潘 璐，陳麗名，谷浩榮 綜述 李小會 審校

外泌體(exosome)在1982年作為一類由細胞分泌到胞外的囊泡被Pan和Johnstone初次被發(fā)現(xiàn)，他們在跟蹤綿羊網(wǎng)狀細胞成熟過程時，發(fā)覺有一種囊泡與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體釋放到細胞外空間有關(guān)，此類小泡被命名為外泌體[1]。但外泌體被發(fā)現(xiàn)之后十幾年的歷程中，一直被認為是細胞產(chǎn)生的“垃圾”，它的生物學(xué)作用沒有引起研究者的重視。直到1996年，有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)B淋巴細胞能分泌抗原提呈的外泌體攜帶有共刺激因子、MHC-II類分子和黏附因子，此類外泌體能夠直接刺激效應(yīng)CD4陽性的細胞產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)[2]。自此之后，研究人員發(fā)現(xiàn)，外泌體中包含有DNA片段、mRNA、微小RNA、功能蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等多種具有生物活性的物質(zhì)，而其本身的膜結(jié)構(gòu)還能表達多種抗原、抗體分子，從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[3]。至此，一個在自然界默默傳輸關(guān)鍵生物信息的“快遞員”慢慢浮出了水面。本文主要介紹外泌體及其在糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)中的研究進展。

1 外泌體研究

1.1 外泌體的形成與特征 細胞會分泌各種類型的細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，各種由細胞主動釋放的納米級膜囊泡被總稱為EVs[4]。因為這些EVs的大小及分化機制不同，故將其分類為外泌體、凋亡小體及微泡。凋亡小體及微泡是由質(zhì)膜直接出芽產(chǎn)生的，而外泌體的不同之處在于是早期核內(nèi)體的限制膜向內(nèi)出芽形成的。在這個過程中，成熟為多泡體(matrix vesiclesbodies，MVBs)[5]，MVBs再通過轉(zhuǎn)運(endosomal sorting complex for transport, ESCRT)通路，使之與溶酶體融合而被降解亦或者與質(zhì)膜融合，再由胞吐釋放，即為外泌體[6]。

有研究表明，外泌體可以有效地將mRNA、miRNA甚至質(zhì)粒DNA等載體運送到靶細胞[7]。在外泌體攜帶的諸多載體中，miRNAs可以通過轉(zhuǎn)錄后對具有識別位點的靶miRNA進行調(diào)控[8]，在發(fā)育、生理過程和疾病中發(fā)揮重要作用。miRNA是具有18～22個核苷酸的小型非編碼RNA。它們參與了多種細胞過程，并可以在尿液等細胞外環(huán)境中被找到[9]。近年來，越來越多的研究指向了外泌體所攜帶的miRNAs，miRNAs可作為細胞間的內(nèi)分泌或者旁分泌信號，調(diào)控細胞的表觀遺傳或介導(dǎo)細胞間的通信。故而外泌體miRNAs可以作為基礎(chǔ)疾病的診斷標準以及參與疾病的治療。外泌體因它的生理作用受到各個領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。

