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        長鏈非編碼RNA NONHSAT017458在結腸腫瘤中表達的研究

        2023-04-04 04:26:34程諾陳鳳媛楚艷沈云海馮潔潘勤聰
        貴州醫(yī)藥 2023年2期
        關鍵詞:共表達高通量腺瘤

        程諾 陳鳳媛 楚艷 沈云海 馮潔 潘勤聰△

        (1.復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院消化內科,上海 200240;2.上海市浦南醫(yī)院,上海 200125)

        結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界上常見的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病率占腫瘤中的第三位,也是第二大癌癥死亡原因[1]。在中國,結腸癌也是癌癥發(fā)病率及死亡率前五位的惡性腫瘤之一[2]。隨著我國人民生活水平和飲食習慣的提高,結直腸癌在我國的發(fā)病率也呈上升趨勢。從1990年到2016年,中國年齡標準化CRC的患病率估計從1990年的14.25/10萬增加到2016年的25.27/10萬[3]。它嚴重威脅著社會的發(fā)展以及人們的健康和生活。早期發(fā)現和治療可有效改善大腸癌患者的預后和長期生存率。目前,結直腸癌除內鏡檢查和病理檢查外,尚缺乏有效的早期診斷和干預治療。深入探討結直腸癌的分子機制,確定有效的治療靶點,對提高患者的生存率和生活質量至關重要。近年來研究認為長鏈非編碼RNA(Long NON-Coding RNA,lncRNA)在結腸癌中起到重要作用。lncRNA被定義為不編碼蛋白質的長度大于200個核苷酸的RNA轉錄本,它們本身就是功能單位,因此它們的亞細胞定位對其功能至關重要[4]。根據功能不同,lncRNA分為3種類型:(1)lncRNA是功能性生物分子并與細胞中的其他成分相互作用,例如DNA、蛋白質或RNA;(2)基因調控元件嵌入在lncRNA基因的轉錄體中,并且其活性lncRNA基因指導調控元件的活性;(3)轉錄過程影響基因組,從而影響基因活性[5]。LncRNAs參與了廣泛的細胞機制,從基因表達的幾乎所有方面到蛋白質翻譯和穩(wěn)定性。關于lncRNA作用的研究增加證明了這些轉錄物在表達調控中的關鍵作用。迄今為止,已經發(fā)現許多l(xiāng)ncRNA在結腸癌中具有顯著異常表達,其中包括MEG3、H19、SNHG6、BCYRN1、LINC01535等[6-10]。由于其癌癥特異性表達譜,lncRNAs的異常表達可作為結腸癌診斷和治療分層的可靠預后指標。LncRNA生物學的許多方面還不清楚,可能為我們提供一個新的視角的復雜性調控網絡。因此,本研究旨在深入了解與結腸腺瘤和結腸癌相關的lncRNA。同時就其中表達顯著差異的lncRNA NONHSAT017458進行組織學上驗證及臨床相關性分析。報告如下。

        1 材料與方法

        1.1一般資料 收集2021年1月至2021年12月在上海市第五人民醫(yī)院消化內科接受腸鏡檢查的結腸腺瘤及結腸癌患者(各10例,剔除2例結腸腺瘤組質檢不合格)。分別留取其腫瘤組織及相鄰正常組織的樣本,取完立即放入RNA保存液中并放置于-80℃冰箱保存。所有患者在檢查前都沒有接受任何其他治療且未患有其他系統腫瘤及嚴重疾病。所有患者疾病診斷嚴格經上海市第五人民醫(yī)院病理科的兩名病理學專家明確。本研究經復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院倫理委員會批準,倫理審批號為(2020)倫審(010備)。所有患者均簽署知情同意書。見表2。

        表1 結腸腺瘤患者基本信息

        表2 結腸癌患者基本信息

        1.2方法

        1.2.1高通量測序技術 本研究中高通量測序技術由上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司完成。運用TRIZOL的方法對樣本進行total RNA的提取,純化總RNA,抽取全部帶多聚A尾的RNA,進行genes的分離或者對rRNA進行去除及片段化、應用隨機引物和逆轉錄酶合成cDNA,隨后進行3’末端加A、連接接頭以及末端修復等一系列測序實驗步驟,從而完成測序樣本的文庫構建。選用paired-end程序,進行雙端測序,將帶有簇的flow cell上機并按照HiSeq 2 500提供的指南進行測序試劑的準備工作。由數據搜集軟件來進行數據分析以及控制測序的過程。

        1.2.2LncRNA NONHSAT017458與mRNA共表達分析 將樣本的轉錄組測序數據結果進行包含數據預處理、基因組比對、基因表達定量及表達分析、并對其進行GO/KEGG富集分析。GO/KEGG富集分析顯著性可用P值表示,當P≤0.05時,差異有統計學意義。P值越小,功能富集越顯著。此外,運用超幾何累積分布函數計算共表達mRNA注釋中的功能性術語的富集,并通過方法計算假發(fā)現率(false discoveryrate,FDR)。當P<0.05且FDR<0.05時被認為有統計學意義。

