芮李彤，劉 暢，夏秀芳*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

隨著生活節(jié)奏加快、人民生活水平提高，特別在現(xiàn)代冷凍技術(shù)升級(jí)后，冷凍肉類(lèi)食品以其貨架期長(zhǎng)、快捷、方便等特點(diǎn)已成為主流消費(fèi)食品之一。低溫凍藏不僅可以抑制微生物生命活動(dòng)，還能降低分解脂肪或蛋白質(zhì)的酶的活性[1]，當(dāng)食品中心溫度達(dá)到-18 ℃時(shí)，其中80%以上的水分會(huì)通過(guò)成核和晶體生長(zhǎng)來(lái)轉(zhuǎn)化為冰晶[2]。冷凍肉類(lèi)食品在食用前要進(jìn)行解凍，解凍是凍結(jié)的逆過(guò)程，涉及凍結(jié)肉中冰晶融化成水并被肉吸收而恢復(fù)到凍結(jié)前的新鮮狀態(tài)的變化過(guò)程[3]。但在實(shí)際冷凍過(guò)程中，肌肉細(xì)胞外的水分因?yàn)闇囟冉档托纬纱罅勘В?dāng)液態(tài)水向正在生長(zhǎng)的晶體擴(kuò)散時(shí)，會(huì)造成組織間的冰晶愈長(zhǎng)愈大，從而對(duì)肌肉組織細(xì)胞造成不可逆轉(zhuǎn)的破壞并失去活性[4]，當(dāng)溫度回升時(shí)，冰再融化成水，但此時(shí)組織中水分的含量和分布早已發(fā)生改變。

低溫凍藏可有效延長(zhǎng)肉類(lèi)食品的貨架期，但凍融過(guò)程中肉類(lèi)食品品質(zhì)發(fā)生了明顯變化：肉色變暗[5]，質(zhì)地變硬[6]，多汁性下降[7]；保水性下降，解凍損失和滴水損失增加[8-10]；風(fēng)味物質(zhì)流失，苦味增強(qiáng)[2]，鮮味減弱[11]；蛋白質(zhì)發(fā)生降解、聚集和結(jié)構(gòu)惡化，蛋白質(zhì)凝膠性下降[1]，肌纖維收縮，肌束間間隙增大[6]，微觀(guān)結(jié)構(gòu)被破壞[12]；蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化，羰基含量[13]和硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值[14]增加，巰基含量下降[13]；冰晶形成和重結(jié)晶導(dǎo)致食品中水分發(fā)生重新分布，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞[14]等。低溫凍藏和解凍的實(shí)質(zhì)是肉中80%的水分發(fā)生水-冰-水兩次相變的過(guò)程，肉中的水分充斥在肌細(xì)胞內(nèi)部和周?chē)?，形成了肉中富含水分而看不到水分的致密大理石樣紋理。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與冷凍肉品質(zhì)密切相關(guān)，結(jié)合基本的冷凍損傷機(jī)理，可推測(cè)水的相變引起肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致肉品質(zhì)發(fā)生變化，即水的相變是因，肉品質(zhì)變化是果。目前以水-冰-水變化揭示肉類(lèi)食品劣變機(jī)理的相關(guān)研究報(bào)道較少。

本文綜述冰晶的形成和生長(zhǎng)過(guò)程，及在不同溫度和過(guò)飽和度下冰晶的形態(tài)，分析凍融引起肌肉中發(fā)生水-冰-水動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程以及其對(duì)肉類(lèi)食品關(guān)鍵組分破壞的機(jī)理，并且總結(jié)目前一些新興冷凍技術(shù)，更全面地揭示凍融過(guò)程中水-冰-水演變過(guò)程導(dǎo)致肌肉品質(zhì)劣變的本質(zhì)，以期為降低冷凍肉類(lèi)食品品質(zhì)劣變和研發(fā)新型冷凍技術(shù)提供理論指導(dǎo)和研究方向，對(duì)推動(dòng)我國(guó)冷凍肉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有一定的意義。

1 水形成冰的過(guò)程及冰晶增長(zhǎng)

在水的凍結(jié)過(guò)程中，結(jié)晶經(jīng)過(guò)以下3 個(gè)階段：1）水分迅速冷卻以消除顯熱，這導(dǎo)致水分溫度低于其相變溫度（0 ℃）并進(jìn)入過(guò)冷狀態(tài)，此時(shí)溫度與凝固點(diǎn)的差值稱(chēng)為過(guò)冷度（ΔTs）；2）在特定的過(guò)冷度下，溫度突然升高，結(jié)晶潛熱釋放，溶液中開(kāi)始形成晶核或微小的晶格結(jié)構(gòu)；3）在實(shí)現(xiàn)初始成核后，結(jié)晶進(jìn)入下一階段，已有晶核開(kāi)始生長(zhǎng)并伴隨有新的晶核形成，隨著凍結(jié)時(shí)間的延長(zhǎng)將會(huì)發(fā)生重結(jié)晶，直到達(dá)到環(huán)境施加的最終溫度。

