黃婷婷 鄭殿峰 馮乃杰 趙黎明 周鴻凱 沈雪峰*

（1 廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2 國(guó)家耐鹽堿水稻技術(shù)創(chuàng)新中心 華南中心，廣東 湛江 524088；*通訊作者）

近年來，土壤鹽漬化問題已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，全球20%以上的耕地受到鹽脅迫的影響，且數(shù)量還在增加[1]。其中，中國(guó)鹽漬土總面積為3.6×107hm2，占可耕地總面積的4.88%，且還有9.2×107hm2的耕地正面臨著鹽漬化的危害[2]。全球農(nóng)業(yè)正面臨重大挑戰(zhàn)，到2050 年，全世界將新增23 億人口，糧食作物產(chǎn)量需增加70%[3]。可見，鹽脅迫是限制糧食作物生產(chǎn)的重要問題，是世界范圍內(nèi)影響作物產(chǎn)量的最重要環(huán)境壓力之一。

水稻是全球重要的糧食作物之一，也是對(duì)鹽脅迫較為敏感的作物，隨著全球氣候變暖及生態(tài)環(huán)境不斷惡化，水稻生長(zhǎng)過程中遭受干旱、高鹽等非生物脅迫在增加[4]。鹽脅迫作為主要的非生物脅迫之一，嚴(yán)重影響水稻的生長(zhǎng)發(fā)育[5]。植物鹽脅迫一般表現(xiàn)為滲透脅迫和離子毒害兩個(gè)階段，引起植株體內(nèi)活性氧破壞、膜系統(tǒng)損傷、光合和呼吸作用受抑制、酶活性降低等，表現(xiàn)為植株矮小、葉片黃化，最終導(dǎo)致糧食產(chǎn)量、品質(zhì)的下降[6-7]。多胺（Polyamines，PAs）主要包括腐胺（二胺，Putrescine，Put）、亞精胺（三胺，Spermidine，Spd）和精胺（四胺，Spermine，Spm），是生物代謝過程中產(chǎn)生的一類具有生物活性的低分子量脂肪族含氮堿，廣泛作用于高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、防止衰老、抵抗環(huán)境脅迫等方面[8]。大量研究表明，外源Spd 能夠在一定程度上緩解鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)[9-12]。但目前關(guān)于鹽脅迫條件下施用外源Spd 對(duì)水稻根系生長(zhǎng)的影響報(bào)道較少。本文以水稻為研究對(duì)象，探討在鹽脅迫下外源Spd 對(duì)水稻幼苗根系的抗氧化防御和Na+穩(wěn)態(tài)的影響，為鹽脅迫下水稻的科學(xué)栽培提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻品種為黃華占，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供?；瘜W(xué)試劑有：2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2,7 -Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA）和二氫乙啶（Dihydroethidium, DHE），購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；羥基苯基熒光素（HPF）和SBFI AM（Na+Indicator）鈉離子指示探針，購(gòu)于上海懋康生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2021 年3 月至7 月在廣東海洋大學(xué)興農(nóng)樓112 室進(jìn)行。挑選籽粒飽滿、大小相似的水稻種子，經(jīng)5%的過氧化氫消毒15 min 后，用去離子水沖洗3～5 遍，置于恒溫培養(yǎng)箱中（28 ℃）培養(yǎng)并催芽1 d，從中挑選露白一致的種子，將其放置于含有1/2 倍Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液發(fā)芽盒中進(jìn)行培養(yǎng)。

試驗(yàn)分為3 部分進(jìn)行：①NaCl 對(duì)水稻幼苗根系的影響。水稻種子催芽1 d 后，取露白一致的種子，分別定植于含有0、25、50、100、150 和200 mmol/L NaCl 濃度梯度的1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液的發(fā)芽盒中進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置6 次重復(fù)，72 h 后取樣、測(cè)定植株生長(zhǎng)指標(biāo)。②外源Spd 對(duì)NaCl 脅迫下水稻幼苗根系生長(zhǎng)的影響。水稻種子催芽1 d 后，依據(jù)試驗(yàn)①篩選出的鹽濃度，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 mmol/L Spd 溶 液 的1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液的發(fā)芽盒中培養(yǎng)，試驗(yàn)設(shè)置5 次重復(fù)，72 h 后取樣，測(cè)定植株生長(zhǎng)指標(biāo)。③外源Spd 對(duì)鹽脅迫下水稻幼苗根系的抗氧化防御和Na+穩(wěn)態(tài)的影響。水稻種子催芽1 d 后，依據(jù)試驗(yàn)①和試驗(yàn)②篩選出的NaCl濃度和Spd 濃度，設(shè)置4 個(gè)處理：僅用營(yíng)養(yǎng)液（CK）、0.1 mmol/L Spd、100 mmol/L NaCl、100 mmol/L NaCl + 0.1 mmol/L Spd。每個(gè)處理5 次重復(fù)，120 h 后測(cè)定根長(zhǎng)，并取根樣進(jìn)行生理分析和組織化學(xué)檢測(cè)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 組織化學(xué)檢測(cè)

分別采用熒光探針DCFH-DA、DHE、HPF 檢測(cè)水稻幼苗根尖細(xì)胞中的總ROS、·O2-、H2O2含量。應(yīng)用鈉離子指示探針測(cè)定幼苗根尖細(xì)胞中的Na+含量[13-14]。

1.3.2 生理指標(biāo)

