葛曉彤，葉慶元，王津津，張曦戈，王埡錚，王曉雨，冀吉昀，王勤濤

1.軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔生物工程技術(shù)研究中心，空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙周病科，陜西西安（710032）；2.軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院數(shù)字化口腔醫(yī)學(xué)中心，陜西西安（710032）

隨著口腔種植修復(fù)治療技術(shù)的不斷發(fā)展，影響種植體長(zhǎng)期穩(wěn)定性的生物學(xué)并發(fā)癥成為當(dāng)代口腔醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要課題［1］。種植體生物學(xué)并發(fā)癥主要指種植體周?chē)。ǚN植體周?chē)つぱ缀头N植體周?chē)?。種植體周?chē)つぱ资侵笡](méi)有支持骨或沒(méi)有持續(xù)性邊緣骨喪失的種植體周?chē)浗M織的炎癥性病變［2］，是程度較輕的種植體周?chē)膊?；而種植體周?chē)滓苑N植體周?chē)Y(jié)締組織的炎癥及支持骨組織的進(jìn)行性吸收為特征［3］，往往導(dǎo)致種植體預(yù)后不佳；一項(xiàng)meta 分析顯示，種植體周?chē)つぱ椎幕疾÷蕿?3.9% ～ 88.0%，種植體周?chē)谆疾÷蕿?.9%～45%［4］，這一方面表明種植體周?chē)〉幕疾÷瘦^高，另一方面也表明因不同人群、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、主客觀條件等影響其差異較大。Monje 等［5］的一項(xiàng)橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，在種植后平均46 個(gè)月的治療隨訪(fǎng)期中，堅(jiān)持進(jìn)行維護(hù)治療的患者比依從性差的患者被診斷為種植體周?chē)椎目赡苄愿　Ｒ虼?，菌斑控制是預(yù)防和治療種植體周?chē)〉年P(guān)鍵［6］。

種植體周的菌斑主要由革蘭陽(yáng)性需氧菌和革蘭陰性厭氧菌等組成，當(dāng)種植體周?chē)M織存在炎癥時(shí)，厭氧菌明顯增多［7］。此外，細(xì)菌定植主要與種植體表面特性有關(guān)［8］，因此，探索種植體表面清潔去污方式是否會(huì)改變種植體表面特性從而影響細(xì)菌黏附對(duì)于控制種植體早期黏膜炎癥以及加強(qiáng)日常定期維護(hù)尤為重要。目前治療種植體周?chē)〉姆椒ㄖ饕譃榉鞘中g(shù)治療和手術(shù)治療，非手術(shù)治療包括機(jī)械清創(chuàng)、噴砂處理、激光治療、光動(dòng)力療法等。然而，上述治療方式是否改變種植體表面特性及后續(xù)細(xì)菌黏附數(shù)量仍需要更多研究，目前種植體周?chē)〉奶幚砣匀狈J(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)化治療方案。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)評(píng)估光動(dòng)力療法、齦下噴砂以及鈦刮匙3 種目前常用的去污清潔方式對(duì)種植體鈦材表面特性的影響，并進(jìn)行細(xì)菌清除效率及后期細(xì)菌再次黏附的比較，為臨床預(yù)防及治療種植體周?chē)√峁?shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）（ATCC33277，空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室）；具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n）（ATCC10953，空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室）；純鈦試件（10 mm × 10 mm × 1.5 mm，弘森，中國(guó)）；厭氧產(chǎn)氣袋（MGC，日本）；腦心浸出液（BHI）培養(yǎng)基（海博，中國(guó)）；脫纖維羊血（鴻泉，中國(guó)）；氯化血紅素（海博，中國(guó)）；維生素K1（海博，中國(guó)）；活/死菌染色試劑盒（LIVE/DEAD BacLightTML7012，Invitrogen，美國(guó)）。恒溫培養(yǎng)箱（IFA-32-8，ESCO，新加坡）；生物安全柜（CB 800 V，蘇潔，蘇州）；原子力顯微鏡（5500，Keysight，中國(guó)），接觸角測(cè)量?jī)x（DSA25，Kruss，德國(guó)）；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（S4800，日立，日本）；激光共聚焦顯微鏡（FV3000，Olympus，日本）；酶標(biāo)儀（Infinite200，Tecan，瑞士）；光動(dòng)力儀（HHL-1000，Periowave，中國(guó)）；噴砂機(jī)（FT-200，EMS，瑞士）；鈦刮匙（IMPLG1/2T，Hu-Friedy，美國(guó)）。