1.1 冰晶的成核

首先水分子相互碰撞和聚集形成無(wú)定形團(tuán)簇，無(wú)定形團(tuán)簇再進(jìn)一步碰撞和結(jié)合時(shí)形成微小的晶格，達(dá)到臨界體積后便能形成穩(wěn)定的“晶核”。冰晶成核是一個(gè)隨機(jī)過(guò)程，受雜質(zhì)、樣品體積、表面積和粗糙度等因素的影響，分為均相成核和異相成核兩種，在一個(gè)體系內(nèi)各處的成核幾率均相同稱(chēng)為均相成核，異相成核則是指水在塵埃、容器表面及其他異相表面等處形成晶核[15]。利用差示掃描量熱技術(shù)，通過(guò)評(píng)估熱流信息可以區(qū)分均相成核和異相成核。

1.2 冰晶的生長(zhǎng)和重結(jié)晶

實(shí)際在飽和溶液中，晶核處于一種形成-溶解-再形成的動(dòng)態(tài)平衡之中，只有達(dá)到一定的過(guò)飽和度以后，才能形成熱力學(xué)穩(wěn)定的臨界核，臨界核可以作為后續(xù)冰晶生長(zhǎng)的平臺(tái)[16]。水分子擴(kuò)散到晶核表面并有序聚集成可見(jiàn)尺寸的晶體，冰晶開(kāi)始從晶核向不同方向迅速擴(kuò)展生長(zhǎng)，一般在平行于基面的方向上生長(zhǎng)，垂直于基面的方向上生長(zhǎng)十分緩慢[17]。影響冰晶生長(zhǎng)速率的因素有兩個(gè)：傳熱和傳質(zhì)。在大多數(shù)高水分食物中存在大量的水和溶質(zhì)分子，但是除了在凍結(jié)的后期，這些分子傳向或遠(yuǎn)離晶體的質(zhì)量并不影響冰晶生長(zhǎng)速率。因此，在冷凍過(guò)程中，控制結(jié)晶的主要參數(shù)是傳熱速率，影響晶體生長(zhǎng)速率的關(guān)鍵變量是過(guò)冷度。晶體生長(zhǎng)速率（G/（℃/min））與過(guò)冷度（ΔTs/（℃））之間的關(guān)系是：G＝βΔTsn（β和n為常數(shù)）[17]。

重結(jié)晶為在保持總晶體質(zhì)量不變的情況下，整個(gè)晶體系統(tǒng)的表面自由能降低，各相之間的化學(xué)勢(shì)趨于平衡，冰晶的平均尺寸增大，數(shù)量減少，取向、大小和完整性等特性發(fā)生變化的過(guò)程[18]。圖1展示了發(fā)生重結(jié)晶的3 種途徑：積聚、遷移和表面等滲。積聚是指相鄰區(qū)域的晶體合并形成較大的晶體，主要發(fā)生在重結(jié)晶的早期階段；遷移則發(fā)生在后面的過(guò)程中，由于受溫度下降的影響很大，小冰晶融化產(chǎn)生的液體聚集在一起流向大冰晶并重新結(jié)晶，最終導(dǎo)致小冰晶的消失；若存在形狀不規(guī)則的冰晶，則會(huì)發(fā)生表面等滲現(xiàn)象，即在晶體質(zhì)量不變的情況下形狀的改變，晶體表面變得更光滑、更鋒利并且達(dá)到熱力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)。

圖1 冰晶發(fā)生重結(jié)晶的3 種途徑[17]Fig.1 Three ways of recrystallization of ice crystals[17]

1.3 冰晶的形態(tài)

低溫下水分狀態(tài)的變化可能受冷凍方法和速率、貯存溫度和時(shí)間等多種因素的影響，快速冷凍會(huì)產(chǎn)生高速率的熱質(zhì)傳遞、低滲透壓以及最少的水分遷移，在肌肉細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的細(xì)小冰晶，從而對(duì)微觀(guān)結(jié)構(gòu)的破壞較小，而緩慢冷凍往往會(huì)導(dǎo)致大塊冰晶生長(zhǎng)并刺破肌肉細(xì)胞。

凍結(jié)溫度和過(guò)飽和度（該溫度時(shí)物質(zhì)的溶液飽和濃度）決定著冰晶的形態(tài)，形態(tài)不同對(duì)肌肉組織破壞程度不同，在低過(guò)飽和度下，形成的晶核大而少[19]，而且形成的冰晶形貌可能呈如圖2所示的針狀或盤(pán)狀，但最終會(huì)因?yàn)榻Y(jié)晶過(guò)程中所釋放的潛熱不能被迅速傳遞出去而發(fā)展成樹(shù)枝狀冰晶，其棱角鋒利，易造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷[20]。在食品中最主要的冰晶形狀是六角形結(jié)晶單元或規(guī)則枝晶[21]。

圖2 不同凍結(jié)溫度和過(guò)飽和度下冰晶的形態(tài)[22]Fig.2 Morphology of ice crystals at different freezing temperatures and degrees of supersaturation[22]