1.2 外泌體的分離與鑒定 外泌體密度和體積較小，且在粒徑與組成方面存在異質(zhì)性，這些因素都為外泌體的提取增加了難度。并且收集的樣本可能還會存在大量高豐度雜質(zhì)蛋白質(zhì)，亦有許多與外泌體的生物物理學(xué)參數(shù)相似的細胞外囊泡，都會干擾外泌體的提取結(jié)果。所以，研究外泌體組成與功能的關(guān)鍵在于是否能夠高效地提取出高純度的外泌體。目前，有諸多提取外泌體的方法，包括超速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、超濾法、色譜法、免疫磁珠法等。每種技術(shù)都有其獨特的優(yōu)點和缺點。(1)超速離心法是目前應(yīng)用最廣泛、最可靠的離心方法[10]。它是根據(jù)不同密度和粒徑的顆粒在離心力作用下的沉降速度不同，進而分離出外泌體。超速離心法分別在300、2000、10 000 g的離心作用下清除細胞、細胞碎片、細胞大囊泡。其優(yōu)勢在于方法成熟、成本低、適用于大體積樣本。然而，該方法的缺點在于設(shè)備要求高、操作比較耗時，且易造成蛋白質(zhì)聚集。(2)密度梯度離心法屬于一種要求更高的超速離心法，它可以在超速離心法的一系列離心步驟后，采用蔗糖或碘沙醇作為介質(zhì)進行超速離心。其原理為在離心力作用下，樣品中的不同組分會沉降到等密度區(qū)，從而實現(xiàn)外泌體與樣品中其他組分的分離。此方法效率高但也同樣依賴昂貴的儀器[11]。(3)聚合物沉淀法通常使用將聚乙二醇作為介質(zhì)，通過降低外泌體的溶解度，然后離心獲得外泌體。聚合物沉淀法的優(yōu)勢在于操作簡單、反應(yīng)時間短，但該方法得到的外泌體純度和回收率較低，并容易產(chǎn)生假陽性，可能會影響后續(xù)功能實驗分析[12]。(4)色譜法則是依賴于色譜柱中分子的大小不同將外泌體提取出來，此方法得到的外泌體純度較高，但獲取量少且設(shè)備特殊。(5)免疫親和捕獲技術(shù)是根據(jù)標記物和抗體之間的特異性結(jié)合，從而由特定來源分離外泌體。其優(yōu)點在于對樣品的需求量較小，但儲存條件較為苛刻、易產(chǎn)生干擾蛋白的缺點使此方法無法得到推廣[13]。至于在研究人員提取外泌體的過程中采用何種技術(shù)，則取決于多種因素，包括起始基質(zhì)(細胞培養(yǎng)基與生物液)、起始體積、下游分析和研究問題等。

此外，在外泌體分離后，需要進行外泌體的鑒定。外泌體的鑒定可以分為物理分析及化學(xué)分析，物理分析包括納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)、動態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)、透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)和可調(diào)諧電阻脈沖傳感(tunable resistive pulse sensing，TRPS)等，此類物理分析可以洞察顆粒的大小和濃度?；瘜W(xué)分析通過染色、免疫印跡或蛋白質(zhì)組學(xué)分析來完成，并且可以提供有關(guān)孤立的小泡含量的信息。

2 糖尿病腎病發(fā)病及治療研究

2.1 外泌體參與DN的發(fā)病機制 DN的患病率隨著糖尿病患者的增加也在不斷上升，已發(fā)展成為危及人類健康的重要殺手。了解其發(fā)病機制對于DN的診斷和治療至關(guān)重要，而目前DN的發(fā)病機制尚未明確，可能是多因素共同作用的結(jié)果。有研究表明，腎臟分泌的外泌體在高糖刺激下誘導(dǎo)的細胞-細胞間的相互交談被認為在DN的發(fā)展和腎功能的下降中發(fā)揮著重要作用[14]。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)系膜細胞來源的外泌體通過增加TGF-β和TGF-β1/PI3K-Akt信號通路的分泌而誘導(dǎo)足細胞損傷，故含TGF-β1miRNA的外泌體可能是促進系膜擴張和腎纖維化的關(guān)鍵因子[16]。另外，來自高糖條件下的管狀細胞源外泌體可能會調(diào)節(jié)成纖維細胞的增殖和激活，參與旁分泌信號機制，導(dǎo)致DN腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[17]。其次，外泌體miRNA是DN進展中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，主要是在胰腺β細胞損傷和胰島素抵抗方面[18]。另外，在高糖條件下，Caspase-11/4和GSDMS介導(dǎo)的凋亡被激活并參與足細胞丟失和DN的發(fā)展[19]。此外，在高糖處理后，小鼠巨噬細胞來源的EVs miR-21-5p可以通過靶向A20提高炎癥小體NLRP3和IL-1β的水平，從而導(dǎo)致足細胞凋亡[20]。故外泌體及其miRNA可以通過介導(dǎo)多種病理因素來參與DN的發(fā)生和發(fā)展。

2.2 外泌體作為DN的診斷標志物 DN是糖尿病患者因腎臟結(jié)構(gòu)和功能的改變而引起的嚴重并發(fā)癥，若能在早期檢測到DN的診斷性生物標志物，可及時使用藥物減緩腎功能的喪失以及防止疾病進展。DN作為一種腎小球疾病，主要表現(xiàn)為K-W(Kimmelstiel-Wilson)病理性結(jié)節(jié)、腎小球系膜及基底膜增厚等。時至今日，DN傳統(tǒng)診斷方法仍然是通過測量腎小球濾過率、肌酐清除率、血清肌酐和蛋白尿來間接監(jiān)測腎功能，此類指標存在明顯的滯后性及偏倚。腎臟病理穿刺發(fā)現(xiàn)典型的K-W結(jié)節(jié)仍然是診斷DN的“金標準”。但腎臟病理檢查本身為一種有創(chuàng)性操作，存在禁忌證、并發(fā)癥的風(fēng)險，且該檢查復(fù)檢的可行性低，故尋求一種DN早期診斷的生物標志物至關(guān)重要。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)了外泌體作為生物學(xué)標記物，與DN密切相關(guān)，對預(yù)測疾病的發(fā)生及控制疾病的發(fā)展具有重要意義。

