錢(qián)亞芳，楊旭萍，蔣艷，胡楠（常州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 常州 213003）

碳青霉烯類藥物在重癥感染治療中有舉足輕重的地位，是革蘭氏陰性桿菌治療的最后一道防線[1]。比阿培南屬于碳青霉烯類抗菌藥物，相較于其他品種，具有穩(wěn)定性更好、耐藥性更小的優(yōu)勢(shì)[2]，其抗菌活性和美羅培南相當(dāng)，神經(jīng)毒性和腎毒性小，更加安全有效[3]，臨床上常作為治療重癥感染的殺手锏[2]。比阿培南的血藥濃度及維持時(shí)間是保證其臨床效果的關(guān)鍵[2]。比阿培南血藥濃度測(cè)定已報(bào)道的方法多為HPLC法[4-9]，分析效率較低，易受干擾。本研究使用LC-MS/MS技術(shù)，建立一種快速、準(zhǔn)確地測(cè)定比阿培南血藥濃度的方法，為其臨床合理便用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Jasper HPLC液相色譜儀、Triple Quad 4500MD三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX），Direct-Q純水儀（美國(guó)Millipore），BT25S電子分析天平（德國(guó)Sartorius），5417R低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf），Vortex-Genie 2渦旋混合器（美國(guó)Scientific industries）。

1.2 待測(cè)藥品

對(duì)照品比阿培南（批號(hào)：130578-201602，純度：99.0%）、法羅培南（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)：130532-201301，純度：80.3%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。乙腈（色譜純，Merck公司），水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex HILIC柱（2.1 mm×50 mm，2.6 μm，Phenomenex，USA）；柱溫：40℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸-水（含10 mmol·L-1乙酸銨）（A）和95%乙腈-水（含10 mmol·L-1乙酸銨）（B），梯度洗脫（0.01～0.70 min：95%B，0.70～1.00 min：95%～40%B，1.00～2.50 min：40%B，2.50～2.70 min：40%～95%B，2.70～5.00 min：95%B）；流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL；分析時(shí)間：5 min。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式掃描，毛細(xì)管電壓（IS）為5500 V，離子源溫度（TEM）為550℃，氣簾氣（CUR）為30 psi，碰撞氣（CAD）為8 psi，霧化氣（GS1）為50 psi，輔助氣（GS2）為50 psi。比阿培南和內(nèi)標(biāo)（法羅培南）的MS-scan圖見(jiàn)圖1，各自的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 比阿培南和內(nèi)標(biāo)LC-MS/MS 測(cè)定參數(shù)Tab 1 LC-MS/MS measurement parameters of the biapenem and internal standard

圖1 比阿培南和內(nèi)標(biāo)（法羅培南）的MS-scan圖Fig 1 MS-scan image of biapenem and internal standard（faropenem）

2.3 溶液配制

精密稱取比阿培南對(duì)照品適量，用甲醇定量配制成15.00 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于-20℃冰箱中保存，使用前用甲醇稀釋成2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00、400.00、500.00 μg·mL-1的系列對(duì)照品工作液。

精密稱取法羅培南對(duì)照品適量，用甲醇-水溶液（4∶1）配制成5.00 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，置于-20℃冰箱中保存，臨用前用甲醇-水溶液（4∶1）稀釋成10.00 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.4 血漿樣品的處理

精密移取血漿樣品50 μL（含5 μL標(biāo)準(zhǔn)工作液和45 μL空白血漿）于離心管中，加入內(nèi)標(biāo)工作液（10.00 μg·mL-1）5 μL，加入乙腈150 μL沉淀蛋白，渦旋3 min，于16 400 r·min-1離心10 min，精密移取上清液20 μL至另一離心管中，加入180 μL乙腈-水溶液（95∶5）稀釋，置于進(jìn)樣小瓶中，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 專屬性 取6 份不同來(lái)源的人空白血漿、加入對(duì)照品的血漿樣品（質(zhì)量濃度為0.2 μg·mL-1和2 μg·mL-1）、使用比阿培南的患者血漿樣品按“2.4”項(xiàng)下方法處理分析。結(jié)果比阿培南和法羅培南的保留時(shí)間分別為1.94 min和0.98 min，見(jiàn)圖2。

