郭 燕，徐 爽，王 亭,2

急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)是指在各種藥物、毒素等病理因素下，腎小管上皮細(xì)胞(mouse proximal tubular epithelial cells, mPTC)發(fā)生變性、凋亡、壞死、脫落，導(dǎo)致腎功能急劇下降的一種疾病。腎小管上皮細(xì)胞線粒體豐富、代謝率高，對(duì)損傷刺激尤其敏感，是AKI發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。深入探討AKI腎小管上皮細(xì)胞損傷的機(jī)制，有利于尋找有效的治療靶點(diǎn)。蛋白激酶D1(protein kinase D1, PKD1)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于Ca2+/鈣調(diào)素依賴激酶超家族[1]，研究顯示其廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞，參與心臟病理、生理重構(gòu)、炎癥反應(yīng)、致癌作用、肌動(dòng)蛋白重塑、細(xì)胞增殖以及遷移等多種病理、生理過(guò)程[2-6]。目前，PKD1在腎臟中的作用尚無(wú)報(bào)道。本文著重探討AKI中PKD1的表達(dá)，分析其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2017年2月～2022年2月南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院經(jīng)腎活檢證實(shí)為AKI的6例石蠟標(biāo)本。AKI使用KDIGO標(biāo)準(zhǔn)診斷[7]。另收集5例腎癌手術(shù)切除標(biāo)本的癌旁正常腎組織作為對(duì)照，常規(guī)病理檢查均無(wú)腎損傷。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 動(dòng)物收集18只雄性C57BL/6小鼠(8周齡，體重22～25 g)，購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。小鼠被安置在溫度可控的房間，12 h光/暗循環(huán)，自由攝入食物和水，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。18只雄性小鼠隨機(jī)分為2組：對(duì)照組(n=8)、順鉑(Cisplatin)組(n=10)。Cisplatin組小鼠一次性腹腔注射0.9%生理鹽水溶解的Cisplatin(20 mg/kg)，手術(shù)72 h后采用戊巴比妥鈉注射液(50 mg/kg)安樂(lè)死小鼠，收集血清和腎臟標(biāo)本，在-80 ℃下保存，以便進(jìn)一步分析。

1.3 免疫組化患者標(biāo)本和小鼠腎組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，3 μm厚切片，使用北京中杉金橋PV 8000兩步法進(jìn)行免疫組化染色：切片脫蠟至水；檸檬酸鈉抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)；PBS沖洗3次；3%過(guò)氧化氫溶液阻止內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；PBS沖洗3次；血清封閉液室溫封閉1 h；加入PKD1抗體(1 ∶200)后4 ℃孵育過(guò)夜；PBS沖洗3次；二抗37 ℃孵育1 h；DAB顯色，經(jīng)復(fù)染、脫水、透明后，中性樹(shù)膠封固。在顯微鏡下觀察并進(jìn)行圖像采集，用IPP圖像分析軟件對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與處理小鼠腎小管上皮細(xì)胞(mouse proximal tubular epithelial cells, mPTC)是從美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection，ATCC)購(gòu)買(mǎi)的永生化細(xì)胞系，用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，并使用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(Invitrogen公司)在80%融合度傳代培養(yǎng)。細(xì)胞處理前，無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓24 h，經(jīng)10 μmol/L CID755673(CID, HY-12239，MCE)預(yù)處理，2 h后加入Cisplatin(5、10 μmol/L)，Cisplatin處理后24 h收集細(xì)胞提取蛋白及mRNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 RNA提取和qRT-PCR檢測(cè)使用TRIzol提取腎組織總RNA(表1)。qRT-PCR循環(huán)條件為95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，合計(jì)40個(gè)循環(huán)。將mRNA的相對(duì)量標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH，并使用delta-delta方法根據(jù)閾值循環(huán)數(shù)計(jì)算。

表1 qRT-PCR檢測(cè)基因引物序列

1.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞在RIPA裂解液中裂解，并加入蛋白酶抑制劑提取總蛋白。30 μg蛋白上樣通過(guò)12.5%SDS-PAGE電泳分離，并將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。一抗兔多克隆抗體：PKD1抗體(1 ∶1 000)、剪切的Caspase-3(cleaved Caspase-3)抗體(1 ∶1 000)、BCL-2抗體(1 ∶1 000)、Bax抗體(1 ∶1 000)、β-actin抗體(1 ∶5 000)。過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗，購(gòu)自Santa Cruz公司。用Image J圖像分析軟件對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