1.2 試樣處理及制備

將純鈦鈦片依次使用800、1 200、1 500、2 000、3 000、5 000、7 000 目砂紙逐級(jí)打磨拋光至光滑鏡面，使用丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水依次超聲蕩洗15 min，干燥消毒備用。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)和菌液準(zhǔn)備

將Pg和Fn分別接種于BHI培養(yǎng)基中（每100 mL培養(yǎng)基中含BHI 5.2 g，脫纖維羊血10 mL，氯化血紅素0.5 mL，維生素K 100 μL），37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，利用比濁儀測(cè)定細(xì)菌光密度值，倍比稀釋至107CFU/mL。將無(wú)菌鈦試樣放入24 孔板中，分別將稀釋后的Pg菌液和Fn菌液接種于材料表面（1 mL/孔），置于37 ℃恒溫箱中厭氧培養(yǎng)48 h。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

將24 孔板中鈦試樣使用PBS 緩沖液沖洗3 次，隨機(jī)分為4 組，每組每種菌12 個(gè)試樣，處理組按以下方式進(jìn)行清潔和器械處理，所有操作均由同一名實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行。①鈦刮匙組（titanium curette，TiC）：使用鈦刮匙刮除鈦片表面細(xì)菌，力量與去除天然牙表面牙石相當(dāng)（約20 ～ 25 g），作用60 s；②光動(dòng)力組（photodynamic，PTD）：鈦片表面注射光敏劑1.5 μL，導(dǎo)光頭呈15 °照射60 s；③噴砂組（sandblasting，SB）：使用perio 模式，功率及水位調(diào)節(jié)至“Max”，距離鈦片表面約2 mm，作用30 s［9-10］；④對(duì)照組（NC）：表面不作任何去污處理。

1.5 鈦試樣表征

1.5.1 原子力顯微鏡測(cè)量粗糙度 每組每種菌任選3 個(gè)試樣臨界點(diǎn)干燥，利用原子力顯微鏡測(cè)量試樣表面粗糙度，每個(gè)試樣任取3 個(gè)測(cè)試點(diǎn)，結(jié)果取均值。

1.5.2 接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)量接觸角 每組每種菌任選3 個(gè)試樣臨界點(diǎn)干燥，濕度45%條件下，每次滴加2 μL 超純水于試樣上，待液滴形態(tài)趨于穩(wěn)定，利用接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)量水滴與試樣表面間的接觸角。每個(gè)試樣任取3 個(gè)測(cè)試點(diǎn)，結(jié)果取均值。

1.6 細(xì)菌黏附檢測(cè)

1.6.1 掃描電鏡觀察去污后的鈦表面形貌和細(xì)菌黏附形態(tài) 每組每種菌任選3 個(gè)試樣移至無(wú)菌24 孔板，2.5%戊二醛溶液固定4 h，PBS 沖洗，梯度乙醇（30%、50%、70%、90%、95%、100%）脫水，每個(gè)梯度7 min。干燥、噴金后置于掃描電鏡下觀察。1.6.2 活/死菌染色法觀察細(xì)菌活性 每組每種菌任選3 個(gè)試樣移至無(wú)菌24 孔板，參照微生物細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，配制檢測(cè)試劑，將試劑加入放置試樣的24 孔板中避光孵育15 min 后吸出，即刻置于激光共聚焦顯微鏡下拍攝熒光圖像，使用Image J 軟件將熒光圖像轉(zhuǎn)換成灰度圖，設(shè)定分析參數(shù)后獲得Mean（熒光強(qiáng)度）值。

