馬利霞

（ 開封市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗中心，河南 開封 475004 ）

飼料及飼料原料霉變是一個全球性的嚴(yán)重問題，其產(chǎn)生的黃曲霉毒素危害極大。黃曲霉毒素一般來自黃曲霉和寄生曲霉，目前已知的黃曲霉毒素有20余種，主要分為B1、B2、M1、M2、G1、G2等形式[1]，化學(xué)分子結(jié)構(gòu)相似，其中以黃曲霉毒素B1的毒性和致癌性最強(qiáng)。幾種主要黃曲霉毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 黃曲霉毒素B1、B2、M1、M2、G1、G2的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of aflatoxin B1、B2、M1、M2、G1、G2

黃曲霉毒素B1是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)苌铮哂袕?qiáng)致畸、致突變、致癌作用。一旦動物食用被黃曲霉毒素B1污染的飼料或飼料原料即可中毒[2]，并且其產(chǎn)生的副產(chǎn)物也含有黃曲霉毒素B1，可隨著食物鏈進(jìn)入人體和動物體內(nèi)，危害機(jī)體健康，進(jìn)而造成一定經(jīng)濟(jì)損失。許多國家、地區(qū)對黃曲霉毒素B1在飼料及飼料原料中的殘留限量進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定。國內(nèi)外有學(xué)者對飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1的分析檢測方法進(jìn)行了大量研究，目前檢測分為前處理和檢測技術(shù)等兩部分。本文對現(xiàn)有的黃曲霉毒素B1檢測方法展開綜述，為進(jìn)一步研究黃曲霉毒素B1新的檢測方法提供參考。

1 黃曲霉毒素B1的前處理方法

飼料及飼料原料種類多樣、基質(zhì)復(fù)雜，對黃曲霉毒素B1的準(zhǔn)確定量造成了較大干擾；而黃曲霉毒素B1痕量、高毒，往往需要一定樣品前處理技術(shù)將其從樣品中分離、富集。目前，黃曲霉毒素B1常用的前處理方法主要有溶劑萃取法、柱層析法、免疫親和柱法、固相萃取等方法[3]。

1.1 溶劑萃取法

溶劑萃取法利用黃曲霉毒素B1易溶于極性有機(jī)溶劑中的特性，從而將其從基質(zhì)中分離。飼料及飼料原料基質(zhì)復(fù)雜，常使用幾種有機(jī)溶劑的混合液提取樣品中黃曲霉毒素B1。然而在提取溶劑時往往會摻入少量雜質(zhì)，因此需接受相對應(yīng)的凈化處理，是任何操作不可缺少的第一步[4]。

傳統(tǒng)的溶劑萃取法存在一定的局限性，無法準(zhǔn)確地測定出飼料中殘留的黃曲霉毒素B1。以此方法為基礎(chǔ)進(jìn)行創(chuàng)新優(yōu)化生成了一些新的檢測方法，如加壓溶劑萃取法和分散溶劑微萃取法等，因溶劑萃取流程較為復(fù)雜，選擇性較低，基質(zhì)對此方法的影響較大，因而同樣存在一定的局限性。

1.2 柱層析法

柱層析法是利用黃曲霉毒素B1在層析柱中利用液-液分配的原理進(jìn)行提取，應(yīng)用較為廣泛。隨著凈化技術(shù)發(fā)展，已開發(fā)出專用的免疫親和柱。免疫親和柱是將黃曲霉毒素B1的抗體與活性固相載體結(jié)合制成層析柱，隨著凈化深入，黃曲霉毒素B1能夠迅速地與免疫親和柱的相關(guān)抗體進(jìn)行有效融合，后經(jīng)洗脫液脫附，完成樣品的凈化和濃縮富集[5]。尹安胤[6]采用免疫親和色譜柱檢測分析玉米中黃曲霉毒素B1，結(jié)果顯示其加標(biāo)回收率為88.5%～94.3%。現(xiàn)階段，在飼料及原料曲霉毒素B1測定時，免疫親和柱技術(shù)運用十分廣泛，但是該技術(shù)存在制備復(fù)雜、抗體易失活且抗體價格昂貴等缺點。