1.7.1Annexin V-FITC和PI染色 細(xì)胞處理后，預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞3次。重新收集細(xì)胞，向細(xì)胞中加入1×Binding Buffer重懸細(xì)胞沉淀，加入2.5 μL FITC-Annexin V和2.5 μL PI工作液充分混勻后，室溫條件下避光孵育20 min后，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7.2JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位 細(xì)胞處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞后，加入1 mL新鮮培養(yǎng)基，向細(xì)胞中加入JC-1染色工作液，37 ℃避光孵育30 min，棄去上清液，JC-1染色緩沖液清洗細(xì)胞2次，收集細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，通過(guò)紅綠熒光的比例衡量線粒體膜電位變化。

1.7.3線粒體活性氧(mitoSOX)檢測(cè) 用mitoSOX(M36008，Invitrogen公司)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，37 ℃避光孵育10 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體活性氧水平；所有流式細(xì)胞數(shù)據(jù)使用Flow J軟件進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 PKD1在AKI患者和Cisplatin誘導(dǎo)mPTC中的表達(dá)免疫組化檢測(cè)癌旁正常腎組織和AKI患者腎組織中PKD1表達(dá)水平及定位。結(jié)果顯示：在癌旁正常腎組織中，PKD1表達(dá)位于近曲小管/遠(yuǎn)曲小管，并以胞質(zhì)為主，腎小球內(nèi)未見(jiàn)表達(dá)(1.001±0.073)；AKI患者PKD1多表達(dá)于腎小管節(jié)段，腎小球內(nèi)也有表達(dá)(4.07±0.994)，且胞質(zhì)和胞膜表達(dá)均高于對(duì)照組(P=0.021 1，圖1)。在小鼠正常腎組織中，PKD1多表達(dá)于腎小管節(jié)段(0.992±0.072)，Cisplatin處理后，表達(dá)顯著升高(2.457±0.316 73，P=0.002 5)，且主要分布于胞質(zhì)(圖2)。同時(shí)，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度的Cisplatin對(duì)PKD1表達(dá)量的影響，用5 μmol/L和10 μmol/L Cisplatin處理mPTC細(xì)胞，經(jīng)Western blot和qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PKD1表達(dá)高于對(duì)照組，且隨濃度增加而增加(P<0.05，圖3、4)。

2.2 CID755673對(duì)Cisplatin誘導(dǎo)的mPTC損傷的影響本組進(jìn)一步利用PKD1抑制劑CID755673分析PKD1在AKI中的作用。CID755673對(duì)mPTC預(yù)處理2 h后，用Cisplatin(10 μmol/L)繼續(xù)刺激24 h。利用Annexin V-FITC和PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，可見(jiàn)早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI-)和晚期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI+)百分比均明顯增加(21.77±2.378)，而CID755673預(yù)處理Cisplatin組早期和晚期細(xì)胞凋亡比例均明顯高于單獨(dú)使用Cisplatin組(43.01±2.796，P<0.000 1，圖5)。本組還檢測(cè)凋亡相關(guān)基因BCL-2和Bax的mRNA和蛋白表達(dá)水平及凋亡效應(yīng)蛋白Caspase-3激活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Cisplatin處理顯著增加Bax mRNA(2.191±0.144)和蛋白(1.564±0.06)的表達(dá)水平及Caspase-3的活化水平(cleaved Caspase-3)(1.753±0.076)，降低BCL-2 mRNA(1.564±0.06)和蛋白(0.712±0.008)的表達(dá)水平；而經(jīng)CID755673預(yù)處理Cisplatin組明顯加劇了BCL-2 mRNA(1.994±0.067，P=0.026)和蛋白(0.423±0.015，P=0.049)的下調(diào)以及Bax mRNA(2.56±0.402，P=0.012 9)和蛋白(1.994±0.067，P=0.027)的上調(diào)(圖6～8)。同時(shí)，也明顯加重了Cisplatin誘導(dǎo)的Caspase-3裂解激活(2.332±0.114，P=0.026，圖9)。