1.7 細(xì)菌再黏附實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)1.4 中去污處理后的鈦試樣放入2 mL PBS 中使用震蕩機(jī)震蕩5 min，丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水依次超聲蕩洗15 min，高壓滅菌后分組放入24 孔板中，再次接種Pg菌液和Fn菌液（1 mL/孔），濃度為107CFU/mL，置于37 ℃恒溫箱中厭氧培養(yǎng)48 h 后按方法1.6 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組每種菌任選3 個(gè)試樣，重復(fù)3 次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢測(cè)各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)性，采用單因素方差分析比較不同組間整體差異，經(jīng)Levene’s 方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性者采用Bonferroni 進(jìn)行兩兩分析比較，若方差不齊者，采用Tamhane’s T2 進(jìn)行兩兩分析比較，檢測(cè)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 鈦試樣經(jīng)去污處理后表面粗糙度及接觸角比較

原子力顯微鏡觀測(cè)結(jié)果顯示，鈦刮匙組表面刮痕明顯，粗糙度顯著高于對(duì)照組、光動(dòng)力組及噴砂組（P＜0.05），對(duì)照組、光動(dòng)力組及噴砂組組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。接觸角測(cè)量結(jié)果顯示，各處理組表面接觸角均小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

Figure 1 Surface roughness change of titanium surfaces observed under atomic force microscopy after different decontamination treatments圖1 原子力顯微鏡下觀測(cè)經(jīng)不同去污處理后鈦試樣表面粗糙度改變

2.2 鈦試樣經(jīng)去污處理后掃描電鏡及熒光染色分析

掃描電鏡結(jié)果顯示，對(duì)照組鈦試樣表面細(xì)菌數(shù)量較多，且細(xì)菌相對(duì)集中，光動(dòng)力組、噴砂組、鈦刮匙組表面細(xì)菌散落分布，數(shù)量較少，且光動(dòng)力組表面大部分細(xì)菌菌體破裂（圖3a）。在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組鈦試樣表面黏附活菌量、死菌量及黏附總量用平均熒光強(qiáng)度，對(duì)照組表面視野內(nèi)有大片被熒光標(biāo)記的活菌，光動(dòng)力組表面死菌比例顯著高于對(duì)照組及噴砂組、鈦刮匙組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），噴砂組和鈦刮匙組表面剩余細(xì)菌以活菌為主，噴砂組表面細(xì)菌黏附量與對(duì)照組及光動(dòng)力組、鈦刮匙組相比顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3b～3d）。

Figure 3 Comparison of the remaining bacterial adhesion morphology and the number of live/dead bacteria on the titanium surfaces after different decontamination treatments圖3 經(jīng)不同去污處理后鈦試樣表面剩余細(xì)菌黏附形態(tài)及活/死菌數(shù)量比較

2.3 鈦試樣表面細(xì)菌再黏附的掃描電鏡及熒光染色分析

掃描電鏡結(jié)果顯示，鈦刮匙組表面牙齦卟啉單胞菌有聚集現(xiàn)象（圖4a）。在激光共聚焦顯微鏡下觀察，鈦刮匙組表面細(xì)菌黏附量顯著高于對(duì)照組及其余處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），光動(dòng)力組表面黏附死菌比例顯著高于對(duì)照組及其余處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4b～4d）。

Figure 4 Comparison of bacterial re-adhesion morphology and the number of live/dead bacteria on the titanium surfaces after different decontamination treatments圖4 經(jīng)不同去污處理后鈦試樣表面細(xì)菌再黏附形態(tài)及活/死菌數(shù)量比較