尿液作為發(fā)現(xiàn)腎臟疾病新生物標志物的理想生物樣本，具有無創(chuàng)采集且方便簡單的優(yōu)勢。Delic等[21]研究證明尿外泌體miRNA表達譜顯示了Ⅱ型DN患者的差異miRNA特征，其中14種miRNA上調(diào)，2種miRNA下調(diào)，且下調(diào)至少2倍。另外，Khan等[22]研究證明，通過尿外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)、尿可溶性蛋白的分析，可能有助于揭示DN進展中發(fā)生的病理生理改變。除了尿液來源外泌體，DN患者還有血清外泌體miRNA譜[23]。這些miRNAs均可能是診斷DN的候選標志物。

2.3 外泌體與DN的治療 由于外泌體具有雙層膜和納米尺度大小的生物特性，外泌體可以保護“貨物”不被補體固定或巨噬細胞清除，從而延長其循環(huán)半衰期，提高其生物活性。因此，外泌體可能被用作為治療疾病的藥物傳遞囊泡。Lee等[24]通過跟蹤6例經(jīng)活檢證實的DN患者，在其活檢時分離出尿外泌體，并通過二代測序分析包含的miRNA，最終找出了10個miRNA參與了已知的和新的DN發(fā)病機制信號通路。DN的進展和各通路密不可分，例如，在抑制足細胞Smad1/mTOR信號通路上，脂肪干細胞源外泌體(ADSCs derived exosomes，ADSCs-exo)通過增強miR-486的表達，可以明顯緩解DN癥狀[25]。此后，該團隊又發(fā)現(xiàn)ADSCs-Exo通過與ZEB2相關(guān)的機制對高糖誘發(fā)的足細胞上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程起到保護作用[26]。因此，ADSCs-Exo制劑可能是緩解足細胞功能障礙和DN臨床癥狀的有效治療策略。

此外，外泌體可以通過miR-4449調(diào)節(jié)促炎細胞因子的表達、ROS水平和細胞凋亡，遏制DN的病情進展[27]。Mao等[28]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)衍生的外泌體miR-let-7a與USP22有靶向關(guān)系：miR-let-7a可通過升高或沉默USP22來降低血清肌酐、尿素氮等指標，抑制腎細胞凋亡和氧化應(yīng)激，并抑制DN大鼠腎組織中N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達。人尿源干細胞(human urine derived stem cells, hUSC)外泌體中miR-16-5p過表達可保護高糖誘導(dǎo)的腎組織損傷，并促進血管內(nèi)皮生長因子 A (vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)表達和足細胞調(diào)亡[29]。這些外泌體攜帶的miRNA參與了DN的發(fā)病機制，也為DN的治療開拓了新空間。

除此之外，外泌體與巨噬細胞的交流在DN治療中也有著舉足輕重的地位，例如，外泌體miR-19b-3p介導(dǎo)了受損管狀上皮細胞與巨噬細胞之間的溝通，使M1巨噬細胞被激活,故外泌體/miR19b-3p/SOCS1軸在腎小管間質(zhì)炎癥中發(fā)揮了重要的病理作用[30]，此軸也代表了腎臟疾病的一個新的治療靶點。M2巨噬細胞亦可通過分泌外泌體miR-25-3p，抑制雙特異性磷酸酶1的表達從而激活細胞自噬，達到緩解高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷的目的[31]。

近年來，外泌體受到越來越廣泛的關(guān)注，外泌體不僅可以維持機體的正常生命活動，而且參與調(diào)控了腫瘤、免疫、組織修復(fù)等領(lǐng)域。隨著研究的深入，外泌體的提取愈發(fā)成熟，外泌體的更多功能被挖掘。但同樣存在著一些問題與挑戰(zhàn)：一是如何更快速、更高效、高純度地提取外泌體，二是更多未知的外泌體及其miRNA怎樣參與到DN的發(fā)病、診斷和治療中，需要進一步研究探討。