1.3 固相萃取法

固相萃取法是憑借材料對組分具有獨特的影響力，在試樣溶液中能夠輕松地保留下黃曲霉毒素B1，從而實現(xiàn)凈化與富集的操作目的，在檢測分析飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1的前處理中廣泛應(yīng)用。王巖松等[7]選擇免疫親和富集黃曲霉毒素B1的固相萃取柱，對谷物中殘留的黃曲霉毒素B1進(jìn)行測定分析，結(jié)果顯示，平均回收率為74.6%～89.6%，方法檢出限達(dá)到0.1 ng/g。

2 黃曲霉毒素B1的檢測方法

樣品前處理技術(shù)將黃曲霉毒素B1從樣品基體中分離且富集到合適的檢測濃度，之后通過合適的方法進(jìn)行檢測。目前黃曲霉毒素B1檢測方法有：色譜法、免疫分析法、電化學(xué)分析法、生物分析法等。

2.1 色譜法

色譜法是近年來飼料及飼料原料質(zhì)量分析中最富活力的領(lǐng)域之一，利用待測物質(zhì)中各組分在兩相中吸附-溶解性的差異進(jìn)行分配，最終將各組分區(qū)分開。色譜法具有分離效率高、分析速度快、樣品用量少等優(yōu)點，因而得到了廣泛應(yīng)用。色譜法主要包括薄層色譜法、液相色譜法、氣相色譜法等。

2.1.1 薄層色譜法

薄層色譜法是早期應(yīng)用最廣泛的黃曲霉毒素B1分析技術(shù)，也是我國測定黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。在國標(biāo)GB 5009.22—2016中規(guī)定，薄層板上黃曲霉毒素B的最低檢出量為0.0004 μg，檢出限是5 μg/kg，回收率75%以上。薄層色譜法的作用機(jī)制則是處于365 nm狀態(tài)下時黃曲霉毒素B1可出現(xiàn)大規(guī)模的藍(lán)色熒光，借助這一特性，基于具體樣品選取適宜的溶劑萃取，再在薄層板上層析展開、分離，對熒光具體強(qiáng)度進(jìn)行準(zhǔn)確測定，并對比標(biāo)準(zhǔn)品，從而準(zhǔn)確地計算出黃曲霉毒素B1含量。

隨著樣品純化技術(shù)和分析儀器不斷改進(jìn)，使得該方法得到完善。Hoeltz 等[8]選擇使用TLC+電感耦合檢測器聯(lián)合檢測的方案檢測花生中黃曲霉毒素B1，定量限設(shè)定為1.2 μg/kg，結(jié)果非常精準(zhǔn)。Kotinagu 等[9]選擇采用AOAC法對樣品中的黃曲霉毒素B1進(jìn)行提取，并使用高效薄層色譜法對其進(jìn)行測定，設(shè)定了4個熒光法波長的狀態(tài)，對其進(jìn)行定量檢測，所獲取的結(jié)果同酶聯(lián)免疫分析法完全吻合。薄層色譜法具有操作簡單、檢測迅速、檢測費用低等優(yōu)勢，然而其樣品前處理流程十分復(fù)雜，靈敏度較低，回收率與重復(fù)性差，不易完成自動化且樣品中其他熒光物質(zhì)易對檢測結(jié)果造成干擾，在飼料及飼料原料中痕量黃曲霉毒素B1的分析應(yīng)用受限，更適用于黃曲霉毒素B1的定性分析。

2.1.2 液相色譜法

液相色譜法廣泛應(yīng)用于黃曲霉毒素B1的檢測工作中，包括高效液相色譜法以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。