2 凍融過(guò)程引起肌肉中水-冰-水動(dòng)態(tài)變化

新鮮肉中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，最主要的蛋白是肌原纖維蛋白，水分主要存在于肌原纖維的粗絲與細(xì)絲之中、肌原纖維間、肌纖維與肌內(nèi)膜之間、肌纖維與肌束間的空隙中。肉中水分按其與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密程度分為自由水、不易流動(dòng)水和結(jié)合水（圖3）。

圖3 肌肉中的水分種類(lèi)和分布Fig.3 Types and distribution of water in muscle

每個(gè)水分子除與其相鄰水分子之間形成氫鍵外，還與蛋白質(zhì)分子發(fā)生偶極子相互作用即水化作用，形成水化層。當(dāng)新鮮肉放置在-18 ℃貯藏時(shí)，外層的自由水和不易流動(dòng)水依次變成冰晶，而結(jié)合水基本不變（圖4）；隨著凍結(jié)時(shí)間的延長(zhǎng)，與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的結(jié)合水逐漸向肌內(nèi)膜外轉(zhuǎn)移[23]，與膜外的冰晶結(jié)合，導(dǎo)致冰晶數(shù)量增多、體積增大，還會(huì)發(fā)生重結(jié)晶現(xiàn)象，破壞肌纖維，而留在肌內(nèi)膜內(nèi)的水多在膜邊緣聚集，從而使原生質(zhì)不均勻地分布在肌纖維內(nèi)；解凍后，由冰晶引起的細(xì)胞內(nèi)外的裂縫仍然存在，即使肌肉纖維由于水的流入而重新膨脹，也無(wú)法恢復(fù)到原來(lái)的體積[17]。

圖4 水-冰-水動(dòng)態(tài)變化過(guò)程引起肌肉蛋白質(zhì)水、冰變化及分布情況[24]Fig.4 Changes and distribution of water and ice in muscle during water-ice-water dynamic change[24]

3 水-冰-水動(dòng)態(tài)變化對(duì)肌肉品質(zhì)的影響及其機(jī)理

在凍融期間，肉制品經(jīng)過(guò)低溫冷凍-長(zhǎng)時(shí)間凍藏-解凍復(fù)溫到室溫的過(guò)程，肉中柔性水的分布以及剛性冰的取向、大小和形狀不斷發(fā)生變化，對(duì)冷凍肉中細(xì)胞膜和組織結(jié)構(gòu)造成機(jī)械損傷，解凍時(shí)大量汁液流失[25]，一些水溶性營(yíng)養(yǎng)成分如可溶性蛋白、水溶性維生素以及氨基酸等成分都會(huì)隨之喪失[26]，最終導(dǎo)致冷凍肉品質(zhì)劣變（保水性降低[27]、肉色變暗[7]、質(zhì)地變硬和異味產(chǎn)生[11]）、微觀(guān)結(jié)構(gòu)被破壞（肌纖維收縮，肌束間隙增大，Z線(xiàn)錯(cuò)位、弱化或消失并出現(xiàn)線(xiàn)粒體空泡化現(xiàn)象[28]）、肌原纖維蛋白氧化損傷（羰基含量升高[29]、總巰基含量[7]和Ca2+-ATP酶活性[30]降低）、脂肪氧化加?。ㄟ^(guò)氧化物值、TBARS值、酸價(jià)和自由基信號(hào)強(qiáng)度升高[31]），并且蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)[32]和空間結(jié)構(gòu)[33]都發(fā)生顯著變化，從而降低了產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。

3.1 水-冰-水動(dòng)態(tài)變化對(duì)肌肉感官品質(zhì)的影響及其機(jī)理

無(wú)論是保水性的降低、脂肪的氧化，還是蛋白質(zhì)的變性，最終體現(xiàn)在冷凍肉制品上最直觀(guān)的表現(xiàn)是冷凍肉感官品質(zhì)的變化，這也是影響消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)欲望最直接的原因。如脂肪氧化酸敗生成醛、酮類(lèi)小分子化合物，影響肉制品的風(fēng)味；肌紅蛋白氧化生成高鐵肌紅蛋白，使肉制品失去誘人的鮮紅色澤；肌原纖維蛋白氧化和冷凍變性使其失去在肉體系中的功能性質(zhì)，表現(xiàn)為肉制品組織軟塌[34]。

3.1.1 水-冰-水動(dòng)態(tài)變化對(duì)肌肉色澤的影響及其機(jī)理

對(duì)于消費(fèi)者來(lái)說(shuō)，色澤是其評(píng)判肉和肉制品品質(zhì)優(yōu)劣的最直觀(guān)標(biāo)準(zhǔn)。水-冰-水動(dòng)態(tài)變化過(guò)程會(huì)導(dǎo)致冷凍肉制品黃度b*值升高[35]，亮度L*值和紅度a*值下降[5]，表現(xiàn)為肉色變暗[7]。在冷凍過(guò)程中，肌肉組織中發(fā)生的生化反應(yīng)及耐冷微生物分泌的水溶性或脂溶性色素導(dǎo)致肉品色澤隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸發(fā)生劣變。肉品所含肌紅蛋白在冷凍過(guò)程中接觸空氣中的氧氣發(fā)生氧合作用，生成氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白，F(xiàn)e3+含量迅速增加，表面逐漸呈現(xiàn)紅棕色。在冷凍條件下，高鐵肌紅蛋白還原酶的活性隨著蛋白質(zhì)變性程度增大而降低，使高鐵肌紅蛋白濃度升高，而且解凍時(shí)肌紅蛋白和血紅蛋白會(huì)伴隨著滲出物流失，紅度下降。

