張 茜，李 新，關雅靜

（寧夏農林科學院農業(yè)生物技術研究中心，寧夏銀川 750002）

玉米傳入中國400 多年來飛速發(fā)展，種質資源舉足輕重。高產、優(yōu)質和抗病蟲的優(yōu)質基因是提高作物產量的重中之重[1]。在傳統(tǒng)的育種工作中，育種范圍相對狹窄，操作精準度較低，良莠混雜，無法準確選擇，實際的選育周期較長，并且選育效果也不理想。

1 轉基因技術在玉米遺傳育種中的應用現(xiàn)狀

1.1 基因工程的進展及應用概況

20 世紀80 年代，RELP 標記構建連鎖圖被首次提出，各種遺傳標記技術也取得了迅猛發(fā)展，并逐漸運用至動植物遺傳領域中。1983 年，世界上第一例轉基因植物在美國培育成功，轉基因技術研究日新月異，研究水平不斷提高，品種培育呈代際特征，對農業(yè)科技和生產力的發(fā)展具有強大的推動作用，轉基因商業(yè)化種植滲透程度加深，引領我國的育種行業(yè)進入了全新的發(fā)展時代。轉基因技術的方法眾多，主要包括農桿菌介導法、基因槍介導轉化法和花粉管通道法等，其中，基因槍法是最常用、最有效的DNA 導入技術[2]?；蚬こ碳夹g的廣泛運用，對玉米品種改良、玉米病蟲害抗性等具有積極意義。

1.2 分子標記技術在玉米遺傳育種中的運用

玉米是運用分子標記技術最早的作物之一，并且在長時間的發(fā)展與實踐中取得了不錯的運用成果。在20 世紀80—90 年代，玉米分子標記技術的研究主要停留在理論研究階段，研究成果為后續(xù)的實踐奠定了理論基礎。20 世紀90 年代以后，分子技術在實踐中的應用開始增多，研究方向發(fā)生改變，以重要基因的定位研究為主。分子輔助標記有著明顯的優(yōu)越性，可追蹤分子活動過程，直接以DNA 形式表現(xiàn)，加之受到外界因素影響較小，其發(fā)展較為迅速，種類不斷增加。目前，我國已開發(fā)運用的分子標記技術包括RELP、RAPD、AFLP 和SSR 等種類。

1991 年，世界上第一張玉米RFLP 連鎖圖譜被成功構建，但其標記相對較少，僅有50 個。在后續(xù)的研究中，相關科學家又增加標記了217 個位點，借助B-A易位系，定位在染色體上。較其他標記而言，SSR 標記發(fā)展起步較晚，發(fā)展時間較短，但其以顯著的優(yōu)勢，發(fā)展迅速并且運用廣泛。1994 年，某科學家利用（DE811×B73）組合，標記了32 個SSR 位點。借助分子標記圖譜，育種者能夠選擇目標性狀的基因型，合理選擇育種方法，進而提高育種計劃的科學性，提高玉米的產量與質量。1994 年，某科學家鑒定3100 個頂交（B73×Mo17）的F4，發(fā)現(xiàn)其中有5 個QTL 對籽粒重量有多效性，主要在1、2、5、9 號染色體上，效應最大的基因位于9 號染色體的短臂上。目前，科學家利用RFLP 等技術已經標記了玉米的許多重要性狀，如生育期、品質、抗性等，覆蓋了整個基因組，為基因工程在玉米遺傳育種中的運用提供了可靠保障[3]。

2 轉基因技術在玉米遺傳育種中的主要方法

在利用轉基因技術的過程中，轉基因方法也越來越多。相關人員需結合實際需要，合理選擇轉基因方法，以達到預期目標。

2.1 農桿菌介導轉化方法

農桿菌介導法是研究最深入、使用最廣泛的遺傳轉化方法。目前已經獲得的轉基因植物中60%以上都是由農桿菌介導法生產的，可運用到玉米轉基因操作中的主要有根癌農桿菌、發(fā)根農桿菌。其中，Ti 質粒的研究最多，是現(xiàn)在轉基因技術中最常用的方法，可成功侵染到玉米中，在植物根部或莖基部傷口處形成冠癭瘤。農桿菌介導法中，Ti 質粒侵染玉米，T-DNA 從質粒上脫離下來，被插入到該植株的基因中，并且后代不會發(fā)生性狀分離，能夠穩(wěn)定遺傳，但是并不會植入到植株細胞中，形成一個遺傳轉化系統(tǒng)。