2.1.2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法是第一個用于檢測黃曲霉毒素B1的檢測方法，也是目前應(yīng)用較為廣泛的一種方法。高效液相色譜法借助檢測器分析黃曲霉毒素B1的含量，相關(guān)檢測器較多，如熒光、紫外、二極管陣列等，涉及畜牧、化工和食品等多個行業(yè)[10]。潘迎芬等[11]利用免疫親和層析凈化-高效液相色譜法檢測花生中黃曲霉毒素B1，其檢出限為0.5 μg/kg，回收率在70%～110%之間，精密度好，與國標(biāo)法相比，節(jié)省了大量前處理時間，有利于提高分析效率。此外，高效液相色譜法用于檢測大米、飼料、大豆、雞肝、魚、蝦等基體中的黃曲霉毒素B1均能夠取得不錯的結(jié)果。也有研究基于HPLC柱后衍生化構(gòu)建了針對花生黃曲霉毒素檢測的方法，并將其定量限制于0.11 μg/kg[12]。

高效液相色譜法的優(yōu)勢主要表現(xiàn)為檢測快、靈敏度高、可用于大批量樣品檢測中，不超過25 min 便可獲取檢測結(jié)果，且能夠回收與再次利用樣品溶液和色譜柱。但這一檢測方法所使用的儀器較貴，對檢測人員的專業(yè)技能要求十分嚴(yán)格，推廣難度大。

2.1.2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法則是借助液相色譜法的高分離效能、高選擇性、可提供分子結(jié)構(gòu)信息、前處理簡單等優(yōu)點，并利用質(zhì)譜檢測器對黃曲霉毒素B1檢測的適用性，成為目前較先進(jìn)的黃曲霉毒素B1檢測方法[13-14]。

胡莎等[15]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定小麥中的真菌毒素，內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正，黃曲霉毒素B1的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.5 μg/kg，加標(biāo)回收率在86.6%～110.1%，該方法滿足實驗室日常檢測。任宏彬等[16]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對黃曲霉毒素B1進(jìn)行測定，其檢測值控制在70 ng/kg，回收率為85.0%～94.1%，相對偏差小于等于5.5%。

目前，液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)日益成熟，靈敏度得到有效提升，樣品無須進(jìn)行稀釋，可有效預(yù)防凈化環(huán)節(jié)中損失目標(biāo)物的情況，不再依賴凈化材料，檢測投入費用相對有所降低。但這一檢測方法在離化環(huán)節(jié)中基質(zhì)的影響較明顯，對黃曲霉毒素B1的定量準(zhǔn)確度造成了影響，且儀器設(shè)備昂貴，檢測成本高，操作步驟復(fù)雜，導(dǎo)致普及率不高。

2.1.3 氣相色譜法

氣相色譜法則是借助載氣將氣化樣品輸入色譜柱中，經(jīng)過組分與固定的互相作用力之間的差異而實現(xiàn)分離。20世紀(jì)70年代，氣相色譜法開始應(yīng)用于霉菌毒素的檢測。氣相色譜法能夠?qū)γ咕舅剡M(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析[17]，且靈敏度高、檢測限更低，但該法只適用于分離檢測揮發(fā)性較大并且熱穩(wěn)定性較強(qiáng)的物質(zhì)。但黃曲霉毒素B1揮發(fā)性差，在一定程度上限制了氣相色譜法的應(yīng)用。

2.2 電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析法則是根據(jù)物質(zhì)所具有的電化學(xué)特性與相關(guān)變化，定量、定性分析組分，目前有越來越多的新型電化學(xué)分析技術(shù)出現(xiàn)，并廣泛應(yīng)用于檢測黃曲霉毒素B1的工作中[18]。