此外，細(xì)胞膜上高不飽和脂肪酸氧化生成的自由基與蛋白質(zhì)中胺類(lèi)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，可能會(huì)導(dǎo)致黃色色素生成[36]。在凍融期間肉的超微結(jié)構(gòu)變化以及冰晶的重組使得水從細(xì)胞內(nèi)空間遷移到細(xì)胞外空間，這導(dǎo)致大量水分流失并增加了細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度[37]，造成肉表面光反射率的變化，從而增加了肉制品的L*值[25]。

3.1.2 水-冰-水動(dòng)態(tài)變化對(duì)肌肉質(zhì)構(gòu)的影響及其機(jī)理

肉制品的硬度、彈性和嫩度等質(zhì)構(gòu)特性是消費(fèi)者評(píng)價(jià)肉制品品質(zhì)好壞的重要依據(jù)之一[26]。凍融過(guò)程中，冰晶的形成和消失使細(xì)胞膜和組織結(jié)構(gòu)不斷受到機(jī)械損傷，肌原纖維蛋白變性加重，肉制品硬度[11]和彈性[38]下降，組織軟塌[34]。此外，凍融后肌肉細(xì)胞失水、纖維束排列分散雜亂、間隙增大，也會(huì)導(dǎo)致剪切力增大。冷凍肉在凍融期間質(zhì)構(gòu)特性變化如表1所示。

表1 冷凍肉在水-冰-水動(dòng)態(tài)變化期間質(zhì)構(gòu)特性的變化Table 1 Changes in texture properties of frozen meat during waterice-water dynamic change

3.1.3 水-冰-水動(dòng)態(tài)變化對(duì)肌肉風(fēng)味的影響及其機(jī)理

肉制品在凍融過(guò)程中，由于揮發(fā)性脂肪酸氧化和蛋白質(zhì)變性而產(chǎn)生異味，蛋白質(zhì)次級(jí)鍵發(fā)生變化甚至斷裂，降解為氨基酸，導(dǎo)致冷凍肉制品苦味氨基酸含量增加，而呈鮮甜味的氨基酸總含量呈下降趨勢(shì)，精氨酸作為肉品中重要的增味氨基酸，含量也逐漸降低[11]。而且伴隨著肉特征滋味和鮮味的逐漸減弱，風(fēng)味化合物的含量會(huì)隨冷凍貯藏時(shí)間推移而波動(dòng)變化[40]。

冷凍過(guò)程中冰晶的形成及其在細(xì)胞中的體積增大也會(huì)導(dǎo)致解凍后風(fēng)味物質(zhì)的大量流失，而快速凍結(jié)中形成的細(xì)小冰晶在減少異味核苷酸、三甲胺、生物胺和苦味相關(guān)游離脂肪酸含量方面表現(xiàn)出更好的效果，并在貯藏期間更易保持與鮮味相關(guān)的游離氨基酸和肌苷單磷酸的含量，這說(shuō)明抑制冰晶生長(zhǎng)可以使冷凍肉制品具有更好的細(xì)胞完整性，在一定程度上減緩了生化反應(yīng)的發(fā)生[41]，保持了肉品原有的風(fēng)味。

3.2 水-冰-水動(dòng)態(tài)變化對(duì)肌肉微觀(guān)結(jié)構(gòu)的影響及其機(jī)理

新鮮的肉制品肌肉組織均勻，肌纖維排列緊密有序，肌束膜清晰可見(jiàn)，肌肉組織橫斷面為細(xì)密的點(diǎn)陣集合，從縱切面可以看到整條肌纖維和肌原纖維整齊排列[26]。隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肌纖維內(nèi)/間形成的冰晶數(shù)量增多，體積變大，附近的肌纖維受到擠壓，肌節(jié)出現(xiàn)扭曲變形，組織結(jié)構(gòu)弱化，原來(lái)排列致密的肌纖維變得結(jié)構(gòu)松散，橫截面呈不同的形狀，肌束膜和肌內(nèi)膜破裂，肌肉組織的完整性遭到破壞，而且隨著肌纖維直徑和面積的減小，細(xì)胞間隙所占比例增大，線(xiàn)粒體腫脹并空泡化、肌節(jié)縮短，Z線(xiàn)和M線(xiàn)出現(xiàn)錯(cuò)位、斷裂、消失[26]。在解凍后，冰晶融化，從肌肉組織中流出汁液，導(dǎo)致肌纖維邊界模糊、排列紊亂，部分蛋白潰散、偏聚、斷開(kāi)，從而影響肉制品的紋理和結(jié)構(gòu)[42]。

