異常［50］。在侵染過(guò)程中，植物蛋白還能通過(guò)磷酸化病毒毒力蛋白增強(qiáng)抗病毒RNAi。研究發(fā)現(xiàn)，在大麥黃矮病毒（barley yellow dwarf virus，BYDV）的侵染過(guò)程中，17K蛋白是一個(gè)重要的毒力因子，它可以被宿主GRIK1-SnRK1激酶磷酸化，增加病毒衍生的小干擾RNA（virus-derived small interfering RNA，vsiRNAs）的豐度，從而增強(qiáng)抗病毒RNAi。磷酸化的17K蛋白與大麥小RNA降解核酸酶1（barley small RNA-degrading nuclease 1，HvSDN1）相互作用，能夠阻止HvSDN1催化的vsiRNA降解［51］。這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了一種新的機(jī)制，即宿主通過(guò)磷酸化病毒毒力蛋白來(lái)抑制HvSDN1催化的vsiRNA降解，從而增強(qiáng)抗病毒RNAi。這一發(fā)現(xiàn)也為培育抗黃矮病病毒的作物提供了新的途徑。

然而，關(guān)于關(guān)鍵物質(zhì)和蛋白激酶的特性，以及它們的磷酸化如何導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)特定刺激產(chǎn)生反應(yīng)我們?nèi)晕纯芍Ｒ欢ǖ幕蚪M大小決定了植物中有限數(shù)量的激酶和磷酸酶，并且在單個(gè)蛋白質(zhì)中存在多個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，這意味著激酶和磷酸酶的同工酶可能具有重疊的特性。在病毒侵染中，宿主激酶和病毒激酶及其下游靶標(biāo)分子可能成為預(yù)防病毒侵染的靶標(biāo)，可以根據(jù)靶標(biāo)蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)小分子激活劑或抑制劑，作為新型農(nóng)藥在田間噴灑作物葉片進(jìn)行病毒防治。

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