Mo 等[19]采用共價鍵結(jié)合的方法，將核酸適配體有效地固定于多孔陽極氧化鋁納米通道的表層中，對氧化石墨烯制備核酸適配體功能化的電化學(xué)傳感器進(jìn)行針對性修飾，并將檢測黃曲霉毒素B1的測定范圍控制在0.13 μg/L。Xiao 等[20]嘗試采用核酸適配體修飾的毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測食品中的黃曲霉毒素B1，在1×10-8～1×10-4g/mL 線性范圍內(nèi)，能滿足食品中痕量黃曲霉毒素B1 的測定。Xia等[21]則嘗試把多孔納米片作為熒光探針，以此為基礎(chǔ)研發(fā)了基于磁性納米顆粒的黃曲霉毒素B1免疫傳感器，檢測靈敏度、特異性高，檢測限確定在0.002 μg/L；還嘗試使用免疫分析技術(shù)對電化學(xué)傳感器進(jìn)行科學(xué)制備，準(zhǔn)確地測定霉菌毒素。Nabok 等[22]使用偏振衍射儀，以此為基礎(chǔ)研發(fā)了一種免疫傳感器，并結(jié)合了平面波傳導(dǎo)檢測原理，檢測限確定在0.01 μg/L。電化學(xué)分析法可高效率、精準(zhǔn)地檢測，且檢測靈敏度高，但重復(fù)性差、檢測器昂貴，廣泛應(yīng)用推廣難度較大。

2.3 熒光光度法

黃曲霉毒素B1熒光光度檢測技術(shù)根據(jù)黃曲霉毒素B1的熒光特性而研發(fā)，能夠?qū)S曲霉毒素B1進(jìn)行直接、高效率檢測。其方法是提取甲醇，并對樣品進(jìn)行稀釋與過濾處理，針對特異抗體對其予以免疫親和柱層析凈化，之后清除純凈水中的各種雜質(zhì)，并借助甲醇對其進(jìn)行洗脫處理，加入適量的溴，之后衍生并借助熒光光度計進(jìn)行準(zhǔn)確測定。熒光檢測法檢測費較低，操作便捷，無須同黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對比，對檢測人員的傷害較小，值得廣泛推廣。

2.4 免疫分析技術(shù)

免疫分析技術(shù)是基于抗原、抗體分子結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物的分析方法，具有選擇性、特異性、靈敏度高以及簡便快速等優(yōu)點[23]，包括酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法、免疫親和色譜儀器結(jié)合測定法及熒光偏振免疫檢測法等。

2.4.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫法選擇在酶標(biāo)板附上相關(guān)已知抗原，將酶標(biāo)記抗體與樣品進(jìn)行有效混合，兩者有效反應(yīng)后再將多余的抗體洗凈，添加適量酶底物，滋生出大量有色物質(zhì)，再滴入終止液，反應(yīng)停止，對抗原或抗體進(jìn)行光度檢測[24]。酶聯(lián)免疫法可精準(zhǔn)測量出黃曲霉毒素B1的具體含量，特異性相對較高，檢測流程簡單，結(jié)果分析比較簡單。

王潔蓮等[12]檢測小米中的黃曲霉毒素B1時使用酶聯(lián)免疫吸附法，檢出限可達(dá)0.1 μg/L，回收率達(dá)75%以上。陳旭明等[25]利用酶聯(lián)免疫吸附結(jié)合免疫親和柱-高效液相色譜法檢測大米中黃曲霉毒素B1，檢出限為0.50 μg/kg，回收率為89.4%～95.2%，結(jié)合應(yīng)用兩種方法適用于大批量樣品檢測。近年來，酶聯(lián)免疫法獲得很大改進(jìn)，建立了許多快速檢測方法，如黃曲霉毒素B1試劑盒、黃曲霉毒素B1試紙等。馬俊等[26]利用黃曲霉毒素B1-ELISA測試盒檢測飼料中黃曲霉毒素B1的含量，結(jié)果顯示，最低檢出限為0.1 μg/L，黃曲霉毒素B1的含量在5.0～30.0 μg/kg 時，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r=0.999 4，變異系數(shù)小于1%，回收率在94%～105.0%。酶聯(lián)免疫法靈敏度高、特異性強(qiáng)，干擾物少，提取環(huán)節(jié)較為便捷，能夠?qū)Υ笈繕悠吠瑫r進(jìn)行測定，且具有較高的回收率，值得廣泛推廣。但因為酶的活性受條件影響較大，測定結(jié)果穩(wěn)定性差，易出現(xiàn)假陽性，分析結(jié)果準(zhǔn)確性不高。

