譚佳杰，向玉玲，熊遠(yuǎn)果，張洪（武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430060）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作為世界上最常見(jiàn)的癌癥之一，常由包括慢性乙型和丙型肝炎病毒感染、過(guò)量飲酒、非酒精性脂肪肝在內(nèi)的各種風(fēng)險(xiǎn)因素導(dǎo)致[1-2]。其常見(jiàn)的治療方法包括手術(shù)切除、肝移植、局部消融和經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)，其中晚期肝癌患者的臨床療效和預(yù)后非常差，迫切需要更有效的治療藥物[3-4]。

克班寧（crebanine）作為一種阿樸啡類異喹啉生物堿，存在于防己科千金藤屬（Stephania Lour）植物中，多來(lái)自其中的千金藤亞屬（Subgen. Stephania）和山烏龜亞屬（Subgen. Tuberiphania）[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在云南地不容中，阿樸啡型和原小檗堿型生物堿最多，其中克班寧是含量最高的阿樸啡型化合物之一[6]。迄今為止，對(duì)于克班寧的性質(zhì)結(jié)構(gòu)已有了一定的探索結(jié)果[7-9]，且發(fā)現(xiàn)它具有抗心律失常等多種藥理活性[10-13]。同時(shí)，已有多個(gè)研究證明克班寧能有效抑制白血病、纖維肉瘤、宮頸癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等腫瘤細(xì)胞的活性[14-17]。Yodkeeree等[18]發(fā)現(xiàn)克班寧能通過(guò)下調(diào)侵襲遷移相關(guān)因子的表達(dá)來(lái)抑制肺癌的遷移和侵襲，另外Wongsirisin等[19]還發(fā)現(xiàn)克班寧作用于HL-60細(xì)胞后，能通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

但關(guān)于克班寧對(duì)肝癌的生物學(xué)影響，目前還未見(jiàn)更深入的報(bào)道，因此，本研究的目的在于探索克班寧對(duì)肝癌生物學(xué)方面的影響，從而為未來(lái)開(kāi)發(fā)克班寧在肝癌方向的治療作用提供一定的參考，并奠定相應(yīng)的研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試藥

克班寧（分子式：C20H21NO4，純度≥ 98%，規(guī)格：20 mg，批號(hào)：RFS-K02811812016，成都瑞芬思生物科技有限公司，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1）；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：8120360）、胎牛血清（批號(hào)：20012050）（美國(guó)Gibco公司）；CCK-8試劑盒（批號(hào)：C0038，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Hoechst 33258染色試劑盒（批號(hào)：G1011）、PBS（批號(hào)：G4202）（武漢賽維爾生物科技有限公司）；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒（批號(hào)：8086787，美國(guó)BD公司）；FoxO3a抗體（批號(hào)：10849-1-AP）、p-AKT抗體（批號(hào)：28731-1-AP）、p-FoxO3a抗體（批號(hào)：28755-1-AP）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；BAX抗體（批號(hào)：5023S）、Bcl-2抗體（批號(hào)：3498S）、PARP抗體（批號(hào)：9532S）、AKT抗體（批號(hào)：9272S）、β-actin抗體（批號(hào)：4970S）、二抗antirabbit IgG（H+L）（批號(hào)：5151S）（美國(guó)CST公司）。

圖1 克班寧的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structure of crebanine

1.2 儀器

HERAcell 160i二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo）；TC20細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)BIO-RAD）；EnSight酶標(biāo)儀（美國(guó)Perkin Elmer）；CytoFlex流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter）；IX73倒置熒光顯微鏡（日本Olympus）；DYY-7C蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國(guó)Li-COR）。

1.3 細(xì)胞和培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞系Huh7（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所），采用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的完全DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液傳代。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將Huh7細(xì)胞以每孔1×104個(gè)接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h后，按照0（對(duì)照組）、12、36、48、60、96 μg·mL-1的分組分別給予克班寧，每個(gè)質(zhì)量濃度6個(gè)復(fù)孔，然后繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)，待24、48和72 h后，在每孔中加入10 μL CCK-8工作液，在 450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度值。細(xì)胞存活率（%）＝（給藥組吸光度-空白組吸光度）/（對(duì)照組吸光度-空白組吸光度）×100%。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7細(xì)胞，以每孔4×106個(gè)接種于6孔板中，待培養(yǎng)24 h后給予不同質(zhì)量濃度的克班寧[0（對(duì)照組）、36、48、60 μg·mL-1]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，加入1 mL DMEM后在倒置顯微鏡下觀察肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)變化，并拍照記錄。

2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將Huh7細(xì)胞以每孔4×103個(gè)接種到6孔板中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，給予克班寧，在24 h后棄去培養(yǎng)基，重新加入新鮮培養(yǎng)基，待14 d后用PBS清洗2次，并以4%多聚甲醛固定20 min，之后用0.5%結(jié)晶紫染色，30 min后清洗并晾干，同時(shí)拍照記錄。細(xì)胞數(shù)＞30個(gè)為一個(gè)集落，克隆形成率（%）＝每組的克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