圖2 血漿中比阿培南和法羅培南的LC-MS/MS 色譜圖Fig 2 LC-MS/MS chromatogram of biapenem and faropenem in the plasma

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 向空白血漿中分別加入“2.3”項(xiàng)下的系列對(duì)照品工作液，配制成0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg·mL-1的對(duì)照品血漿樣本，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析。

以比阿培南的濃度（X）為橫坐標(biāo)，比阿培南與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析（W＝1/X2），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y＝1.460X-0.0177（r＝0.9959），r≥0.9950，結(jié)果說(shuō)明在本研究條件下血漿中比阿培南在0.20～50.00 μg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5.3 精密度與準(zhǔn)確度 向空白血漿中分別加入“2.3”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為5.00、50.00、400.00 μg·mL-1的對(duì)照品工作液，配制成低、中、高3個(gè)濃度水平（0.50、5.00、40.00 μg·mL-1）的質(zhì)控樣本，每6份為1個(gè)分析批，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)控樣本的準(zhǔn)確度和批內(nèi)精密度。在2周內(nèi)對(duì)3個(gè)分析批質(zhì)控樣本進(jìn)行檢測(cè)分析，計(jì)算質(zhì)控樣本的準(zhǔn)確度和批間精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 比阿培南血藥濃度測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果Tab 2 Accuracy and precision of biapenem

本研究方法下，比阿培南血藥濃度測(cè)定的準(zhǔn)確度為97.80%～111.25%，低、中、高3個(gè)濃度水平質(zhì)控樣本的精密度RSD＜15%，均符合生物樣本定量分析的要求。

2.5.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 取“2.5.3”項(xiàng)下低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平（0.50、5.00、40.00 μg·mL-1）的質(zhì)控樣本，每個(gè)濃度水平6 份，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)行分析，得到比阿培南的峰面積A1；另取人空白血漿，乙腈沉淀蛋白后取得上清液，向上清液中加入分別加入“2.3”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為5.00、50.00、400.00 μg·mL-1的對(duì)照品工作液，配制成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平（0.50、5.00、40.00 μg·mL-1）的樣本，每個(gè)濃度水平6份，分析后得到比阿培南的峰面積A2，峰面積比A1/A2即為比阿培南的提取回收率。結(jié)果見(jiàn)表3，本研究方法下，比阿培南的提取回收率為80.25%～84.11%（RSD＜15%），說(shuō)明本樣品前處理方法適用于比阿培南的提取分析。

以純水作為基質(zhì)，配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平（0.50、5.00、40.00 μg·mL-1）的樣本，每個(gè)濃度水平6份，進(jìn)樣分析得到比阿培南的峰面積A3。根據(jù)峰面積比A2/A3求算比阿培南的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表3，比阿培南的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果為109.19%～117.91%（RSD＜15%），表明基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)比阿培南的影響較小。

表3 人血漿樣本中比阿培南提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果Tab 3 Extraction recovery and matrix effect of biapenem

2.5.5 穩(wěn)定性考察 取低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平（0.50、5.00、40.00 μg·mL-1）的質(zhì)控樣本，分別于室溫放置1 h，4℃冰箱放置6 h，-80℃冰箱放置14 d以及經(jīng)過(guò)3次凍融循環(huán)后，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，考察樣本在上述4種條件下的穩(wěn)定性。

另取低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平（0.50、5.00、40.00 μg·mL-1）的質(zhì)控樣本，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，將處理好的樣本于自動(dòng)進(jìn)樣器（15℃）中放置6 h 后分析，考察處理后樣本在自動(dòng)進(jìn)樣器中的穩(wěn)定性。

穩(wěn)定性考察結(jié)果見(jiàn)表4，在上述5種不同條件下，低、中、高3個(gè)濃度水平的測(cè)定值與理論值的平均偏差均在±15%范圍內(nèi)，表明人血漿中比阿培南在本實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定。