2.4.2 免疫層析法

免疫層析法是一種快速免疫分析技術(shù)，樣品借助毛細(xì)作用在條狀纖維膜上泳動，黃曲霉毒素B1與膜上特定區(qū)域的配體結(jié)合，通過酶促顯色或直接著色標(biāo)記。膠體金免疫層析以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，對單克隆抗體進(jìn)行精準(zhǔn)標(biāo)記，從而實現(xiàn)定性或定量檢測。劉曉玥等[27]利用膠體金免疫層析法進(jìn)行黃曲霉毒素B1的檢測，結(jié)果顯示，檢出限為2.5 μg/L，該檢測方法靈敏度高、效率高，精準(zhǔn)度高達(dá)85%，能夠在10 min內(nèi)檢測出樣品中的黃曲霉毒素。

綜上，免疫層析法較為便捷，特異性、靈敏度相對較高，環(huán)保效能感強(qiáng)，檢測對象多，且比較實惠，可廣泛應(yīng)用于快速檢測大批量樣本工作中，使用前景十分可觀，但實際操作中假陰性、假陽性的情況較為常見。

2.4.3 其他免疫法

放射免疫法則是通過準(zhǔn)確地標(biāo)記具有放射性同位素的標(biāo)記物進(jìn)行檢測。標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確標(biāo)記同素位，并完全同樣品混合，添加特異性抗體對其放射情況進(jìn)行精準(zhǔn)呈現(xiàn)，準(zhǔn)確計算抗原濃度。閆磊等[28]利用放射免疫法檢測牛奶中的黃曲霉毒素B1，結(jié)果顯示，檢測限達(dá)到0.5 μg/kg。

熒光偏振免疫測定法通過標(biāo)記熒光素測定黃曲霉毒素B1，相關(guān)研究相對較少[29]。熒光標(biāo)記的黃曲霉毒素B1與樣品中的黃曲霉毒素B1能夠與適量的抗體進(jìn)行競爭融合平衡相關(guān)反應(yīng)，表明熒光標(biāo)記的黃曲霉毒素B1與樣品的濃度呈反比[30]。

時間分辨熒光免疫分析法（TR-FIA）是一種最新的檢測方法，主要應(yīng)用于超微量檢測，靈敏度高達(dá)10～19，可借助免疫反應(yīng)的高度特異性以及標(biāo)記示蹤物的靈敏性進(jìn)行融合。TR-FIA 的標(biāo)記物離子能夠出現(xiàn)大量熒光，其熒光不僅具有較高的強(qiáng)度，且衰變時長相對較高，待測樣品中壽命相對較短的自然熒光出現(xiàn)衰變趨勢后，對其離子熒光進(jìn)行測定。TR-FIA 在黃曲霉毒素B1的檢測前景較廣，但難以實現(xiàn)自動化，且整個合成抗體的過程較為繁雜，費用相對較高，往往需要使用高科技儀器，不利于該技術(shù)在黃曲霉毒素B1檢測領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用。

3 展望

目前飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1的檢測方法種類較多，但各具優(yōu)缺點。飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1檢測技術(shù)備受關(guān)注，日益成熟，且不斷地調(diào)整與優(yōu)化相關(guān)法律法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)，有效地保障食品的安全性，需聯(lián)合使用各種檢測方法，以此獲得精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)。今后黃曲霉毒素B1的檢測方法主要的發(fā)展趨勢有：研發(fā)新型高選擇性材料，改進(jìn)黃曲霉毒素B1的前處理過程。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用越來越廣，可有效地控制檢測費用，加快檢測效率，符合相關(guān)監(jiān)管機(jī)構(gòu)的檢測要求。