2.4 Hoechst 33258實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞收集、種板、給藥方法同“2.2”項(xiàng)下，給藥24 h后用PBS清洗2次，再用4%多聚甲醛固定20 min，加入Hoechst 33258工作液避光孵育30 min，用熒光倒置顯微鏡觀察拍照。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞收集、種板、給藥方法同“2.2”項(xiàng)下，給藥24 h后，收集培養(yǎng)基，PBS清洗2次，用無(wú)EDTA胰酶消化，1000×g離心5 min，再次用PBS清洗2次，每組加入100 μL緩沖液、5 μL AnnexinⅤ-FITC及5 μL PI，避光孵育25 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7細(xì)胞以每孔7×106個(gè)接種于100 mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后給予克班寧，再孵育24 h后，提取蛋白，以BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白上樣后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，2 h后恒流進(jìn)行電轉(zhuǎn)，之后用5%的BSA封閉1.5 h，加TBST清洗，然后用相應(yīng)一抗在4℃條件下孵育過(guò)夜；再次用TBST清洗，之后加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶10 000）孵育2 h，同樣用TBST清洗，最后用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描目的條帶。掃描結(jié)果用Image J軟件測(cè)定灰度值，最后目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量＝目的蛋白的灰度值/內(nèi)參的灰度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖片制作，數(shù)據(jù)以x±s表示，3組及以上數(shù)據(jù)組間差異評(píng)估采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 克班寧對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，與對(duì)照組相比，隨著給藥濃度增加（0、12、36、48、60、96 μg·mL-1）Huh7細(xì)胞的增殖活性逐漸降低，且細(xì)胞的存活率隨著時(shí)間的增長(zhǎng)（24、48、72 h）也顯著降低（P＜0.01），總體呈現(xiàn)出良好的劑量和時(shí)間依賴性；根據(jù)GraphPad軟件計(jì)算得出IC50值：24 h為（45.05±1.48）μg·mL-1，48 h為（24.47±0.52）μg·mL-1，72 h為（15.90±0.40）μg·mL-1。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，給藥劑量越大，克隆形成的數(shù)量越少，密度越小，克班寧的質(zhì)量濃度對(duì)肝癌細(xì)胞長(zhǎng)期增殖能力的影響較大，具有濃度依賴性（P＜0.01）。

圖2 不同濃度克班寧作用不同時(shí)間對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞活力的影響（n＝6）Fig 2 Effect of different concentrations of crebanine on the viability of Huh7 cells at different time（n＝6）

圖3 不同濃度克班寧對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞活力的影響Fig 3 Effect of different concentrations of crebanine on the viability of Huh7 cells

3.2 克班寧對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

從圖4可觀察到克班寧對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞形態(tài)上的影響較為明顯，對(duì)照組肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，Huh7細(xì)胞緊密貼壁，且細(xì)胞形狀多保持完整，呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形，多為梭形；而隨著克班寧給藥劑量的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不斷下降的同時(shí)密度也降低，且逐漸出現(xiàn)大量的空泡，當(dāng)給藥劑量達(dá)到60 μg·mL-1時(shí)，大量肝癌細(xì)胞縮小變圓，無(wú)法保持基本的癌細(xì)胞形態(tài)。這表明克班寧有較好的抑制肝癌Huh7細(xì)胞的作用。

圖4 不同濃度克班寧對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞形態(tài)的影響Fig 4 Effect of different concentrations of crebanine on the morphology of Huh7 cells

3.3 克班寧對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞的促凋亡作用

從圖5A可以看出，相比于對(duì)照組在熒光倒置顯微鏡下呈現(xiàn)出的均勻染色，細(xì)胞核形狀完整的狀態(tài)，給予了一定劑量的克班寧的肝癌細(xì)胞則逐漸皺縮，破碎，細(xì)胞核也大多形態(tài)異常，并且這種狀況隨著劑量的加大而變得更加嚴(yán)重；由流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果可知（見(jiàn)圖5B），克班寧作用于Huh7細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率隨著濃度的升高而增加，晚期凋亡細(xì)胞數(shù)量從對(duì)照組的5.13%上升至38.2%，可見(jiàn)克班寧對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞的促凋亡作用有劑量依賴性。

圖5 不同濃度克班寧對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞凋亡的影響Fig 5 Effect of different concentrations of crebanine on the apoptosis of Huh7 cells

3.4 克班寧對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)影響

Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)結(jié)果如圖6A所示，與對(duì)照組相比，克班寧給藥組肝癌細(xì)胞中BAX、Cleaved-PARP 蛋白表達(dá)均顯著增加，Bcl-2 蛋白表達(dá)則顯著降低；各個(gè)凋亡蛋白的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖6B，克班寧的濃度越高，BAX蛋白表達(dá)水平越高，相對(duì)的Bcl-2 蛋白表達(dá)越低。為了研究克班寧對(duì)Huh7細(xì)胞凋亡和增殖的影響是否與Akt/FoxO3a信號(hào)通路有關(guān)，本研究采用Western blot檢測(cè)不同濃度克班寧處理的Huh7細(xì)胞中相關(guān)蛋白（AKT、p-AKT、FoxO3a和p-FoxO3a）的表達(dá)水平。根據(jù)圖7A結(jié)果所示，AKT和FoxO3a的表達(dá)水平幾乎保持不變，而p-AKT和p-FoxO3a的表達(dá)水平隨著克班寧濃度的增加而下降。綜合圖7B的結(jié)果來(lái)看，中、高濃度克班寧顯能著抑制AKT/FoxO3a信號(hào)通路蛋白的表達(dá)（P＜0.01）。

