李毅 張恒 趙維彪

摘 要：為探究槲皮素對人軟骨肉瘤細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響及對Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄啟動因子3（JAK2/STAT3）信號通路的調(diào)控作用，體外培養(yǎng)人軟骨肉瘤SW-1353細(xì)胞，用不同濃度槲皮素干預(yù)SW-1353細(xì)胞24 h，細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）法篩選出最適濃度（50.0 μmol/L）槲皮素進(jìn)行后續(xù)試驗。將細(xì)胞分為對照組（不做干預(yù)）、槲皮素組（50.0 μmol/L槲皮素）、陽性藥物組（6.0 μmol/L阿霉素）、抑制劑組（50.0 μmol/L槲皮素＋50.0 μmol/L JAK2/STAT3通路抑制劑AG490）和激活劑組（50.0 μmol/L槲皮素＋0.5 μmol/L JAK2/STAT3通路激活劑colivelin），干預(yù)24 h后，用倒置顯微鏡、Transwell小室及Western blot法對細(xì)胞形態(tài)、遷移、侵襲及JAK2/STAT3通路和EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行分析。試驗結(jié)果顯示：CCK-8法確定槲皮素最適作用濃度為50.0 μmol/L；與對照組比較，槲皮素組和陽性藥物組細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纖連蛋白（FN）、p-JAK2和p-STAT3表達(dá)水平降低（P<0.05），E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)水平升高（P<0.05）；與槲皮素組相比，抑制劑組上述指標(biāo)變化趨勢更為顯著（P<0.05），激活劑組則扭轉(zhuǎn)了這些指標(biāo)的變化（P<0.05）。槲皮素可抑制人軟骨肉瘤SW-1353細(xì)胞的生長、遷移、侵襲和EMT進(jìn)程，其作用機(jī)制可能與阻滯JAK2/STAT3信號通路相關(guān)。

關(guān)鍵詞：軟骨肉瘤；槲皮素；JAK2/STAT3信號通路；遷移；侵襲

中圖分類號：Q811.4 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.03.007

Effect of Quercetin on Chondrosarcoma Cell Migration， Invasion and EMT by Blocking JAK2/STAT3 Signaling Pathway

LI Yi1， ZHANG Heng2， ZHAO Weibiao1*

（1. Department of Orthopedics， Liaoning Jinqiu Hospital， Shenyang 110016， China; 2. Department of Pathology， the First Affiliated Hospital of China Medical University， Shenyang 110001， China）

Abstract： To investigate the effects of quercetin on human chondrosarcoma cell migration， invasion and epithelial interstitial transformation （EMT） and the regulatory role of Janus kinase 2/signal transduction and transcription promoter 3 （JAK2/STAT3） signaling pathway， human chondrosarcoma SW-1353 cells were cultured in vitro and treated with quercetin of different concentrations for 24 h. The optimal concentration of quercetin （50.0 μmol/L） was selected by cell counting kit （CCK-8） for subsequent experiments. The cells were divided into control group with no intervention， quercetin group with 50.0 μmol/L quercetin， positive control group with 6.0 μmol/L adriamycin， inhibitor group involving 50.0 μmol/L quercetin +50.0 μmol/L JAK2/STAT3 pathway inhibitor AG490， and activator group involving 50.0 μmol/L quercetin +0.5 μmol/L JAK2/STAT3 pathway activator colivelin. After 24 h of intervention， cell morphology， migration， invasion， and expression levels of JAK2/STAT3 pathway and EMT-related proteins were analyzed by inverted microscope， Transwell chamber and Western blot. The experimental results showed that the optimum concentration of quercetin was determined by CCK-8 method to be 50.0 μmol/L. Compared with the control group， the growth of quercetin group were positive control group were inhibited， the cell migration number， invasion number， expression levels of N-cadherin， Vimentin， fibronectin （FN）， p-JAK2 and p-STAT3 in quercetin group and positive control group decreased （P<0.05）， E-cadherin expression level increased （P<0.05）; compared with quercetin group， the change trend of the above indexes in inhibitor group was more significant （P<0.05）， while the change of these indexes in activator group was reversed （P<0.05）. Quercetin can inhibit the growth， migration， invasion and EMT progression of human chondrosarcoma SW-1353 cells， possibly by blocking the JAK2/STAT3 signaling pathway.