表4 人血漿樣本中比阿培南測(cè)定的穩(wěn)定性結(jié)果Tab 4 Stability of biapenem

2.6 臨床應(yīng)用

應(yīng)用本方法對(duì)15例發(fā)生感染并使用比阿培南的患者進(jìn)行血藥濃度測(cè)定，其中男性11例，女性4例，年齡47～92歲。具體用藥方案為比阿培南0.3 g ivgtt q8h或0.3 g ivgtt q6h，連續(xù)給藥3～4次，于第4次給藥前抽取患者靜脈血，離心后得到患者血漿，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析得到患者谷濃度，結(jié)果見(jiàn)表5，測(cè)得比阿培南谷濃度為0.30～11.82 μg·mL-1，可為臨床合理化用藥提供重要依據(jù)。

表5 患者感染灶、用藥方案和谷濃度檢測(cè)結(jié)果Tab 5 Infection condition，therapeutic regimen and results of trough concentration determination of patients

3 討論

在臨床實(shí)際的抗感染治療中，使用碳青霉烯類藥物的患者病情多較為嚴(yán)重，且聯(lián)用藥物較多。不同品種的碳青霉烯類藥物藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)方面均存在一定差異，不同病理生理狀態(tài)也會(huì)影響其藥動(dòng)學(xué)[10]。碳青霉烯類血藥谷濃度是否達(dá)到目標(biāo)范圍，可用于優(yōu)化給藥方案，提高抗感染治療的有效性和安全性[10]。比阿培南具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、臨床效果好等特點(diǎn)，其對(duì)耐藥的銅綠假單胞菌及鮑曼不動(dòng)桿菌有一定優(yōu)勢(shì)，且無(wú)中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性，不會(huì)誘發(fā)癲癇發(fā)作[11]。

比阿培南是新一代碳青霉烯類抗菌藥物[1]，檢索現(xiàn)有文獻(xiàn)，已報(bào)道的比阿培南血藥濃度測(cè)定方法多為HPLC法[4-9]，分析效率低，易受干擾。本研究建立的LC-MS/MS分析方法，相較于已報(bào)道的HPLC法[4-9]，專屬性更強(qiáng)，分析效率得到顯著提高，能滿足大批量樣本分析的要求。本研究考察了C18柱以及HILIC柱，在研究初期嘗試使用C18柱對(duì)比阿培南進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)比阿培南在C18柱上保留不佳，與比阿培南極性較大、親水性較好有關(guān)。HILIC 柱采用兩性離子修飾的固定相，相較于C18柱，更適用于極性和親水性化合物的分析[12]。本研究最終使用了HILIC柱對(duì)比阿培南和內(nèi)標(biāo)（法羅培南）進(jìn)行了分離和測(cè)定，兩種物質(zhì)得到了很好的保留和分離。通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相比例以及梯度洗脫程序改善峰形，降低了干擾。

比阿培南的國(guó)內(nèi)藥品說(shuō)明書(shū)中適應(yīng)證描述簡(jiǎn)單，用法用量保守，限制了其臨床應(yīng)用[11]。比阿培南的主要排泄途徑為腎臟排泄，患者腎臟功能、血流動(dòng)力學(xué)、液體復(fù)蘇、CRRT等體外循環(huán)支持等因素均會(huì)影響比阿培南的血藥濃度[10]。重癥患者聯(lián)合用藥較多，發(fā)生藥物相互作用的機(jī)會(huì)增加，也會(huì)對(duì)比阿培南的血藥濃度產(chǎn)生影響。監(jiān)測(cè)比阿培南的谷濃度可以比較直接地驗(yàn)證是否在目標(biāo)范圍內(nèi)，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化給藥，提高治療的有效性和安全性[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道，1～5 μg·mL-1為比阿培南的谷濃度目標(biāo)范圍[8]。在本研究中，有4例患者谷濃度低于1 μg·mL-1，將此結(jié)果反饋至臨床，臨床考慮此4例患者抗感染效果不佳，換用亞胺培南西司他丁或美羅培南；1例患者谷濃度高于5 μg·mL-1，將此情況反饋至臨床，建議將比阿培南給藥劑量調(diào)整為0.3 g ivgtt q12 h；10例患者的比阿培南谷濃度在1～5 μg·mL-1，臨床治療有效，病程中患者未出現(xiàn)不良反應(yīng)。

本研究建立的LC-MS/MS分析方法，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性好，分析效率高，適用于比阿培南的臨床治療藥物監(jiān)測(cè)。