①A①B②A②B

圖3 A.Western blot法檢測(cè)不同濃度Cisplatin(5、10 μmol/L)處理的mPTC中PKD1蛋白表達(dá)；B.蛋白表達(dá)定量分析

圖4 qRT-PCR檢測(cè)不同濃度Cisplatin(5、10 μmol/L)處理的mPTC中PKD1 mRNA表達(dá)

圖5 A.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理組mPTC中細(xì)胞的凋亡水平；B.用Flow J軟件進(jìn)行定量分析

圖6 qRT-PCR檢測(cè)不同處理組mPTC中BCL-2 mRNA表達(dá)

圖7 qRT-PCR檢測(cè)不同處理組mPTC中Bax mRNA表達(dá)

圖8 A.Western blot法檢測(cè)不同處理組mPTC中BCL-2和Bax的蛋白表達(dá)；B.蛋白表達(dá)定量分析

2.3 CID755673對(duì)Cisplatin誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞線粒體功能障礙的影響為進(jìn)一步探討PKD1在腎小管上皮細(xì)胞中的作用，本組應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞的線粒體功能，發(fā)現(xiàn)Cisplatin處理后線粒體活性氧產(chǎn)量顯著增加(1.562±0.023)，而CID755673預(yù)處理組活性氧水平顯著高于單獨(dú)使用Cisplatin組(1.957±0.088，P=0.002，圖10)。同樣，本組還發(fā)現(xiàn)在Cisplatin處理組JC-1明顯下降(0.725 7±0.163)，CID755673預(yù)處理組膜電位進(jìn)一步降低(0.46±0.026，P=0.043 2，圖11)。

圖9 A.Western blot法檢測(cè)不同處理組mPTC中活化的Caspase-3蛋白表達(dá)；B.蛋白表達(dá)定量分析

圖10 A.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理組mPTC中線粒體內(nèi)活性氧的水平；B.Flow J軟件進(jìn)行定量分析

圖11 A.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理組mPTC中線粒體膜電位的改變；B.Flow J軟件進(jìn)行定量分析

3 討論

AKI是一種常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)，與發(fā)生慢性腎病乃至終末期腎病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。目前，尚沒(méi)有治療AKI的特效藥物。研究證實(shí)，腎小管上皮細(xì)胞是AKI的主要受損細(xì)胞。因此，深入探討其損傷機(jī)制，有利于加深對(duì)AKI發(fā)生、發(fā)展的認(rèn)識(shí)，為早期防治AKI提供新的有效手段。本組發(fā)現(xiàn)PKD1廣泛表達(dá)于正常腎小管各節(jié)段，在AKI患者和小鼠AKI模型腎組織中表達(dá)顯著上調(diào)。文獻(xiàn)報(bào)道在多種應(yīng)激刺激下，PKD1被迅速激活[8-9]。因此，PKD1的升高可能是對(duì)AKI損傷的保護(hù)性反應(yīng)。

