張金金 周燕萍 胡作為

肝癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。根據(jù)2020 年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，原發(fā)性肝癌在全球范圍內(nèi)的新增病例約90.6 萬(wàn)，死亡病例約83 萬(wàn)［1］。據(jù)2022 年最新統(tǒng)計(jì)，在中國(guó)肝癌的發(fā)病率和病死率分別占據(jù)第四位和第二位［2］。代謝相關(guān)脂肪性肝?。∕AFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是肝癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，其發(fā)病率和流行率呈上升趨勢(shì)，很可能超過(guò)病毒因素成為全球肝細(xì)胞癌（HCC）患者發(fā)病的主要原因［3］。雖然手術(shù)治療、化學(xué)治療、局部消融、分子靶向治療等治療手段顯著提高，但由于早期癥狀隱蔽、發(fā)展快、侵襲強(qiáng)，肝癌患者平均生存時(shí)間仍然很短［4］。因此，迫切需要深入了解肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，以提高臨床的治療效果。

中性粒細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵參與者。中性粒細(xì)胞通過(guò)吞噬、脫顆粒、產(chǎn)生活性氧（ROS）和中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NET）等不同機(jī)制來(lái)捕獲或降解入侵的病原體［5］。然而，中性粒細(xì)胞可以增強(qiáng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的黏附性，通過(guò)分泌細(xì)胞因子和釋放NET，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［5］。Brinkmann 等（2004 年）首次報(bào)道了IL-8、佛波酯或脂多糖刺激中性粒細(xì)胞后形成NET。NET 是由解聚的染色質(zhì)和顆粒蛋白組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有捕獲和殺死病原微生物的作用［6］。NET 的形成被描述為一種獨(dú)特的程序性細(xì)胞死亡方式，這一過(guò)程被稱(chēng)為中性粒細(xì)胞炎性凋亡（NETosis）［7］。據(jù)報(bào)道，NET 在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及癌癥相關(guān)血栓形成中發(fā)揮著重要的作用［8］。因此，本研究首先闡述了NET 的形成機(jī)制。其次，探討了NET 在肝癌生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移以及癌癥相關(guān)血栓形成中的作用。筆者將根據(jù)最新的發(fā)現(xiàn)總結(jié)NET 在肝癌中的研究進(jìn)展，為抗腫瘤治療提供新的思路和方法。NET 作為抗腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，在未來(lái)研究中具有廣闊的前景。

一、NET 的概述

1. NET 結(jié)構(gòu)和形成

Takei 等（1996 年）首次報(bào)道了NET。NET 主要是核DNA 和顆粒蛋白組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)上裝飾有中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）、髓過(guò)氧化物酶（MPO）、組織蛋白酶G（CG）、白細(xì)胞蛋白酶3、乳轉(zhuǎn)鐵蛋白（LTF）等。高分辨掃描電子顯微鏡顯示，NET 由直徑為15～17 nm 的纖維和25～50 nm 聚集復(fù)合體的球形結(jié)構(gòu)組成。迄今為止，多項(xiàng)研究已經(jīng)揭示了NET 形成的不同途徑。在粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子、脂多糖或補(bǔ)體因子5a（C5a）刺激后，中性粒細(xì)胞以ROS 依賴(lài)的方式釋放線粒體DNA 產(chǎn)生NET，NET 的產(chǎn)生促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位［9］。在金黃色葡萄球菌和佛波酯的刺激下，中性粒細(xì)胞核小葉形態(tài)消失，核膜破裂，去濃縮的染色質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)和顆粒成分混合，內(nèi)膜喪失導(dǎo)致細(xì)胞器消失，隨后釋放NET到細(xì)胞外空間，它的形成依賴(lài)于NADPH 氧化酶（NOX）產(chǎn)生的ROS［10］。在NETosis 形成過(guò)程中還涉及不同的受體，如Toll 樣受體（TLR）、NOD 樣受體、補(bǔ)體受體和趨化因子受體等［11］。