3.3 水-冰-水動(dòng)態(tài)變化對(duì)肌肉保水性的影響及其機(jī)理

在凍藏過(guò)程中，冰晶的生長(zhǎng)效應(yīng)對(duì)肌纖維造成的機(jī)械損傷使細(xì)胞破裂成大量的小片段，胞外間隙增大，水的流動(dòng)性隨之增強(qiáng)，自由水的損失增加。在解凍時(shí)，由于無(wú)法被肌肉全部吸收，部分冰晶融化成水后會(huì)流失，一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽和維生素也會(huì)隨著水分流出[22]，最終導(dǎo)致冷凍肉制品的保水性下降[29]、解凍損失和蒸煮損失增加[13]。

蛋白質(zhì)表面的水合作用和肌纖維晶格的毛細(xì)管效應(yīng)也會(huì)影響體系的水分狀態(tài)和保水效果。肌肉蛋白質(zhì)表面同時(shí)存在疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)，凍融加速了蛋白質(zhì)氧化，表現(xiàn)為分子間二硫鍵的形成以及肽主鏈的斷裂，部分蛋白分子內(nèi)部的疏水性的脂肪族與芳香族氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)暴露[43]，使肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和交聯(lián)程度發(fā)生變化，從而導(dǎo)致肌纖維之間間距的改變和蛋白質(zhì)功能的降低，蛋白質(zhì)的功能與其捕水能力息息相關(guān)，因此保水性降低[44]。此外，肌肉中的水分也能通過(guò)肌纖維晶格產(chǎn)生的毛細(xì)管作用力保持，蛋白氧化會(huì)導(dǎo)致肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白發(fā)生交聯(lián)或變性，造成肌束收縮，對(duì)肌肉中毛細(xì)管作用力造成影響，最終影響肌肉保水性[45]。

3.4 水-冰-水動(dòng)態(tài)變化對(duì)冷凍肉氧化穩(wěn)定性的影響及其機(jī)理

脂質(zhì)和蛋白質(zhì)在賦予肉品品質(zhì)特性方面起著不可替代的作用，如血紅素蛋白決定肉的色澤，脂質(zhì)對(duì)肉品風(fēng)味具有重要的影響，在肌肉蛋白質(zhì)中含量最高的鹽溶性的肌原纖維蛋白賦予肉品質(zhì)構(gòu)特性。在水-冰-水動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中，冷凍肉制品自身的組織結(jié)構(gòu)遭到了破壞，肉中原本的抗氧化系統(tǒng)逐漸崩潰，加上相關(guān)酶的作用，脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化變性是除微生物外引起肉品品質(zhì)劣變的最主要因素[46]。

3.4.1 水-冰-水動(dòng)態(tài)變化對(duì)冷凍肉脂肪的影響及其機(jī)理

在凍融過(guò)程中，肉中飽和脂肪酸含量增加，而不飽和脂肪酸含量下降[47]，這是因?yàn)槿庵破分懈缓再|(zhì)活潑的不飽和脂肪酸如油酸和亞油酸，在凍融期間容易發(fā)生氧化。凍結(jié)時(shí)肌肉組織細(xì)胞外形成的冰晶不僅會(huì)破壞肌肉細(xì)胞膜和細(xì)胞器，損傷的肌細(xì)胞還會(huì)釋放出大量?jī)?nèi)源酶（脂肪酶、蛋白酶和核酸酶）及促氧化劑（血紅素、氧化酶和自由基），快速啟動(dòng)脂肪氧化，由此產(chǎn)生的自由基和脂質(zhì)氫過(guò)氧化物會(huì)進(jìn)一步分解成二次氧化產(chǎn)物，如戊醛、己醛、異呋喃和丙二醛，增加產(chǎn)品腐敗腥味并導(dǎo)致冷凍肉變色[48]，而且還會(huì)產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）的潛在前體或催化劑，進(jìn)一步引起肉類(lèi)品質(zhì)的劣變[49]。

解凍時(shí)釋放的線(xiàn)粒體和溶酶體脂肪酶會(huì)進(jìn)入到肌漿中，在促氧化劑的作用下造成脂肪酸與酶類(lèi)的直接接觸，加速了脂肪氧化[5]。此外，在冰轉(zhuǎn)化為水的過(guò)程中，冰晶融化，水分流失，肌肉產(chǎn)生海綿狀孔隙，脂肪與空氣接觸面增大，更加劇了脂肪氧化。

肉體系脂肪氧化程度可用過(guò)氧化值（peroxide value，PV）和TBARS值來(lái)判斷，PV和TBARS值分別反映脂肪初級(jí)和次級(jí)氧化產(chǎn)物的量。在水-冰-水的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中，冰晶的消融使得冷凍肉制品中脂肪氧化加劇，造成TBARS值升高[14,26]，而PV出現(xiàn)升高[50]或先升高后下降[51]等氧化酸敗的趨勢(shì)，這主要取決于脂質(zhì)氫過(guò)氧化物的分解速率。

3.4.2 水-冰-水動(dòng)態(tài)變化對(duì)冷凍肉中蛋白質(zhì)的影響及其機(jī)理

蛋白質(zhì)作為構(gòu)成細(xì)胞的有機(jī)大分子，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，它影響著肌肉組織的形態(tài)及品質(zhì)變化。在水-冰-水動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中，蛋白質(zhì)周?chē)沫h(huán)境發(fā)生了劇烈的變化，包括溫度、冷凍濃度和pH值改變以及冰晶的消融，不同的脅迫會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性的改變。