Key words： chondrosarcoma; quercetin; JAK2/STAT3 signaling pathway; migration; invasion

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（3）： 240-246）

軟骨肉瘤（chondrosarcoma）是起源于軟骨細(xì)胞的惡性骨腫瘤之一，其最常見的癥狀是局部性疼痛［1］。軟骨肉瘤對放、化療不敏感，耐藥性強(qiáng)，通常采用手術(shù)廣泛切除，但手術(shù)預(yù)后較差、極易復(fù)發(fā)［2-3］。因此，迫切需要尋找敏感性強(qiáng)、效價高、副作用低的抗腫瘤藥物以治療軟骨肉瘤，而中醫(yī)藥在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)里已發(fā)展兩千多年，有很多關(guān)于中藥治療軟骨肉瘤的研究［4］。槲皮素（quercetin）是一種廣泛存在于蔬菜和水果中的黃酮類化合物，具有降三高、抗氧化、抗病毒、抗癌、抗炎、對神經(jīng)和心臟有保護(hù)作用等多種特性［5-6］，而且還具有抗腫瘤活性［7］。有多項研究報道，槲皮素可以抑制卵巢癌［8］、前列腺癌［9］及骨肉瘤［10］等多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。但槲皮素對軟骨肉瘤細(xì)胞的抗腫瘤機(jī)制仍不十分明確，基于此，本研究利用槲皮素干預(yù)對軟骨肉瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT的作用機(jī)制做進(jìn)一步的探討，以期為槲皮素開發(fā)成腫瘤治療新藥提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人軟骨肉瘤SW-1353細(xì)胞，購自武漢普諾賽生命科技有限公司；槲皮素、阿霉素（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%），Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄啟動因子3（Janus kinase 2/signal transduction and transcription promoter 3，JAK2/STAT3）通路抑制劑AG490、激活劑colivelin（上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，美國Gibco公司），L-15培養(yǎng)基、RIPA裂解液、細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）（艾美捷科技有限公司），結(jié)晶紫染色液［生工生物工程（上海）股份有限公司］，基質(zhì)膠（美國ABC公司），JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）與β-actin一抗、二抗包括堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG（H+G）和AP標(biāo)記的羊抗兔IgG（H+G）、青霉素-鏈霉素溶液（100×）均來源于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。DXS_3型倒置熒光顯微鏡購自上海締倫光學(xué)儀器有限公司，THZ-98A型二氧化碳培養(yǎng)箱購自上海博迅實業(yè)有限公司，Infinite F200型Spark多功能酶標(biāo)儀購自帝肯（上海）貿(mào)易有限公司，GelDoc2000型凝膠成像系統(tǒng)購自美國Backman公司等。

1.2 方法

1.2.1 人軟骨肉瘤SW-1353細(xì)胞培養(yǎng)

人軟骨肉瘤SW-1353細(xì)胞生長于L-15培養(yǎng)基（含10% FBS、1×青-鏈霉素）中，并置于37℃、100%空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期SW-1353細(xì)胞用于試驗。