現(xiàn)階段，農桿菌介導法主要用于雙子葉植物和裸子植物的遺傳轉化[4]。該方法通過使農桿菌載體與植株體分生組織和生殖器官接觸來完成遺傳轉化。接觸可以通過真空滲透法、浸蘸法或注射法完成，然后利用組織培養(yǎng)、抗生素篩選和分子檢測培養(yǎng)和分離轉基因的子代植株。農桿菌介導法的技術特點為技術成熟、操作簡單、快速，且成本低，容易掌握，外源基因低拷貝，轉化率高，可有效避免基因沉默現(xiàn)象，整合率高，篩選可靠，是目前制備轉基因植物成功率最高的方法，在植物遺傳轉化中運用廣泛。

2.2 基因槍介導轉化法

基因槍介導轉化法是除了農桿菌轉化法外使用最廣泛的遺傳轉化技術?；驑屢脖环Q為生物彈道技術，借助壓縮氣體產生的沖擊波，將粘有DNA 的細微金粒高速射入受體細胞或組織中，穿過層層結構，直至到達細胞核。粘有DNA 的微粒在進入細胞后，會被整合到宿主的細胞DNA 上，發(fā)生基因突變，完成基因轉移的目的[5]?；驑尫ㄗ钤邕\用于20 世紀90 年代，該種方法的優(yōu)勢顯著，不受物種和轟擊部位限制，不需要重復培養(yǎng)原生受體，操作簡單快捷，命中率高，轉化時間短，無細胞特異性，不依賴基因型，受體材料、靶細胞來源廣泛。但是該種方法也存在一定的弊端，如對玉米細胞造成損害、嵌合體多、轉化成本高、遺傳性不穩(wěn)定、隨機性太強和整合效率低等。

2.3 花粉管通道法

花粉管通道法在我國應用十分廣泛。其原理為利用植物天然授粉過程中花粉粒萌發(fā)形成的花粉管通道，通過花粉管通道，在自花授粉階段將外源基因導入囊胚，使植株直接產生遺傳轉化后的種子。花粉管通道法的技術特點是不需要組織培養(yǎng)誘導，轉化后可直接得到種子，對設備要求低，轉化率高，可大批量轉化，利用植物天然授粉條件，適用作物類型廣泛。同時，該種方法操作簡單、很容易實施、育種周期短，可以轉化任何基因型材料，并直接運用到常規(guī)育種中。此外，還有改進的花粉管通道技術，選取自交授粉后的玉米果穗，時間以授粉后18～26 h 為宜，留下2 cm 的花絲，其余剪除，使用酒精消毒處理，沿穗軸將玉米花莖基部的葉子平均切成3 份，剝開，剪去部分花絲，滴加外源DNA溶液，使外源DNA 直接進入幼胚，以降低遺傳變異的概率。但是，由于玉米花絲通常較長，且長短不一，操作難度較大，加之授粉時間的限制，導致外源DNA 片段上限受限，外源DNA 隨機整合的偶然性大，從而使其應用受限。

3 轉基因技術在玉米遺傳育種中的培育種類

轉基因技術在我國各行各業(yè)中運用均較為廣泛，尤其是在農業(yè)中發(fā)展已經相對較為成熟。玉米是我國第一大糧食作物，有著悠久的種植歷史，但其深受病蟲害的影響，是千百年來難以解決的“頑疾”。近年來，世界各國的農業(yè)公司均紛紛推出了培育的轉基因玉米品種，玉米種植面積不斷擴大，正逐漸形成商業(yè)化種植模式，獲得了良好的經濟效益和社會效益。以下進行詳細闡述。