3.4.2.1 蛋白質(zhì)氧化

圖5展示了肉及其制品中蛋白質(zhì)氧化的機(jī)制和結(jié)果，在水-冰-水動(dòng)態(tài)變化中，活性物質(zhì)可直接促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化，與肉制品在凍結(jié)時(shí)冰晶的形成對(duì)脂質(zhì)氧化的影響相同，損傷的肌細(xì)胞釋放出的促氧化劑增加了蛋白質(zhì)氧化的程度和速率，當(dāng)ROS攻擊蛋白質(zhì)時(shí)，通過(guò)非共價(jià)和共價(jià)分子間鍵形成蛋白質(zhì)聚集，進(jìn)而造成蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的氧化修飾和蛋白骨架的損傷[7]，蛋白骨架的損傷主要包括裂解和交聯(lián)聚合，最終會(huì)形成分子內(nèi)及分子間的二硫鍵交聯(lián)。此外，脂肪氧化產(chǎn)生的自由基和氫過(guò)氧化物也能間接促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化，其表面疏水性隨著脂肪氧化程度的加劇而升高[24]，并伴隨著特殊氣味物質(zhì)的生成[49]。

圖5 冷凍肉制品中蛋白質(zhì)氧化的機(jī)制和結(jié)果[51-52]Fig.5 Mechanism and results of protein oxidation in meat and its products[51-52]

3.4.2.2 蛋白質(zhì)構(gòu)象改變

凍融促進(jìn)肌纖維收縮，肌原纖維蛋白分子逐漸展開(kāi)并形成較大的蛋白質(zhì)聚集，使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[53]，破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性。反映蛋白質(zhì)構(gòu)象整齊程度的α-螺旋和β-折疊含量降低，而反映蛋白質(zhì)構(gòu)象松散程度的無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角含量卻增加[54]，說(shuō)明蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由規(guī)則變得松散，穩(wěn)定性降低。冰晶形成導(dǎo)致肌肉蛋白的物理和化學(xué)環(huán)境改變，產(chǎn)生了二硫鍵和疏水鍵等，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)和水分子間的作用力減弱，表面疏水性提高，蛋白質(zhì)溶解度下降，Ca2+-ATP酶活力降低[30]，電泳條帶變淺、聚集或消失[38]。

蛋白質(zhì)中賴(lài)氨酸殘基的游離氨基（—NH2）在加工和儲(chǔ)存過(guò)程中很容易被取代，這進(jìn)一步反映了肌原纖維蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，游離胺含量的降低是由于—NH2與羰基發(fā)生反應(yīng)，而羰基是由脂肪和蛋白質(zhì)氧化協(xié)同作用產(chǎn)生的自由基脫氨而形成的[32]。此外，凍融導(dǎo)致蛋白質(zhì)去折疊化并使作為蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)一部分的色氨酸殘基暴露到親水溶劑中，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低[33]。

若對(duì)肉制品進(jìn)行慢速凍結(jié)，由于質(zhì)子集中在未凍結(jié)的水中，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)蛋白附近的pH值降低，也會(huì)引發(fā)蛋白質(zhì)的變性，與此同時(shí)，肌肉細(xì)胞外的水分子形成較大的冰晶，導(dǎo)致產(chǎn)品的肌肉組織發(fā)生橫向收縮；相反，快速冷凍過(guò)程中形成的較小冰晶能夠捕獲質(zhì)子，使得蛋白質(zhì)變性的程度降低[55]，α-螺旋和β-折疊含量也要比慢速冷凍過(guò)程中降低得少[54]。

4 提升冷凍肉類(lèi)食品品質(zhì)的新技術(shù)

快速冷凍會(huì)形成更多、更小的冰晶，能夠?qū)?duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷降到最低，然而這種冷凍方法也存在著一些缺點(diǎn)：總冷卻成本較高、易受環(huán)境影響、一些產(chǎn)品易開(kāi)裂甚至在直接暴露于極端低溫時(shí)粉碎。因此，一些可以在降低成本和功耗的同時(shí)最大限度地提高冷凍食品質(zhì)量的技術(shù)油然而生，如超聲波輔助凍結(jié)技術(shù)、高壓凍結(jié)技術(shù)、電場(chǎng)輔助凍結(jié)技術(shù)、磁場(chǎng)輔助凍結(jié)技術(shù)和添加抗凍劑等[56]。

4.1 超聲波輔助凍結(jié)

低頻高能超聲波是指能量高于1 W/cm2而頻率在16～100 kHz的超聲波，在食品級(jí)凍結(jié)及解凍方面應(yīng)用廣泛。超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)可誘導(dǎo)冰晶成核，存在于液體中的微小氣泡在超聲場(chǎng)的作用下振動(dòng)、生長(zhǎng)并不斷聚集聲場(chǎng)能量，導(dǎo)致空化氣泡體積越來(lái)越大，當(dāng)它們達(dá)到臨界尺寸時(shí)空化氣泡破裂，產(chǎn)生能量，將預(yù)先存在的冰晶破碎成較小的尺寸，再次充當(dāng)初級(jí)核，將樹(shù)突狀冰晶轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌?lèi)型的柱狀，對(duì)細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的損傷較小，改善凍結(jié)肉類(lèi)品質(zhì)[57]。