        1.2.3定量反轉錄聚合酶鏈反應驗證分析 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測lncRNA NONHSAT017458在大腸癌樣本中的表達。根據制造商的規(guī)格,使用TransScript All-in-One第一鏈cDNA合成SuperMIX從我們的樣品中提取總RNA用于qPCR試劑盒。使用NanoDrop 2000光譜儀(Thermo Scientific,USA)測定RNA的產量,并使用用凝膠電泳染色的瓊脂糖溴化乙錠評估完整性。使用2-ΔCt方法計算基因的相對表達水平。PCR在384孔光學板(羅氏,瑞士)進行30個循環(huán),每個循環(huán)在94℃下30秒,然后進行45個在94℃下5秒及60℃30秒的循環(huán)。使用的引物包括:

        表3 qRT-PCR的引物序列

        1.3統計學方法 本研究數據采用SPSS 22.0(IBM SPSS Statistics,USA)進行分析。使用 Pearson’s chisquare檢驗來評估lncRNA NONHSAT017458表達與臨床病理參數之間關聯的統計學意義。獨立樣本的t檢驗用于評估lncRNA NONHSAT017458的表達水平,P<0.05為差異有統計學意義。

        2 結 果

        2.1lncRNA NONHSAT017458高通量測序篩選及l(fā)ncRNA-mRNA共表達分析 在結腸癌組織與正常對照組中,利用高通量測序篩選出表達差異lncRNA NONHSAT017458(FC>50,P<0.05)。將差異表達的標準化數據制作成熱圖(圖1A)。我們對lncRNA-mRNA進行共表達分析發(fā)現其中與lncRNA NONHSAT017458相關的前20位基因分別列舉如下(圖1B):H19、THBS2、POMP、C6orf223、MMP11、CTHRC1、AP000349.1、SULF1、COL4A1、AQP1、IL-8、MZT1、SMCO2、SPON2、FSTL1、SPARC、GTF2F2、IGFBP7、COL4A2、EXOSC8。其中IL-8呈現表達差異最明顯。

        注:圖A:lncRNA差異表達熱圖;紅色代表高表達,藍色代表低表達;圖B:lncRNA NONHSAT017458共表達基因圖。圖1 結腸癌組織中差異lncRNA表達譜及l(fā)ncRNA NONHSAT017458共表達基因

        2.2lncRNA NONHSAT017458的功能分析 為了探索介導結腸癌發(fā)生發(fā)展的生物學過程,對差異表達基因進行了分子功能分析。其揭示了多種生物過程,細胞組分和分子功能的參與。使用基因本體(GO)分析,我們通過P值確定lncRNA NONHSAT017458每個結構域中10個最顯著富集的術語。在結腸癌中,這些結構域分為生物過程、細胞組成及分子功能三部分(圖2)。其中細胞成分的重要術語包括含膠原蛋白的細胞外間質、細胞外空隙、內質網、基膜和胞外區(qū)等成分。對于分子功能,重要術語包括鈣整合素結合蛋白、蛋白質綁定、細胞外間質裝訂及血小板衍生生長因子結合等。生物過程最重要的術語包括類血管生成的陽性調節(jié)、內皮細胞的正向調節(jié)、膠原分解代謝過程、細胞蛋白質代謝和細胞外間質拆卸等過程。KEGG通路分析顯示(圖3),lncRNA NONHSAT017458涉及相關的通路,其中細胞外基質(extracellular matrix,ECM)受體相互作用通路呈現明顯富集性,另外還包括有PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、IL-17信號通路,NF-kappaB(NF-kB)信號通路及TNF信號通路等。這些通路均可能參與結腸癌的致癌作用。見圖3。

        2.3lncRNA NONHAST017458的qRT-PCR驗證 基于高通量測序結果,本研究使用qRT-PCR進一步驗證lncRNA NONHAST017458表達水平。結果顯示在結腸癌組織中,lncRNA NONHAST017458表達水平明顯高于結腸癌旁正常組織(P<0.05)(圖4A)。與高通量測序中結腸癌中l(wèi)ncRNA NONHAST017458表達上調結果基本一致。在結腸腺瘤組織中,lncRNA NONHAST017458表達水平與腺瘤旁正常組織中無明顯差異(P>0.05)(圖4B),故與高通量測序中結腸癌中l(wèi)ncRNA NONHAST017458表達上調結果不一致。見圖4。

        注:圖A:CRC-normal代表結腸癌旁正常組織,CRC-Tumor代表結腸癌組織;圖B:CRA-normal代表結腸腺瘤旁正常組織,CRA-Tumor代表結腸腺瘤組織;與對照組相比:*P<0.05。圖4 結腸癌組織中l(wèi)ncRNA NONHSAT017458的qRT-PCR驗證