圖6 不同濃度克班寧對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig 6 Effect of different concentrations of crebanine on the expression of apoptosis protein in Huh7 cells

圖7 不同濃度克班寧對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞不同蛋白表達(dá)的影響Fig 7 Effect of different concentrations of crebanine on the expression of different proteins in Huh7 cells

4 討論

HCC有著起病隱匿，惡性程度高，早期診斷困難，預(yù)后差等特點(diǎn)；且研究發(fā)現(xiàn)HCC患者的平均年生存率低于10%[20]，在晚期肝癌患者全身治療藥物有限，對(duì)傳統(tǒng)化療藥物極為不敏感的情況下[21]，即使有類似索拉非尼、樂(lè)伐替尼、納武單抗等靶點(diǎn)藥物的出現(xiàn)，也仍有大部分患者因?yàn)閮r(jià)格昂貴或者不良反應(yīng)的原因而無(wú)法長(zhǎng)期使用[22]，而現(xiàn)在，從天然化合物中提取出有效成分，研究其抑制癌癥的功能并開(kāi)發(fā)成抗腫瘤藥物，已經(jīng)逐漸成為熱點(diǎn)[23-24]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，天然化合物可以通過(guò)抑制HCC的增殖、遷移、侵襲、凋亡、自噬等功能來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用[25]。

本研究在CCK-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)中觀察到，克班寧在體外顯著抑制肝癌Huh7細(xì)胞系的生長(zhǎng)，這種抑制能力長(zhǎng)期存在；且通過(guò)顯微鏡發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞形態(tài)異常，隨著藥物劑量增大出現(xiàn)空泡化和皺縮，表明其有可能被誘導(dǎo)凋亡，而Hoechst 33258和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果則同時(shí)證明了克班寧有促進(jìn)肝癌凋亡的能力，Western blot檢測(cè)到凋亡相關(guān)蛋白BAX和Cleaved-PARP的過(guò)表達(dá)，Bcl-2的低表達(dá)，再次證實(shí)了這一猜想。

另外，本實(shí)驗(yàn)還初步探索了克班寧對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響，過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路在多種人類癌癥中異常激活，如肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌等[26]。研究表明激活的PI3K可以磷酸化并激活A(yù)KT，而AKT是PI3K/AKT信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，被激活的AKT調(diào)節(jié)多種效應(yīng)分子促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，其中FoxO3a是AKT的重要靶點(diǎn)之一[27]。在PI3K/AKT信號(hào)通路被異常激活后，AKT對(duì)FoxO3a的磷酸化觸發(fā)了FoxO3a蛋白，使其從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的快速重新定位，激活或抑制FoxO3a相關(guān)信號(hào)分子；其中，受FoxO3a調(diào)控的Bim、PUMA、14-3-3、FasL和TRAIL都是與凋亡相關(guān)的蛋白[28-29]。而Hagenbuchner等[30]在研究中證明了FoxO3a不僅影響線粒體功能及相關(guān)凋亡因子的表達(dá)，還通過(guò)誘導(dǎo)線粒體活性氧（ROS）的積累和Bcl-2蛋白家族的表達(dá)來(lái)控制細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。另外，Yan等[31]的研究結(jié)果也表明了庫(kù)潘尼西（copanlisib）通過(guò)AKT/FoxO3a/PUMA軸對(duì)結(jié)直腸癌有細(xì)胞毒性和促凋亡作用。還有研究表明，扁蒴藤素（pristimerin）可以直接調(diào)控PI3K/AKT/FoxO3a途徑引發(fā)葡萄膜黑色素瘤的細(xì)胞死亡[32]。而在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)克班寧可顯著抑制AKT磷酸化，同時(shí)減少FoxO3a的磷酸化，證明克班寧可以干擾AKT/FoxO3a信號(hào)的表達(dá)，從而對(duì)肝癌產(chǎn)生細(xì)胞毒性，致使細(xì)胞死亡。

綜上所述，克班寧對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，同時(shí)促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的凋亡，能顯著促進(jìn)或抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，而早在之前的研究中就已經(jīng)證實(shí)AKT/FoxO3a是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵通路之一[33-34]；因此，初步推測(cè)克班寧的促凋亡作用可能是通過(guò)抑制AKT/FoxO3a信號(hào)通路產(chǎn)生的。當(dāng)然，兩者之間的關(guān)系需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，而本課題組也只是對(duì)克班寧抗肝癌作用進(jìn)行了初步研究，其對(duì)肝癌遷移、侵襲和其他功能的影響未來(lái)仍需更為深入的探討。