超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)可以加速介質(zhì)的流動(dòng)，提升傳熱傳質(zhì)的效率，縮短凍結(jié)時(shí)間，使冰晶分布均勻，有效降低了肌原纖維蛋白的氧化程度[58]和冷凍肉的凍融損失和蒸煮損失[59]，提高了嫩度并延緩了蛋白質(zhì)氧化[60]。由于超聲波通過(guò)介質(zhì)時(shí)會(huì)產(chǎn)生熱量，因此在實(shí)際應(yīng)用中需要研究適用于不同種類(lèi)、質(zhì)量及尺寸產(chǎn)品的超聲功率和持續(xù)時(shí)間，擴(kuò)大超聲波輔助凍結(jié)技術(shù)在食品凍藏中的應(yīng)用范圍。

4.2 高壓凍結(jié)

水的相變溫度隨著壓力的變化而變化，在高壓凍結(jié)過(guò)程中會(huì)形成不同種類(lèi)的冰，因此高壓凍結(jié)可分為壓力轉(zhuǎn)移凍結(jié)、壓力輔助凍結(jié)和壓力誘導(dǎo)凍結(jié)。壓力轉(zhuǎn)移凍結(jié)是將壓力增加至210 MPa，水的冰點(diǎn)降至-20 ℃，在該過(guò)程中，食品在高壓條件下冷卻到過(guò)冷狀態(tài)，然后迅速釋放壓力，由于此時(shí)食品過(guò)冷度較高，水會(huì)經(jīng)歷劇烈的相變，導(dǎo)致瞬間凍結(jié)，從而促使小冰晶的形成，減小對(duì)冷凍肉的組織損傷[61]。在解凍過(guò)程中，高壓的施加使得凍結(jié)樣品與周?chē)h(huán)境的溫差增大，從而使驅(qū)動(dòng)力和解凍速率增大，因此，該技術(shù)在食品冷凍中應(yīng)用較為廣泛。但是高壓冷凍實(shí)驗(yàn)研究對(duì)設(shè)備的依賴(lài)程度較高，不僅需要快速有效地使高壓腔冷卻到低溫狀態(tài)（如-15 ℃），還需精準(zhǔn)地實(shí)時(shí)測(cè)量實(shí)驗(yàn)過(guò)程中壓力腔的溫度變化，以保證樣品不提前凍結(jié)并在卸壓時(shí)得到足夠高的過(guò)冷度。

4.3 電場(chǎng)輔助凍結(jié)

靜電場(chǎng)主要通過(guò)影響冰晶的成核率來(lái)輔助凍結(jié)，當(dāng)外加電場(chǎng)作用于水時(shí)，水分子將發(fā)生極化并且偶極矩會(huì)沿著電場(chǎng)方向重新定向，沿電場(chǎng)方向的水分子需要克服的位能束縛小，更易與冰晶的晶格結(jié)構(gòu)結(jié)合，完成相變[62]。這一效應(yīng)降低了體系的吉布斯自由能，為結(jié)晶達(dá)到熱力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)提供了動(dòng)力，促進(jìn)了冰晶成核，通過(guò)最大冰晶生成帶的速度加快，從而產(chǎn)生均勻分布的細(xì)小冰晶，有助于保持肌肉組織完整和肌纖維密集排列[63]，使冷凍肉的微觀(guān)結(jié)構(gòu)得到改善。隨著靜電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，冷凍肉的滴水損失減小，并且對(duì)肉的顏色和硬度沒(méi)有顯著影響[64]。

4.4 磁場(chǎng)輔助凍結(jié)

抗磁材料和水分子在磁場(chǎng)作用下容易產(chǎn)生額外的磁偶極矩并且干擾原有規(guī)律的熱運(yùn)動(dòng)，影響了水分子的締合，水分子團(tuán)簇?cái)?shù)量增加，較大的水分子團(tuán)簇受到洛倫茲力的作用會(huì)旋轉(zhuǎn)變向，氫鍵穩(wěn)定性降低，因此分裂成多個(gè)具有較強(qiáng)團(tuán)簇間氫鍵的小團(tuán)簇[65]，樣品中水分子之間的連接變得更加緊密，使得水體大量結(jié)晶時(shí)難以形成大冰晶，導(dǎo)致初始成核溫度降低，加快了相變階段的進(jìn)程[62]。

磁場(chǎng)下肉品的肌肉結(jié)構(gòu)更清晰，肌纖維間排列更緊密有序，對(duì)凍藏期間肉品的色澤、氣味、質(zhì)地等感官品質(zhì)具有改善效果[65]。但目前實(shí)驗(yàn)所用的磁場(chǎng)范圍較小，且每組實(shí)驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)較少，易降低實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，因此在以后的研究過(guò)程中需要擴(kuò)大磁場(chǎng)范圍，增加平行實(shí)驗(yàn)次數(shù)以獲得更加一致的結(jié)果。