2. NET 形成的機(jī)制

2.1 NOX 依賴(lài)性NETosis

NET 的形成過(guò)程始于病原體和多種物質(zhì)的刺激，如佛波酯、抗體、膽固醇晶體、脂多糖、IL類(lèi)等，這些外來(lái)刺激激活中性粒細(xì)胞表面的特異性受體，細(xì)胞表面受體的激活導(dǎo)致蛋白激酶C（PKC）/Raf/MEK/ERK 激酶信號(hào)通路的活化和gp91phox 磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加，從而激活NOX 的活性，隨后產(chǎn)生ROS［12］。ROS 的產(chǎn)生觸發(fā)NE 和MPO 解離。NE 從膜相關(guān)復(fù)合物解離進(jìn)入胞漿，并依賴(lài)于MPO 激活其蛋白水解活性。在細(xì)胞質(zhì)中，NE 可結(jié)合并降解F 肌動(dòng)蛋白，然后再?gòu)氖忍烨囝w粒轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核。在那里NE 可降解部分核小體組蛋白，促進(jìn)DNA 濃縮。隨后，MPO 消耗過(guò)氧化氫（H2O2）生成次氯酸，協(xié)同增強(qiáng)染色質(zhì)解聚。解聚的染色質(zhì)進(jìn)入胞質(zhì)， GSDMD 誘導(dǎo)質(zhì)膜破裂，驅(qū)動(dòng)染色質(zhì)排出細(xì)胞外空間，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞死亡，釋放出NET。此外，在這個(gè)過(guò)程中，肽基精氨酸脫亞胺酶4（PAD4）也被激活，在中性粒細(xì)胞中PAD4 高表達(dá)，催化組蛋白精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，導(dǎo)致染色質(zhì)去濃縮，核腫脹，核膜和質(zhì)膜通透性增加，核層粘連蛋白形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，核膜和質(zhì)膜破裂并釋放細(xì)胞外DNA［13-14］。這個(gè)過(guò)程也稱(chēng)為NOX 依賴(lài)性NETosis。

2.2 NOX 非依賴(lài)性NETosis

中性粒細(xì)胞在金黃色葡萄球菌、革蘭陽(yáng)性桿菌等刺激下，迅速釋放NET，這一過(guò)程中性粒細(xì)胞經(jīng)歷了明顯的形態(tài)變化，表現(xiàn)為多葉細(xì)胞核變圓并濃縮，內(nèi)、外核膜分離，囊泡出芽，囊泡內(nèi)充滿核DNA，然后將DNA 釋放到細(xì)胞外空間。整個(gè)過(guò)程是一種獨(dú)特的、快速的，不依賴(lài)于NOX 的途徑。重要的是，在NET 釋放后，中性粒細(xì)胞質(zhì)膜未破裂，且無(wú)核中性粒細(xì)胞仍然存活并保持遷移和吞噬能力。此外，在微生物、鈣離子載體A23187 和離子霉素等刺激下，中性粒細(xì)胞表面特異性受體（TLR4、TLR2 受體和補(bǔ)體受體3）被激活，與配體結(jié)合觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增加，然后打開(kāi)質(zhì)膜鈣通道，觸發(fā)了中性粒細(xì)胞中線粒體ROS 的產(chǎn)生，并激活了小電導(dǎo)鈣激活鉀離子（SK）通道和PAD4［10］。PAD4 是一種瓜氨酸蛋白酶，它被激活后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，在那里PAD4 將精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，瓜氨酸化的組蛋白所帶正電荷減少，降低了組蛋白與帶負(fù)電荷DNA 之間的親和力，組蛋白從DNA 中解離，導(dǎo)致緊密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)喪失，最后染色質(zhì)解聚［15］。這被認(rèn)為是形成NOX 非依賴(lài)性NETosis 所必需的。此外，中性粒細(xì)胞用粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子與脂多糖或C5a 聯(lián)合刺激時(shí)，NETosis 的形成依賴(lài)于線粒體以ROS 的方式釋放DNA。使用ROS 抑制劑二苯基氯化碘鹽時(shí)，發(fā)現(xiàn)在相同條件下中性粒細(xì)胞線粒體DNA 釋放完全阻斷。因此，形成這種NET 的釋放被認(rèn)為是線粒體NET 或者NOX 非依賴(lài)性NETosis［16］。

二、NET 與肝癌

NASH 是發(fā)展為肝癌的重要危險(xiǎn)因素。據(jù)報(bào)道，NASH 患者血清中NET 標(biāo)志物水平明顯升高。van der Windt 等（2018 年）研究顯示，在STAM小鼠模型中，肝臟中可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和NET 的形成，NET 的釋放導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生和肝癌進(jìn)展。然而，脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）減少了STAM 小鼠中浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞和炎癥因子的產(chǎn)生，抑制NASH 向肝癌進(jìn)展。此外，在NASH 相關(guān)的HCC（NASH-HCC）中，NET 與幼稚的CD4+T 細(xì)胞表面TLR4 受體相互作用，啟動(dòng)代謝重編程，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tr）分化，重塑免疫抑制微環(huán)境，促進(jìn)NASH-HCC 的發(fā)生和發(fā)展。然而，在體內(nèi)使用PAD4-/-小鼠或DNase I 可阻斷NET 的形成，降低Tr 細(xì)胞的活性，預(yù)防NASH-HCC［17］。