        2.4lncRNA NONHAST017458表達與結腸癌臨床病理參數的關系 lncRNA NONHAST017458表達情況與結腸癌患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤有無淋巴結轉移及遠處轉移均無明顯相關性(均P>0.05)(表4)。

        表4 患者臨床特征分布與lncRNA NONHSAT017458表達量的相關性

        3 討 論

        結腸癌是世界上常見的消化道惡性腫瘤,也是導致癌癥發(fā)病率和死亡率的第四大常見原因。目前研究認為飲食、微生物及其代謝物與結腸癌發(fā)生有關,但結直腸癌發(fā)生發(fā)展的機制尚不明確。LncRNA是那些有超過200個核苷酸(nt)并且不會被翻譯成蛋白質的RNA[11]。它顯示了在調節(jié)關鍵細胞功能,包括基因調控的轉錄,轉錄后和表觀遺傳機制的作用[12]。許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與lncRNA表達的異常調節(jié)有關。LncRNA在結腸癌中具有復雜的生物學功能,其具體的調控機制尚不清楚,有待進一步研究。

        在本研究中,我們進一步運用高通量測序技術分析了結腸癌組織、結腸腺瘤組織以及正常對照組中的lncRNA表達譜,我們發(fā)現結腸癌與正常對比中呈現明顯基因表達差異。在對照組與結腸癌組中對比中,表達上調的lncRNA有35個(P<0.05,FDR<0.05)。其中l(wèi)ncRNA NONHSAT017458表達倍數是5.35*1011倍。在結腸腺瘤與結腸癌組中,表達上調的lncRNA有50個(P<0.05,FDR<0.05)。其中l(wèi)ncRNA NONHSAT017458表達倍數是4.56倍。對照組與結腸腺瘤組中,表達上調的lncRNA有2個(P<0.05,FDR<0.05),其中l(wèi)ncRNA NONHSAT017458(1.17*1011倍)。通過以上結果發(fā)現在結腸腫瘤中l(wèi)ncRNA呈現明顯表達差異,其中l(wèi)ncRNA NONHSAT017458表達差異最明顯。我們由此假設結腸癌的發(fā)生可能與lncRNA NONHSAT017458的異常調控密切相關。目前l(fā)ncRNA NONHSAT017458的功能機制尚不明確,我們通過GO分析和KEGG通路注釋分析lncRNA NONHSAT017458的潛在功能。GO分析顯示lncRNA NONHSAT017458參與生物過程、細胞組成及分子功能三部分。包括鈣整合素結合蛋白、蛋白質綁定、內皮細胞的正向調節(jié)、膠原分解代謝過程、細胞蛋白質代謝等過程。lncRNA NONHSAT017458異常調節(jié)通過這些生物學過程從而引起結腸癌發(fā)生發(fā)展。KEGG通路富集分析顯示lncRNA NONHSAT017458與PI3K-Akt信號通路、NF-kappaB(NF-kB)信號通路及TNF信號通路等通路相關,而這些通路在以往研究已充分證實與結腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[13-15]。我們針對我們進一步通過高通量測序篩選發(fā)現lncRNA NONHSAT017458有眾多的共表達基因,其中IL-8相關性最高。

        白介素-8(IL-8,也稱為CXCL8)是結腸癌中常見的一種細胞因子,屬于彈性蛋白樣重組體(ELR)+CXC趨化因子家族[16]。它通過對中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞的趨化作用及刺激中性粒細胞活性而引發(fā)炎癥反應[17]。IL-8啟動子的轉錄活性與NF-kB結合相關[18]。因此IL-8在腫瘤增殖、遷移和侵襲中起到重要作用。研究認為CXCL8(即IL-8)可通過PI3K/AKT/NF-kB信號軸誘導激活結腸癌誘導上皮間質轉化(EMT)的作用[19]。目前l(fā)ncRNA在結腸癌中行使復雜生物學功能,其詳細的調控機制尚不明確,仍有待深入研究。因此,本研究將進一步研究lncRNA在結腸癌中的調控作用,以明確與相關轉錄因子及通路之間的聯系。針對前期研究結果,我們通過高通量測序篩選出結腸癌中異常表達的lncRNA NONHSAT017458,并同時篩選出與lncRNA NONHSAT017458相關的轉錄因子及參與通路。我們可以將lncRNA NONHSAT017458其作為結腸癌發(fā)病機制的研究對象,研究lncRNA NONHSAT017458表達異常是否通過調控NF-kB通路中IL-8的表達從而引起結腸癌的發(fā)生發(fā)展。這可成為后續(xù)研究重點。目前我們已經在結腸癌組織中驗證其表達水平的變化。但它是否為結腸癌特異的lncRNA仍需要更多病例樣本來驗證,同時其在細胞中的表達情況以及如何參與通路并與轉錄因子作用的機制仍需進一步體內外實驗來明確。lncRNA NONHSAT017458在結腸癌中起到重要作用,后續(xù)有望成為結腸癌的早期診斷的分子標志物及預后評價指標,并為結腸癌的早期治療提供新的思路。

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