1.2.2 分組及給藥

用不同濃度（12.5、25.0、50.0、100.0和200.0 μmol/L）槲皮素干預(yù)SW-1353細(xì)胞24 h，對照組細(xì)胞不做干預(yù)，CCK-8法篩選出最適濃度（50.0 μmol/L）進(jìn)行后續(xù)試驗。再將細(xì)胞分為對照組（不做干預(yù)）、槲皮素組（50.0 μmol/L槲皮素）、陽性藥物組（6.0 μmol/L阿霉素［11］）、抑制劑組（50.0 μmol/L槲皮素＋50.0 μmol/L JAK2/STAT3通路抑制劑AG490［12］聯(lián)合干預(yù)）和激活劑組（50.0 μmol/L槲皮素＋0.5 μmol/L JAK2/STAT3通路激活劑colivelin［13］聯(lián)合干預(yù)），干預(yù)24 h，每個試驗重復(fù)3次，并設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.3 CCK-8法測定人軟骨肉瘤SW-1353細(xì)胞活性

細(xì)胞分組與給藥方法同1.2.2，將對數(shù)期生長的細(xì)胞胰酶消化后用完全細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞傳代并以5×103個/孔的密度鋪于96孔板中。以不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基的孔為空白組，藥物處理24 h和48 h后，各孔加入體積分?jǐn)?shù)為10% 的CCK-8溶液，孵育2 h后，檢測各孔在450 nm的吸光度（optical density，OD）值。細(xì)胞活力/%=［（OD不同濃度槲皮素組－OD空白組）/（OD對照組－OD空白組）］×100%。

1.2.4 倒置顯微鏡觀察人軟骨肉瘤SW-1353細(xì)胞的形態(tài)

細(xì)胞分組與給藥方法同1.2.2，在倒置顯微鏡下記錄細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5 Transwell小室法測定SW-1353細(xì)胞的遷移和侵襲能力

細(xì)胞分組及干預(yù)同1.2.2，各組細(xì)胞在藥物干預(yù)24 h后，重懸在無血清的完全培養(yǎng)基中，并將1×105個細(xì)胞接種到Transwell小室的腔室中，Transwell小室和24孔板之間的腔室中加入500 μL含10% FBS的完全培養(yǎng)基。細(xì)胞在37℃中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，小室下表面的細(xì)胞與4%組織細(xì)胞固定液室溫孵育15 min，再與1%結(jié)晶紫染色液室溫孵育20 min。在侵襲能力分析試驗時，小室提前用基質(zhì)膠預(yù)處理，其他步驟相同。顯微鏡下記錄采集圖像；Image-J圖像分析細(xì)胞遷移或侵襲數(shù)。

1.2.6 Western blot法檢測SW-1353細(xì)胞中蛋白的表達(dá)水平

細(xì)胞分組與給藥方法同1.2.2，收集各組細(xì)胞，并將細(xì)胞懸浮在預(yù)冷的放射免疫沉淀分析法（radio immuno precipitation assay，RIPA）裂解液中30 min，12 000 r/min冷凍離心10 min后收集上清液。目的蛋白先用凝膠電泳進(jìn)行分離，后經(jīng)聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)印電泳、封閉、一抗孵育、二抗孵育及膜顯色。在凝膠成像系統(tǒng)上采集蛋白條帶并用系統(tǒng)配備的分析軟件進(jìn)行蛋白灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參。蛋白相對表達(dá)水平為目標(biāo)蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析在SPSS 24.0軟件上進(jìn)行，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s），數(shù)據(jù)分析多組間采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用Students t檢驗。P<0.05代表具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素干預(yù)SW-1353細(xì)胞的作用濃度篩選

CCK-8法檢測槲皮素對SW-1353細(xì)胞活力的影響（圖1），結(jié)果顯示：干預(yù)24 h時，與對照組相比，隨著槲皮素作用濃度增加，細(xì)胞活力逐漸降低，其中12.5 μmol/L槲皮素組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），25.0、50.0、100.0和200.0 μmol/L槲皮素組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），100.0和200.0 μmol/L槲皮素細(xì)胞活力低于半抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）；干預(yù)48 h時，細(xì)胞降低趨勢與干預(yù)24 h相似，25.0、50.0、100.0和200.0 μmol/L槲皮素均顯著降低（P<0.05）。為了排除細(xì)胞活力對SW-1353細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，本研究選擇了干預(yù)時間較短（24 h）、細(xì)胞活力顯著降低且相較于IC50稍高的槲皮素濃度（50.0 μmol/L）。