肝癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是全球癌癥死亡的主要原因。Yang 等［18］在肝癌患者血清和腫瘤組織中觀察到NET 標(biāo)志物MPO-DNA 水平明顯高于健康對(duì)照組。MPO-DNA 是癌癥患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期和總體生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)標(biāo)志物［19］。最近相關(guān)研究報(bào)道，在肝癌患者中，中性粒細(xì)胞以線粒體ROS 依賴(lài)的方式形成富含線粒體DNA 的NET，這些NET 可觸發(fā)腫瘤炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［20］。然而，NET 對(duì)肝癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移以及癌癥相關(guān)血栓的形成中的具體機(jī)制知之甚少。Tohme 等（2016 年）報(bào)道，腫瘤細(xì)胞可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放NET 促進(jìn)手術(shù)應(yīng)激后肝臟轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展。NET 的主要成分DNA（NET-DNA）與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。NET-DNA 可能作為一種趨化因子來(lái)吸引腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移?？缒さ鞍證CDC25 是腫瘤細(xì)胞上的一種NET-DNA受體，可感知胞外DNA，隨后激活I(lǐng)LK-β-parvin-RAC1-CDC42 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞黏附、增殖和遷移。敲除CCDC25 基因顯著抑制了NET 對(duì)腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移和細(xì)胞骨架重塑。使用DNase I 處理荷瘤小鼠，防止了NET 的形成和肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生［21］。在小鼠肝臟缺血/再灌注（I/R）模型中，血小板TLR4 以ERK5/整合素GP Ⅱb/Ⅲ a 依賴(lài)的方式誘導(dǎo)血小板活化和血小板-腫瘤細(xì)胞聚集體的形成，促進(jìn)NET 捕獲循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞和手術(shù)應(yīng)激后的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。敲除TLR4 可以使小鼠免受肝臟I/R 模型中NET 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移潛能［22］。在盲腸穿刺不結(jié)扎的裸鼠模型中，中性粒細(xì)胞釋放的NET 激活了TGF-β 信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞外滲，并植入肝臟和腹膜中，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。使用TGF-β 通路抑制劑LY2157299 可明顯抑制肝臟和腹膜轉(zhuǎn)移［23］。在體外，腫瘤浸潤(rùn)性中性粒細(xì)胞通過(guò)糖酵解和磷酸戊糖途徑激活NOX-ROS 信號(hào)通路觸發(fā)NET 的形成，NET 誘導(dǎo)HepG2 腫瘤細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移［24］。此外，肝癌細(xì)胞來(lái)源的CXCL8/IL-8 以NADPH 依賴(lài)的方式觸發(fā)中性粒細(xì)胞釋放NET，與NET 相關(guān)的CG下調(diào)了E-鈣黏蛋白的表達(dá)，增加體外炎癥因子水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。阻斷PAD4 或抑制CG，減少了NET 的形成，削弱了肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［25］。

門(mén)靜脈血栓形成是HCC 患者預(yù)后不良的主要因素。據(jù)報(bào)道，HCC 患者，尤其是門(mén)靜脈癌栓和肝外轉(zhuǎn)移患者血清中MPO-DNA 水平明顯高于健康對(duì)照組，并與肝癌的惡性進(jìn)展有關(guān)［25］。Seo 等（2019年）在HCC 合并肝硬化患者中發(fā)現(xiàn)，接觸系統(tǒng)標(biāo)志物水平（Ⅻa）隨著NET 的形成而逐漸升高，并與肝病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，這些標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)是肝癌患者門(mén)靜脈血栓的重要危險(xiǎn)因素。NET 在肝臟I/R 后激活血小板誘導(dǎo)全身高凝狀態(tài)，導(dǎo)致遠(yuǎn)處器官損傷和免疫血栓形成。然而，利用DNaseⅠ處理小鼠，減少了中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，阻止了NET 的形成，減輕和緩解肝臟I/R 后全身高凝狀態(tài)和遠(yuǎn)處器官微血栓形成［26］。

三、結(jié) 論

最初NET 被認(rèn)為是一種捕獲和殺死病原微生物的防御系統(tǒng)。然而，近年來(lái)相關(guān)研究表明，NET在多種惡性腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。本文主要闡述了NET 的形成機(jī)制以及其在肝癌中的作用，如上所述，某些外來(lái)刺激或細(xì)胞因子觸發(fā)NET 的形成，NET 可以通過(guò)激活下游信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。另外，NET 可以充當(dāng)血栓支架，捕獲和激活循環(huán)中的血小板，促進(jìn)癌癥相關(guān)血栓形成。靶向NET 是一種有前途的抗腫瘤治療策略。深入了解NET 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制，對(duì)抗腫瘤的治療具有重大意義，為治療方案的設(shè)計(jì)和新藥物開(kāi)發(fā)提供新思路。然而，目前關(guān)于NET 在肝癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和癌癥相關(guān)血栓形成的機(jī)制屈指可數(shù)，在未來(lái)需要更多的臨床、體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究NET 與肝癌及其微環(huán)境的關(guān)系。