郭樹琴，文純芳，朱 彪，田蕭羽，黨瑞杰，王立軍

在口腔臨床中經(jīng)常遇到炎癥所致的骨缺損，如根尖周炎、牙周炎和種植體周圍炎等疾病均可導致骨組織與結締組織破壞缺損[1, 2]。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有分化為成骨細胞并進一步實現(xiàn)骨再生的潛能，然而過度的炎癥刺激可抑制BMSCs 的成骨活性，成為骨再生的不利影響[3]。鳶尾素是最近發(fā)現(xiàn)的一種在棕色脂肪組織中高表達的分泌型細胞因子[4]。有研究表明，鳶尾素能夠促進BMSCs 成骨分化[5, 6]并能抑制炎癥信號通路及炎性反應[7]。但是，鳶尾素能否促進炎癥狀態(tài)下BMSCs的成骨分化尚不清楚。因此，本課題擬采用牙齦卟啉單胞菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)模擬體外炎癥狀態(tài)[8]，探討在炎癥狀態(tài)下鳶尾素對小鼠BMSCs成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 6周齡雄性SPF級C57小鼠10只(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司)。重組鳶尾素蛋白(美國Phoenix Pharmaceuticals)，LPS(美國Sigma)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)半定量試劑盒、CCK-8試劑盒(日本同仁)，α-MEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(以色列BI)，茜素紅染液、胰酶(美國Sigma)，青霉素及鏈霉素(德國Merck)，ALP一抗(貨號：ab229126， 稀釋比例：1:1000；英國Abcam)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)一體 (貨號：sc-365797，稀釋比例：1∶500；美國Santa Cruz)及山羊抗兔二抗(美國CST)；CD11b、CD45、CD29、CD90抗體(美國BD Biosciences)；BCA(bicinchoninic acid)測定試劑盒(上海源葉生物)；聚偏氟乙烯膜(美國Millipore)。CO2恒溫培養(yǎng)箱(371，美國賽默飛·世爾)；生物凈化工作臺(BCM-1000A型，蘇州安泰)；5702R型低速離心機、Biophotometer核酸蛋白測定儀(德國Eppendorf)；流式細胞儀(CytoFLEX，美國Beckman Coulter)；酶標儀(RT6100，深圳雷杜)；電泳儀(DYY-7C，北京六一儀器廠)；恒溫水浴鍋(HH8，上海邦西)；正置熒光顯微鏡(LW300LFT，日本奧林巴斯)。

1.2 培養(yǎng)小鼠BMSCs 采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)小鼠BMSCs，操作步驟參照文獻[9]報道：在無菌操作臺內(nèi)將小鼠脛骨骨髓液沖出，離心后棄上清；接入細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，2 d后換液去除懸浮不貼壁細胞，此后隔3 d換液1次。待細胞長滿瓶底面積的80%時，開始進行傳代培養(yǎng)。將小鼠BMSCs分成3組：對照組(Vehicle組)，牙齦卟啉單胞菌脂多糖誘導炎癥組(LPS組)與鳶尾素組(LPS +鳶尾素)。

1.3 細胞鑒定 0.05%胰酶消化第3代BMSCs，將其制成2×105/ml的單細胞懸液備用。分別加入熒光標記的抗CD11b、CD45、CD29和CD90抗體[10]，4 ℃避光孵育30 min后洗脫未結合的抗體，上機檢測。

1.4 細胞活力 將BMSCs懸液接種到96孔板(2.0×103/孔)，分別加入LPS(1 μg/ml)[11]和不同濃度的鳶尾素(50、100、200 ng/ml)，每組5個復孔。接種5 d后按照試劑盒說明檢測細胞增殖活性：每孔中加入10 μl CCK-8液，避光孵育2 h，采用吸光光度值(OD=492 nm)反映BMSCs的增殖活力。

1.5 ALP活性檢測 將BMSCs懸液接種于96孔板(5.0×103/孔)，待細胞鋪滿孔底約70%的面積時，換為成骨誘導液，同時加入1 μg/ml LPS和不同濃度的鳶尾素(50、100、200 ng/ml)，每組3個復孔。分別于加藥后第1、3、5、7天，檢測各組細胞的ALP活性。鳶尾素可呈濃度依賴性地升高ALP活性且其作用具有飽和性，后續(xù)實驗采用100 ng/ml 作為鳶尾素的干預濃度(表1)。

1.6 成骨相關基因的轉錄表達 各組細胞成骨誘導培養(yǎng)5 d，使用Trizol提取總RNA，10 μl體系中將RNA反轉錄為cDNA并進行擴增，檢測Runt相關轉錄因子(Runt-related transcription factor 2，Runx2)、鋅指結構轉錄因子(Osterix，Osx)、ALP與骨鈣素(osteocalcin，OCN)轉錄情況，引物序列參考既往文獻[9]報道，目的基因的計算采用2-ΔΔCt法。

1.7 成骨相關蛋白的表達 各組細胞成骨誘導培養(yǎng)5 d，RIPA裂解細胞后提取總蛋白。BCA法測定濃度后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白、濕電印跡法轉膜(220 mA，2 h)，快速封閉液封閉，特異性一抗孵育過夜(4 ℃)，再以辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h。最后，用化學發(fā)光劑染色、顯影并采用BandScan 5.0軟件分析膠片灰度[12]。

1.8 礦化能力檢測 各組細胞成骨誘導培養(yǎng)14 d，吸棄培養(yǎng)液，ddH2O洗3遍。72%乙醇固定50 min后行茜素紅染色。然后，溶解礦化結節(jié)并于波長=570 nm處測定吸光光度值。