2.2 槲皮素通過阻滯JAK2/STAT3通路抑制SW-1353細(xì)胞的生長

利用倒置顯微鏡觀察了各組SW-1353細(xì)胞形態(tài)的變化發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，槲皮素組、陽性藥物組、抑制劑組細(xì)胞的生長受到抑制，激活劑組細(xì)胞生長抑制作用不明顯，與槲皮素組相比，抑制劑組細(xì)胞生長抑制作用明顯，具體情況見圖2。

2.3 槲皮素通過阻滯JAK2/STAT3通路抑制SW-1353細(xì)胞的遷移

Transwell小室測定細(xì)胞的遷移能力顯示，干預(yù)24 h，槲皮素組和陽性藥物組遷移細(xì)胞數(shù)較對照組下調(diào)（P<0.05），抑制劑組遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于槲皮素組（P<0.05），激活劑組細(xì)胞遷移數(shù)明顯高于槲皮素組（P<0.05），具體情況見圖3。

2.4 槲皮素通過阻滯JAK2/STAT3通路抑制SW-1353細(xì)胞的侵襲

Transwell小室測定細(xì)胞的侵襲能力顯示（圖4），干預(yù)24 h，槲皮素組和陽性藥物組侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著低于對照組（P<0.05），侵襲細(xì)胞數(shù)在抑制劑組明顯低于槲皮素組（P<0.05），在激活劑組明顯高于槲皮素組（P<0.05）。

2.5 槲皮素通過阻滯JAK2/STAT3通路抑制SW-1353的EMT進(jìn)程

與對照組相比，E-cadherin蛋白表達(dá)水平在槲皮素組和陽性藥物組上調(diào)，N-cadherin、Vimentin和FN三個蛋白水平在槲皮素組和陽性藥物組下調(diào)（P<0.05）；較槲皮素組，E-cadherin蛋白水平在抑制劑組較高，在激活劑組較低，N-cadherin、Vimentin和FN在抑制劑組較低，在激活劑組較高（P<0.05），具體情況見圖5。

2.6 槲皮素抑制SW-1353細(xì)胞中JAK2/STAT3信號通路的活化狀態(tài)

為了研究槲皮素對JAK2/STAT3信號通路活化狀態(tài)的影響，檢測了該通路的關(guān)鍵性蛋白JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)水平（圖6a），蛋白定量分析結(jié)果顯示（圖6b）：各組之間JAK2和STAT3蛋白的表達(dá)水平無顯著差異（P>0.05）；與對照組相比，槲皮素組和陽性藥物組細(xì)胞p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），與槲皮素組相比，抑制劑組p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），激活劑組p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。