3 討 論

種植體周?chē)∈菍?dǎo)致種植失敗的重要因素之一，有學(xué)者通過(guò)20 年隨訪(fǎng)的縱向研究對(duì)種植體存活率進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)雖然種植義齒平均累計(jì)存活率高達(dá)94.6%［11］，但種植體周?chē)∪允亲畛Ｒ?jiàn)的生物學(xué)并發(fā)癥。種植體周?chē)つぱ妆憩F(xiàn)為探診時(shí)出血、紅腫和化膿，但僅累及黏膜而無(wú)邊緣骨的丟失，具有可逆性，被認(rèn)為是種植體周?chē)椎那罢?；種植體周?chē)壮つぱ装Y還表現(xiàn)為支持骨的喪失［2-3］。大量研究已經(jīng)證實(shí)，種植體周?chē)『芏嗍怯捎诰呱锬さ亩逊e引起，通過(guò)細(xì)菌增殖和生物膜的形成導(dǎo)致種植體周?chē)つぐl(fā)生炎癥，隨后引起支持骨的逐漸吸收［12］。有研究顯示，沒(méi)有進(jìn)行定期維護(hù)的患者患種植體周?chē)〉娘L(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)增加4.25 倍［13］。健康種植體周?chē)ㄖ驳募?xì)菌與天然牙類(lèi)似，大多為革蘭陽(yáng)性微需氧菌還有少量的革蘭陰性厭氧菌［14］，但當(dāng)種植體周?chē)l(fā)生炎癥時(shí)，革蘭陰性厭氧菌及產(chǎn)黑色素厭氧菌、螺旋體等數(shù)量開(kāi)始增多［7］；Sahrmann 等［15］通過(guò)比較健康種植體和炎癥種植體周?chē)⑸飯D譜發(fā)現(xiàn)，炎癥種植體周?chē)褐醒例l卟啉單胞菌、具核梭桿菌的檢出率明顯增加，金黃色葡萄球菌在黏膜炎周?chē)绕涫腔撐稽c(diǎn)檢出率較高［16］。因此，破壞及清除黏附在種植體表面的菌斑生物膜是治療種植體周?chē)〉挠行Х椒ā?/p>

由于種植體周?chē)∨c牙周病相似的臨床特征和病因，治療種植體周?chē)膊〉姆椒ù蠖嘤裳乐苎椎闹委煼绞竭w延而來(lái)，臨床常用于治療種植體周?chē)〉娜ノ鄯绞桨C(jī)械清創(chuàng)（如金屬刮匙、鈦刮匙、鈦刷、超聲潔治器等）、噴砂處理、激光治療、光動(dòng)力治療等，但由于種植體周?chē)旱膹?fù)雜性和種植體表面特性，理想的治療方式應(yīng)最大限度清除種植體表面黏附的菌斑生物膜，還要避免破壞種植體表面結(jié)構(gòu)，以期獲得良好的預(yù)后效果。大多數(shù)研究都基于對(duì)鈦種植體表面黏附生物膜的清除效率來(lái)評(píng)估去污結(jié)果，并未對(duì)后期細(xì)菌再次黏附鈦表面后形態(tài)及量的變化進(jìn)行分析比較，因此，本研究重點(diǎn)在于對(duì)不同去污方式是否使鈦表面性能發(fā)生改變，以及對(duì)細(xì)菌再附著的可能影響來(lái)進(jìn)行對(duì)比性評(píng)估，使臨床醫(yī)師了解不同去污方式的作用特點(diǎn)及參考選用。

金屬刮匙、超聲潔治器等傳統(tǒng)的機(jī)械清創(chuàng)方式被大量研究證實(shí)容易對(duì)鈦表面造成損傷，且清潔效率較低［17-18］；Larsen 等［19］發(fā)現(xiàn)鈦刷能夠明顯減少種植體表面牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量，但也有研究認(rèn)為鈦刷可能導(dǎo)致種植體表面微形貌發(fā)生顯著改變［20］。Huang 等［21］研究發(fā)現(xiàn)鈦刮匙會(huì)在鈦表面產(chǎn)生明顯劃痕，使鈦表面粗糙度及親水性顯著增加，這與本研究結(jié)果一致，這些變化可能有利于細(xì)菌黏附。在本研究的細(xì)菌再次黏附結(jié)果中顯示，即使是使用與種植體同質(zhì)的鈦刮匙去污處理后，鈦材表面的細(xì)菌黏附量仍然是最高的。綜上，機(jī)械去污使鈦表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的幾率最高，可能會(huì)影響后期細(xì)菌黏附及骨結(jié)合，因此，在常規(guī)臨床治療中，應(yīng)謹(jǐn)慎應(yīng)用。