凋亡通常被認(rèn)為是Cisplatin誘導(dǎo)AKI的關(guān)鍵病理過(guò)程和細(xì)胞死亡形式。腎臟內(nèi)的炎癥浸潤(rùn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟上皮細(xì)胞死亡，這是急性腎臟疾病的特征[10-11]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，腎小管細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制與Caspase-3和凋亡相關(guān)蛋白Bax的激活以及抗凋亡BCL-2的抑制有關(guān)。Caspase-3是凋亡的效應(yīng)蛋白，cleaved Caspase-3是其活性形式；Bax被認(rèn)為是促凋亡蛋白，介導(dǎo)Cytochrome C的釋放，誘發(fā)凋亡反應(yīng)；抗凋亡蛋白BCL-2可與Bax形成二聚體，從而抑制凋亡的發(fā)生[12-14]。研究證明，PKD1通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活，可有效減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的小腸上皮細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡損傷[15]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，PKD1可充當(dāng)線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)的中心整合器，通過(guò)磷酸化激活NF-κB調(diào)節(jié)MnSOD的表達(dá)，發(fā)揮解毒作用，從而促進(jìn)細(xì)胞存活[16]。因此，本組還評(píng)估了PKD1對(duì)cleaved Caspase-3、BCL-2和Bax表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示：抑制PKD1可顯著增加Cisplatin誘導(dǎo)的AKI腎臟中Caspase-3活化、Bax和BCL-2分裂，提示抑制PKD1在Cisplatin誘導(dǎo)的AKI發(fā)病機(jī)制中具有促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用。目前，關(guān)于PKD1對(duì)細(xì)胞死亡的影響仍存在爭(zhēng)議，多數(shù)研究認(rèn)為PKD1是促進(jìn)細(xì)胞生存的蛋白，如在腸道RIE細(xì)胞系，PKD1有助于抵抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡[15]，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的缺血再灌注損傷[17-18]。也有研究認(rèn)為PKD1介導(dǎo)凋亡的發(fā)生，Yuan等[6]在胰腺炎模型中的研究發(fā)現(xiàn)，PKD1通過(guò)ATP耗竭、RIP1降解減少、組織蛋白酶依賴性胰蛋白酶原活化等機(jī)制促進(jìn)胰腺壞死和細(xì)胞凋亡損傷。本組中PI+細(xì)胞包括晚期凋亡和壞死細(xì)胞，與Cisplatin單獨(dú)處理組相比，CID755673預(yù)處理組凋亡總比例顯著增加，支持PKD1減輕凋亡的作用；但對(duì)凋亡外的其他死亡形式仍需進(jìn)一步分析。對(duì)比不同文獻(xiàn)報(bào)道的矛盾之處，除了模型不同、實(shí)驗(yàn)條件不同以外，也說(shuō)明PKD1作用的復(fù)雜性。如炎癥或氧化應(yīng)激在組織損傷修復(fù)中的正面和反面作用一樣，不同程度的損傷，病程的不同時(shí)期，發(fā)揮不同的效果，這也是很多藥物止步于臨床應(yīng)用的重要原因。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)的能量工廠，細(xì)胞在受到損傷刺激后，線粒體活性氧過(guò)量產(chǎn)生并累積，造成氧化應(yīng)激，攻擊線粒體內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白、脂質(zhì)和線粒體DNA(mtDNA)，使其發(fā)生氧化損傷，導(dǎo)致線粒體功能障礙。有研究發(fā)現(xiàn)，PKD1是活性氧介導(dǎo)的線粒體去極化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[19]，PKD1根據(jù)上游信號(hào)傳導(dǎo)和結(jié)合伙伴，穿梭于各種細(xì)胞區(qū)室，促進(jìn)高爾基體運(yùn)輸過(guò)程，以及線粒體、胞質(zhì)和核信號(hào)傳導(dǎo)[20]，參與調(diào)節(jié)線粒體病理、生理功能。

腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)含有豐富的線粒體，尤其是近端腎小管細(xì)胞，主要依賴有氧代謝，所以對(duì)線粒體功能障礙十分敏感。研究發(fā)現(xiàn)，在AKI早期腎小管上皮細(xì)胞中存在線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變，線粒體的片段化能夠引起細(xì)胞凋亡，且線粒體功能障礙能夠加劇腎小管的病理?yè)p傷，表明線粒體功能障礙可能介導(dǎo)AKI[21-23]。為了進(jìn)一步探討PKD1在腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用，本組還觀察了CID755673對(duì)Cisplatin誘導(dǎo)的AKI中線粒體功能障礙的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Cisplatin處理后線粒體活性氧產(chǎn)量顯著增加，線粒體膜電位明顯下降，而CID755673預(yù)處理組均明顯加重。上述現(xiàn)象使線粒體功能障礙進(jìn)一步加劇，表明PKD1抑制劑加重Cisplatin誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體功能障礙來(lái)實(shí)現(xiàn)的，進(jìn)一步加深了對(duì)PKD1在AKI中作用的認(rèn)識(shí)。

綜上所述，抑制PKD1能夠通過(guò)適當(dāng)調(diào)節(jié)腎臟線粒體功能損傷和凋亡，加重Cisplatin誘導(dǎo)的AKI。研究發(fā)現(xiàn)，在腎小管上皮中進(jìn)一步過(guò)表達(dá)PKD1，可能是保護(hù)細(xì)胞損傷和預(yù)防AKI的潛在治療靶點(diǎn)之一。