2 結 果

2.1 BMSCs細胞鑒定 細胞表面抗原CD11b(0.75%)和CD45(1.55%)呈陰性；細胞表面抗原CD29(91.6%)和CD90(94.2%)呈陽性，說明成功分離并培養(yǎng)出了BMSCs。

2.2 細胞增殖活力 與Vehicle組相比，LPS明顯促進BMSCs增殖，差異有統(tǒng)計學意義[(0.84±0.11)vs.(0.50±0.05)，P<0.05)]；不同濃度的鳶尾素對炎癥條件下BMSCs的增殖活力均無影響[50 ng/ml，(0.83±0.06)vs.(0.84±0.11)；100 ng/ml， (0.86±0.05)vs.(0.84±0.11); 200 ng/ml，(0.84±0.08)vs.(0.84±0.11)，P>0.05]。

2.3 鳶尾素對ALP活性的影響 各組細胞在成骨誘導培養(yǎng)3 d后，ALP活性開始上升。在第5天時，ALP活性達到峰值，此后開始下降。與Vehicle組相比，LPS抑制BMSCs的ALP活性；鳶尾素呈濃度依賴性地升高ALP活性且其作用具有飽和性(表1)。因100 ng/ml與200 ng/ml 鳶尾素提高ALP活性的作用無差別，故本實驗采用100 ng/ml作為后續(xù)實驗的干預濃度。

表1 鳶尾素對小鼠BMSCs的ALP活性影響

2.4 鳶尾素對成骨基因轉錄表達的影響 PCR結果表明：與Vehicle組比較，LPS顯著抑制成骨基因Runx2(P=0.001)、Osx(P=0.002)、ALP(P=0.006)和OCN(P=0.000)的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而鳶尾素干預可不同程度地提高這些成骨基因(Runx2，P=0.008；Osx，P=0.007；ALP，P=0.023；OCN，P=0.217)的轉錄表達(表2)。

表2 鳶尾素對小鼠BMSCs成骨相關基因轉錄表達的影響

2.5 鳶尾素對成骨蛋白表達的影響 與mRNA檢測結果一致，蛋白質(zhì)水平的檢測也表明：與Vehicle組相比較，LPS顯著抑制成骨蛋白ALP(P=0.000)和OCN(P=0.000)的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而鳶尾素可提高ALP(P=0.001)和OCN(P=0.001)蛋白的表達(表3)。

表3 鳶尾素對小鼠BMSCs成骨相關蛋白表達的影響

2.6 鳶尾素對礦化水平的影響 各組細胞成骨誘導14 d后進行茜素紅染色(圖1)及半定量分析，結果顯示：與Vehicle組相比，LPS組的礦化水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義[(0.49±0.04)vs.(1.00±0.06)；P<0.05]；鳶尾素組的礦化水平顯著提高[(0.91±0.07)vs.(9.49±0.04)；P<0.05]。

圖1 鳶尾素對小鼠BMSCs礦化水平的影響

3 討 論

本研究以LPS刺激模擬細菌感染誘導產(chǎn)生的炎癥狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)鳶尾素能夠上調(diào)炎癥環(huán)境中小鼠BMSCs成骨相關基因Runx2、Osx和ALP的轉錄表達，促進成骨相關蛋白ALP和OCN的表達，進而促進炎癥微環(huán)境中BMSCs向成骨細胞分化。

作為革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組分，LPS是細菌產(chǎn)生毒力的主要原因，因此在體外實驗中常用LPS模擬細菌感染誘導產(chǎn)生的炎癥微環(huán)境。當細菌侵犯骨組織時，在炎癥因子的不斷刺激下，成骨活性被抑制，而破骨活性卻得到增強，炎癥破壞達到一定程度時就會導致根尖周炎、牙周炎和種植體周圍炎骨缺損[13]。BMSCs是分化為成骨細胞的主要來源，是骨再生的關鍵。BMSCs以陽性表達CD29和CD90、陰性表達CD11b和CD45為主要特征[14,15]，流式結果證明本研究成功分離并培養(yǎng)出了BMSCs。以BMSCs作為研究對象，本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導的炎癥微環(huán)境中，BMSCs的成骨活性被顯著地抑制。然而，本研究還發(fā)現(xiàn)LPS能促進BMSCs的增殖。這可能是BMSCs產(chǎn)生的保護性免疫調(diào)節(jié)反應所致，因為有研究表明，早期的炎癥反應可募集BMSCs遷移至炎癥部位并誘導其增殖，以改善炎癥微環(huán)境[11,16]。

鳶尾素是運動誘導產(chǎn)生的肌源性細胞因子，以往的研究發(fā)現(xiàn)，鳶尾素具有抗炎與抗分解代謝的功能[17,18]。本實驗從成骨基因的轉錄和翻譯兩個層面證實，鳶尾素能抵抗炎性因素對BMSCs成骨分化的抑制作用，即鳶尾素促進炎癥狀態(tài)下BMSCs成骨分化。但是，對于鳶尾素在BMSCs成骨分化方面產(chǎn)生抗炎作用的作用機制，本實驗未進一步深入探討。有研究發(fā)現(xiàn)，鳶尾素干預能夠提高BMSCs的自噬水平，通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進BMSCs成骨分化[18]。而且，細胞的自噬水平在LPS誘導的炎癥微環(huán)境中會發(fā)生改變[19-22]。因此，自噬在炎癥微環(huán)境中鳶尾素促進BMSCs成骨分化中的作用值得進一步探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)鳶尾素能提高炎癥狀態(tài)下BMSCs的成骨分化能力，有助于為根尖周炎、牙周炎和種植體周圍炎等炎癥狀態(tài)下頜骨損傷的修復提供新策略。