噴砂的清潔效率受到噴砂粉的影響。Matsubara 等［22］對(duì)碳酸氫鈉噴砂粉、甘氨酸噴砂粉及赤蘚糖醇噴砂粉的去污能力和對(duì)種植體表面粗糙度影響進(jìn)行了體外評(píng)估，結(jié)果顯示碳酸氫鈉噴砂粉清潔能力最強(qiáng)，但會(huì)顯著增加鈦種植體表面粗糙度，甘氨酸及赤蘚糖醇噴砂粉對(duì)種植體表面粗糙度無(wú)明顯影響，但清潔能力有限。本研究選用了最新改進(jìn)的赤蘚糖醇噴砂粉，結(jié)果顯示赤蘚糖醇噴砂粉處理相對(duì)于其他處理組而言，其對(duì)鈦表面細(xì)菌生物膜清除率最高，且對(duì)其表面粗糙度無(wú)明顯影響，但會(huì)增加其表面親水性，這有利于后期細(xì)胞與材料表面結(jié)合［23］，但也可能會(huì)使細(xì)菌更容易定植。因此本研究同時(shí)對(duì)細(xì)菌再次黏附在材料表面進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示，黏附量與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。這一現(xiàn)象可能與種植體結(jié)構(gòu)有關(guān)，鈦種植體的螺紋結(jié)構(gòu)可能使清潔效率降低，但新型齦下噴砂嘴能夠深入袋內(nèi)進(jìn)行清潔，這對(duì)種植體周?chē)膊〉闹委煂⒕哂蟹e極意義。

光動(dòng)力作為一種新穎的光化學(xué)療法，通過(guò)激光與光敏劑發(fā)生的光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）具有殺滅細(xì)菌，滅活細(xì)菌內(nèi)毒素等效果［24］，已被用于牙周病和種植體周?chē)〉闹委?。一?xiàng)使用光動(dòng)力療法作為機(jī)械去污的輔助治療種植體周?chē)椎呐R床研究結(jié)果顯示，光動(dòng)力療法能夠有效改善種植體周?chē)咴u(píng)分、探診深度、探診出血和臨床附著喪失，減輕種植體周?chē)装Y，其中牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量顯示出明顯下降［25］，本研究同樣發(fā)現(xiàn)光動(dòng)力對(duì)于牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌的殺滅作用顯著，這與Sayar等［26］的研究結(jié)果相同，Huang 等［27］解釋為在病變的種植體周?chē)课患尤牍饷魟┯兄谕ㄟ^(guò)靶向細(xì)菌的細(xì)菌膜來(lái)減少細(xì)菌含量，這表明光動(dòng)力療法是一種有效的種植體周感染輔助治療手段。

本研究對(duì)光動(dòng)力、噴砂、鈦刮匙三種常用的去污清潔方式對(duì)細(xì)菌定植的鈦表面形貌、清除效率及細(xì)菌再次黏附能力進(jìn)行了對(duì)比性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，噴砂在機(jī)械去污方面表現(xiàn)較好，能夠去除鈦表面大部分細(xì)菌，但在細(xì)菌再次黏附的結(jié)果中，筆者發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌與具核梭桿菌在鈦材表面的黏附力有一定差異，這提示下一步應(yīng)深入比較不同細(xì)菌間的生物學(xué)差異。光動(dòng)力在殺菌方面具有優(yōu)越性，且細(xì)菌再次黏附于鈦表面后發(fā)現(xiàn)為死菌黏附量增多，其內(nèi)在機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究探討；鈦刮匙對(duì)細(xì)菌清除效率較低，并且會(huì)使鈦表面性能改變，增加細(xì)菌后期黏附效果，同時(shí)筆者也注意到了牙齦卟啉單胞菌與具核梭桿菌在各組的表現(xiàn)不盡一致，這可能與不同細(xì)菌本身的一些特性有關(guān)，后續(xù)計(jì)劃下一步從擴(kuò)大樣本量及不同細(xì)菌生物學(xué)分析等不同方面進(jìn)行研究和證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示噴砂處理聯(lián)合光動(dòng)力療法可能對(duì)種植體周?chē)膊〉闹委煾鼮橛行?，但本研究為體外實(shí)驗(yàn)，未來(lái)仍需更多體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

【Author contributions】Ge XT performed the experiments and wrote the article.Ye QY, Wang JJ, Zhang XG, Wang YZ, Wang XY and Ji JY performed the experiments and revised the article.Wang QT designed the study and revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.