4.5 添加抗凍劑

抗凍劑是一類(lèi)加入到其他液體（一般為水）中以降低其冰點(diǎn)、提高抗凍能力的物質(zhì)，它也具有溶解冰晶和阻止冰晶長(zhǎng)大的作用。常用的抗凍劑主要有糖類(lèi)抗凍劑以及抗凍蛋白。

4.5.1 抗凍蛋白

抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）又稱(chēng)為冰結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)、細(xì)菌和植物中。它在不影響溶液熔點(diǎn)的情況下，可以通過(guò)非依數(shù)的形式來(lái)降低其冰點(diǎn)，從而表現(xiàn)出熱滯（thermal hysteresis，TH）活性[66]；還能夠不可逆地吸附在冰晶表面，動(dòng)態(tài)地改變其構(gòu)象，從而抑制冰晶的進(jìn)一步生長(zhǎng)和重結(jié)晶，呈現(xiàn)出抑制冰重結(jié)晶（ice recrystallization inhibitors，IRI）活性。

IRI活性和TH活性被認(rèn)為是影響冷凍食品新鮮度和口感的重要因素，擁有IRI活性可以提高顏色穩(wěn)定性，減少在凍融過(guò)程中肉品水分流失、微觀(guān)結(jié)構(gòu)被破壞[67]的現(xiàn)象；擁有TH活性可以使AFPs與冰晶表面結(jié)合并改變冰晶的表面曲率，抑制冰晶的生長(zhǎng)，從而降低蛋白質(zhì)的變性程度[35]。但是抗凍蛋白在提取、純化和合成時(shí)成本較高、不易產(chǎn)業(yè)化，目前為止還沒(méi)有得到廣泛推廣。

4.5.2 糖類(lèi)抗凍劑

添加糖類(lèi)抗凍劑是延緩冷凍食品劣變、保持食品品質(zhì)的有效手段，這歸因于糖類(lèi)抗凍劑的保水作用和抗氧化作用。糖類(lèi)抗凍劑一方面是通過(guò)羥基與食品中的水分以氫鍵連接，促進(jìn)自由水向結(jié)合水轉(zhuǎn)化，提高保水性[68]并有效抑制冰晶的生成；另一方面是通過(guò)清除自由基、螯合金屬離子等方式抑制脂肪和蛋白質(zhì)氧化，提高肌球蛋白的水結(jié)合能力[69]和Ca2+-ATP酶活性并且抑制了羰基的形成[70]。表2列舉了冷凍肉類(lèi)食品中用作抗凍劑的一些天然多糖。目前，應(yīng)用于冷凍肉制品的糖類(lèi)抗凍劑種類(lèi)較少，應(yīng)該進(jìn)一步研究，充分發(fā)揮糖類(lèi)抗凍劑的良好性能以擴(kuò)大其在冷凍肉制品中的應(yīng)用范圍。

表2 冷凍肉類(lèi)食品中用作抗凍劑的天然多糖Table 2 Natural polysaccharides used as antifreeze in frozen meat

5 結(jié) 語(yǔ)

新鮮肉的冷凍-解凍過(guò)程，同樣也是其內(nèi)部的柔性水和剛性冰相互轉(zhuǎn)變的過(guò)程，水形成冰后體積增大，對(duì)肌細(xì)胞造成機(jī)械損傷，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)水分滲到細(xì)胞外，又會(huì)引起溶質(zhì)損傷，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，重結(jié)晶的冰晶會(huì)加重對(duì)肌肉結(jié)構(gòu)的破壞，顯著影響了冷凍肉制品的品質(zhì)，使口感變差、營(yíng)養(yǎng)成分流失，甚至產(chǎn)生致癌毒素等。因此，真正影響食品穩(wěn)定性的不是水分含量或水分活度，而是水分遷移的狀態(tài)，在冷凍食品凍藏過(guò)程中，水狀態(tài)對(duì)食品品質(zhì)和穩(wěn)定性具有重要意義。

雖然結(jié)晶是一個(gè)自發(fā)的過(guò)程，難以控制，但如今超聲波、高壓、電場(chǎng)和磁場(chǎng)以及生物蛋白輔助冷凍技術(shù)的應(yīng)用，在生成細(xì)小而均勻分布的冰晶和提高冷凍食品品質(zhì)方面表現(xiàn)出了巨大潛力。然而，只有深入了解這些技術(shù)的機(jī)理和優(yōu)化工藝參數(shù)，才能盡早實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用，這仍需大量的工作。與此同時(shí)，若是將諸多新技術(shù)結(jié)合起來(lái)，不斷明確技術(shù)的適用場(chǎng)景及優(yōu)化使用效果，通過(guò)各種技術(shù)的聯(lián)合使用對(duì)水-冰-水動(dòng)態(tài)變化過(guò)程產(chǎn)生不同的影響，以實(shí)現(xiàn)所需的晶體微觀(guān)結(jié)構(gòu)和形貌，將會(huì)有效提高冷凍肉制品的品質(zhì)，使冷凍食品行業(yè)受益。