3.1 抗蟲轉基因玉米

據(jù)統(tǒng)計顯示，嚴重蟲害可導致年份減產30%，嚴重病害導致平均減產10%。我國作為農作物病蟲害多發(fā)區(qū)和重發(fā)區(qū)，受玉米螟為害顯著，造成的玉米損失重大。在種子包衣中噴灑化學殺蟲劑，能夠預防部分侵蝕幼芽期的害蟲，一般不會對種芽造成傷害。但在植株生長過程中噴灑殺蟲劑，則會對生態(tài)平衡造成影響，破壞生態(tài)環(huán)境，造成農藥污染等問題。在傳統(tǒng)的抗螟品種培養(yǎng)方法中，育種周期長，并且實際的育種效果也不佳。因此，科學家們開始探索更加安全、有效和經濟的生物防治技術，經過不斷嘗試，蘇云金芽孢桿菌（Bt）表現(xiàn)出優(yōu)異的抗蟲效果。但是該種基因只對鱗翅目害蟲具有毒害作用，且在光照作用下容易分解，效果持續(xù)時間較短，在實際的田間操作中較為困難，難以作為商品制劑批量生產。

Bt 基因作為一種抗蟲基因，能夠在玉米包衣和植株的生長過程中代替化學殺蟲劑的功效[6]。Bt 芽孢在形成過程中會分泌毒蛋白，以原毒素的形式存在于體孢晶體中。該種原毒素在玉米植株體內一旦被蟲體攝取，則會破壞昆蟲的腸道環(huán)境，在微堿性環(huán)境下，產生毒性肽鏈分子，在蟲體腸道表面產生受體，起到有效的抵抗作用，使幼蟲停止進食，直到死亡，可使玉米產量平均增加9%。害蟲在取食玉米時，則會將該種蛋白攝取進“肚中”，在堿性腸道環(huán)境下被活化，進而殺死害蟲。而CpTL 基因對玉米螟、鞘翅目玉米根葉蟲、雜擬谷盜和直翅目蝗蟲等均具有抗性。

傳統(tǒng)的玉米除蟲措施一般使用化學殺蟲劑，但殺蟲劑對益蟲也有較強的殺傷力，且長期大量使用化學殺蟲劑不僅會造成環(huán)境污染，加劇生態(tài)環(huán)境破壞，還會導致農藥殘留，容易引起人畜中毒。而依靠轉基因玉米，則能夠彌補傳統(tǒng)化學殺蟲劑使用的弊端，并且防治效果較好。同時，為了避免或延緩害蟲產生抗藥性，還需采取相應的防治措施，例如，混種部分普通玉米種子，或繼續(xù)篩選高抗蟲性雜交種。

3.2 抗除草劑玉米

玉米田間雜草對玉米的穩(wěn)產、高產均具有不利影響，在農業(yè)生產中，除草劑的使用越來越普遍，能夠節(jié)省勞動力、提高勞動效率、保護土壤結構。但是，在使用除草劑的過程中，也會在一定程度上對玉米植株造成傷害，污染生態(tài)環(huán)境。在玉米植株的生長過程中，將抗除草劑轉基因技術運用其中，可保證玉米健康生長，減少除草劑對玉米植株的傷害，降低種植成本，實現(xiàn)無公害除草，提高玉米產量，有助于節(jié)省人力、物力。

其中，IMI 作為一種優(yōu)質的抗除草劑玉米，具有非常強的耐受性，除草劑能夠直接噴灑在玉米植株上，對1 年生雜草、寬葉雜草的生長均具有良好的防治效果。

3.3 改良玉米類蛋白轉基因玉米

玉米作為一種糧食作物與經濟作物，其產量雖然較為可觀，但整體品質卻不容樂觀，玉米蛋白質中賴氨酸含量較低。在轉基因技術研究的過程中，通過將外源基因導入普通玉米中，可得到優(yōu)良性狀的玉米。由于玉米中賴氨酸較少，科學家利用農桿菌介導法，將富含賴氨酸的馬鈴薯蛋白質基因導入玉米內，使玉米產量顯著提升[7]?；诖耍芯咳藛T開始將更加優(yōu)良的基因導入玉米植株中，以提高玉米中氨基酸的含量。