3 討論

軟骨肉瘤作為原發(fā)惡性骨腫瘤，多發(fā)生在股骨和骨盆等身體部位，早中期臨床癥狀并不明顯，大多患者發(fā)現(xiàn)時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)廣泛切除對患者肢體功能具有嚴(yán)重的不良影響，且術(shù)后預(yù)后差、易復(fù)發(fā)［14］，因此，研究軟骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，對于患者治療具有非常重要的臨床意義。近幾年，越來越多的醫(yī)學(xué)研究傾向于開發(fā)防治腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)的中醫(yī)藥物。中醫(yī)學(xué)對骨腫瘤病因病機(jī)的認(rèn)識，有“腎主骨”之說，故認(rèn)為骨腫瘤的發(fā)生與腎精虧損、骨髓空虛有關(guān)，用中藥治療骨腫瘤能夠起到清熱解毒、驅(qū)邪扶正之功效［15］。槲皮素是植物中廣泛分布的一種黃酮醇類化合物，毒副作用小，具有多靶點和不易耐藥的優(yōu)勢，能夠與其他藥物協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用［16］，近年來在前列腺癌［17］、乳腺癌［18］及食管癌［19］等細(xì)胞中被報道有抗癌作用。在骨肉瘤細(xì)胞的研究中，槲皮素對腫瘤細(xì)胞的抑制作用已有相關(guān)報道［20］，其抗腫瘤機(jī)制涉及細(xì)胞的遷移和侵襲等方面。本試驗發(fā)現(xiàn)，槲皮素處理后，SW-1353細(xì)胞活力降低。為排除細(xì)胞活力對細(xì)胞遷移侵襲的影響，本研究選擇對細(xì)胞活力有顯著影響且濃度較低（50.0 μmol/L）的槲皮素進(jìn)行試驗，發(fā)現(xiàn)50.0 μmol/L槲皮素和6.0 μmol/L阿霉素對SW-1353細(xì)胞有相同的作用效果，均可抑制人軟骨肉瘤細(xì)胞SW-1353的生長、遷移和侵襲能力，證明了槲皮素可以抑制軟骨肉瘤細(xì)胞，有良好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。

JAK2/STAT3信號通路與腫瘤細(xì)胞周期、發(fā)生發(fā)展和耐藥性等相關(guān)［21］。有研究報道，二氫楊梅素可通過調(diào)控JAK2/STAT3信號通路抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞活性、侵襲和遷移能力［22］。槲皮素可阻斷JAK/STAT通路抑制人宮頸癌C-33A細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期等［23］，但槲皮素對軟骨肉瘤細(xì)胞的作用機(jī)制并不明確。本文檢測JAK2/STAT3通路關(guān)鍵蛋白結(jié)果顯示，槲皮素組較對照組p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)水平降低，表明槲皮素可以抑制JAK2/STAT3通路。惡性腫瘤的特點除了生長速度較快之外，常伴隨著侵襲、浸潤轉(zhuǎn)移等過程。作為惡性腫瘤預(yù)后的主要影響因素，侵襲與轉(zhuǎn)移的發(fā)生與EMT密切相關(guān)［24］。在EMT生物學(xué)過程中，上皮細(xì)胞失去極性，細(xì)胞黏性降低，遷移和侵襲能力增強(qiáng)是發(fā)生腫瘤擴(kuò)散的一個重要因素［25］。移志剛［26］發(fā)現(xiàn)，RIPK4抗軟骨肉瘤作用與抑制EMT進(jìn)程有關(guān)。本研究證實槲皮素對SW-1353細(xì)胞有抑制生長、遷移和侵襲作用后，發(fā)現(xiàn)槲皮素可抑制軟骨肉瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程。為了研究相關(guān)的作用機(jī)制，本研究加入了JAK2/STAT3通路抑制劑AG490和激活劑colivelin，發(fā)現(xiàn)與槲皮素組相比，抑制劑組抑制了SW-1353細(xì)胞的遷移及侵襲能力，增加了E-cadherin表達(dá)，降低了N-cadherin、Vimentin、FN及p-JAK2和p-STAT3表達(dá)水平，激活劑組結(jié)果與抑制劑組相反，提示槲皮素可能是通過JAK2/STAT3通路去調(diào)節(jié)SW-1353細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT進(jìn)程的。這與Wu等［27］在肝細(xì)胞癌LM3細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)槲皮素通過消除JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用，以及與鄭巖松等［28］發(fā)現(xiàn)的槲皮素在人肝癌SMMC-7721細(xì)胞中抑制EMT的進(jìn)程結(jié)果相符。

綜上所述，槲皮素可通過抑制JAK2/STAT3信號通路抑制人軟骨肉瘤SW-1353細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT進(jìn)程，為軟骨肉瘤靶向治療提供新方向。但槲皮素對軟骨肉瘤其他生物學(xué)特性的影響及相關(guān)分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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