4 轉基因技術在玉米遺傳育種中的應用分析

4.1 基因工程在玉米遺傳育種中存在的問題

通過上述分析可以發(fā)現(xiàn)，轉基因技術在實際的玉米遺傳育種運用中仍存在一定的問題。例如，害蟲對Bt作物產生抗性，為了解決該問題，在種植玉米時，選擇抗蟲性轉基因玉米與普通玉米混種，可以有效治理害蟲抗性。CpTL 基因在使用中需要具備高效的表達條件，這也給轉基因技術的實施帶來了較大挑戰(zhàn)，研究人員還需進一步加深對不同調控機理的研究。同時，利用植物凝聚素基因實施基因工程的研究發(fā)展時間較短，其獲得的基因植株安全性有待進一步證實。在環(huán)境方面，基因工程對生態(tài)環(huán)境的影響性研究還需進一步加強，而在轉化率方面，也存在基因轉化率較低、遺傳不穩(wěn)定的問題。

現(xiàn)階段，我國的基因組研究已經取得巨大成果，已獲得的轉基因植株均是在長時間的大量研究基礎之上得到的轉化體克隆，具有很強的基因型依賴性，再生頻率較低。同時，受到歷史條件與現(xiàn)有研究水平的限制，我國轉基因玉米產業(yè)化亟須突破，需引起高度重視，想在短時間內趕超發(fā)達國家任重道遠。

4.2 基因工程在玉米遺傳育種中的發(fā)展應用

種植轉基因作物可提高社會效益與經濟效益、有效控制靶標害蟲和作物害蟲、保持產量穩(wěn)定、降低化學農藥的噴灑、減少環(huán)境污染、降低種植成本、提高農產品質量、提升農產品競爭力。隨著轉基因玉米工程的進一步發(fā)展，我國的轉基因玉米種植面積逐年提高，在提高肥料利用效率、防治病蟲害、克服土壤逆境、免耕、高效除草和降低勞動力成本等方面均具有重大意義，是解決現(xiàn)代農業(yè)重大問題的戰(zhàn)略性技術。目前，轉基因玉米安全性的爭論焦點主要集中在3 個方面。一是國際貿易與對人類的潛在影響；二是環(huán)境倫理和社會倫理與宗教問題；三是“標簽風波”，近年來，轉基因食品標簽問題在國際上一度引發(fā)激烈爭論[8]。為此政府部門需加強轉基因安全管理，完善相應的技術支撐體系，遴選相關領域的專家，組建安全委員會，展開轉基因作物安全評價與安全咨詢工作。重視并嚴格規(guī)范生物安全評價工作，相關研究人員需積極承擔社會責任、倫理責任，嚴格遵照相關法規(guī)，保證轉基因生物試驗研究的規(guī)范性，公眾、科學家與政府需攜手共進，維護轉基因技術的安全應用，推動其良性發(fā)展。

5 結束語

過去，玉米所到之處，都給當?shù)貛砹朔睒s，現(xiàn)在、未來，亦是如此。玉米作為全球第一大糧食作物，有170 多個國家種植玉米。隨著全球化的推進，科研、企業(yè)的同場競技愈發(fā)激烈，玉米產業(yè)迎來了新的機遇，更面臨著全新挑戰(zhàn)。生物育種勢頭正猛，如何創(chuàng)制優(yōu)質種質資源、研究飼用玉米已成為廣大育種工作者需要解決的關鍵問題。農業(yè)生產的發(fā)展，良種是關鍵，借助轉基因技術可實現(xiàn)基因重組，提高優(yōu)良品種的選育效率。在具體實踐過程中，相關人員還需在已有研究成果的基礎上，結合實際情況，加強新型品種的研究，加深對玉米自交系、雜交系和農家品種的遺傳多樣性的研究，重點選擇關鍵性狀進行基因定位作圖，加強種質創(chuàng)新，提高育種效率。在加強轉基因技術研究的同時，需密切關注轉基因玉米的安全性，評估其對生態(tài)環(huán)境的影響，使轉基因技術走向適用化。