于水稻培養(yǎng)72 h 后，進(jìn)行根系取樣，立即置于液氮中速凍，移至-20 ℃冰箱保存，待測(cè)。通過測(cè)定硝基藍(lán)四唑（NBT）的光化學(xué)還原測(cè)定SOD 活性：反應(yīng)混合物（3 mL）由酶提液（30 μL）、PBS（50 mmol/L, pH 7.8）、EDTA（3 mmol/L）、核黃素（60 μmol/L）、NBT（2.25 μmol/L）和甲硫氨酸（14.5 mmol/L）組成。測(cè)定560 nm 波長(zhǎng)下的吸光度，計(jì)算SOD 活性（1 單位）作為酶促量，得到最大NBT 還原抑制量的一半。

通過測(cè)定CAT 對(duì)H2O2的分解能力來測(cè)定其活性：將30%的H2O2加入含50 mmol/L、pH 7.8、10 mL 的PBS 和酶提液的反應(yīng)混合液中，立即記錄在240 nm 處的吸光度。CAT 活性以每分鐘分解H2O2（1 mol）的酶量來量化。

通過測(cè)定POD 對(duì)H2O2的氧化能力來測(cè)定其活性：將愈創(chuàng)木酚加入PBS（pH 6.0，0.2 mol/L）緩沖液中，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至溶解，待溶液冷卻后加入19 μL 30%的H2O2。取3 mL 反應(yīng)液并加入40 μL 酶液后，通過測(cè)定470 nm 下吸光值變化，測(cè)定過氧化物酶活性。

根據(jù)丙二醛（MDA）在高溫、酸性條件下與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)，形成在532 nm 波長(zhǎng)處有最大光吸收的三甲基復(fù)合物。分別于450、532 和600 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定OD 值，確定MDA 含量。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

采用Image pro-plus 6.0 對(duì)熒光圖片進(jìn)行定量分析，經(jīng)SPSS 23.0 進(jìn)行方差分析，由Excel 2013 作圖，進(jìn)行單因素方差（ANOVA）的Duncan 顯著性分析（p<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl 和Spd 對(duì)水稻幼苗根系生長(zhǎng)的影響

由圖1 可知，隨著NaC1 濃度的升高，水稻幼苗的根長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。其中，25 mmol/L NaC1處理下根長(zhǎng)最長(zhǎng)，與對(duì)照相比，50、100、150 和200 mmol/L NaC1 處理下根長(zhǎng)顯著降低，分別下降86.95%、91.83%、93.37%和94.24%。鹽脅迫條件下，施用外源Spd 水稻幼苗的根長(zhǎng)均有不同程度增加，且隨著Spd濃度增加呈先上升后下降趨勢(shì)（圖2）。與對(duì)照相比，施用0.10 mmol/L Spd 處理的水稻幼苗根長(zhǎng)增加13.38%，達(dá)到顯著水平；而施用0.50 mmol/L Spd 處理抑制作用最強(qiáng)，根長(zhǎng)與對(duì)照相比顯著降低25.75%。因此，選擇100 mmol/L NaCl 和0.10 mmol/L Spd 作為后續(xù)試驗(yàn)處理濃度。

圖1 不同濃度NaCl 對(duì)水稻幼苗根系生長(zhǎng)的影響

圖2 不同濃度Spd 對(duì)鹽脅迫下水稻幼苗根系生長(zhǎng)的影響

2.2 外源Spd 對(duì)鹽脅迫下水稻幼苗根系生長(zhǎng)的影響

由圖3 可以看出，與對(duì)照相比，NaCl 處理水稻幼苗根長(zhǎng)顯著下降23.79%。與NaCl 處理相比，Spd+NaCl 處理幼苗根長(zhǎng)顯著增加14.62%。說明外源Spd 能夠緩解鹽脅迫對(duì)水稻根系生長(zhǎng)的抑制作用。

圖3 外源Spd 對(duì)鹽脅迫下水稻幼苗根系生長(zhǎng)的影響

2.3 外源Spd 對(duì)鹽脅迫下水稻幼苗根系中ROS、·O2-、H2O2 生成的影響

由圖4 可知，與對(duì)照相比，NaCl 處理下水稻幼苗根系的DCF（2',7'-二氯熒光素）熒光密度增加120.51%，幼苗根系中H2O2和·O2－水平分別增加29.52%和18.68%，均達(dá)到顯著水平；與NaCl 處理相比，Spd+NaCl處理下幼苗根系的DCF 熒光密度顯著降低31.54%，H2O2水平和·O2-水平顯著降低16.39%和14.36%?？梢姡庠碨pd 能夠在一定程度上抑制NaCl 誘導(dǎo)的ROS在水稻幼苗根系中的積累。

圖4 外源Spd 對(duì)鹽脅迫下水稻幼苗根系中H2O2、·O2-和ROS的影響

2.4 外源Spd 對(duì)鹽脅迫下水稻幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖5 可以看出，與對(duì)照相比，NaCl 處理水稻幼苗根系中的CAT 和POD 活性分別顯著降低54.28%和20.36%；與NaCl 處理相比，Spd+NaCl 處理幼苗根系中的CAT 和POD 活性分別顯著升高36.21%和22.25%。但不同處理間的SOD 酶活性差異不顯著。可見，外源Spd 能夠在一定程度抑制NaCl 誘導(dǎo)的水稻幼苗根系抗氧化酶活性，提高其清除體內(nèi)活性氧能力，有效降低氧化傷害程度。

圖5 外源Spd 對(duì)鹽脅迫下水稻幼苗根系抗氧化酶活性的影響

2.5 外源Spd 對(duì)鹽脅迫下水稻幼苗MDA 含量的影響

由圖6 可以看出，與對(duì)照相比，NaCl 處理水稻幼苗根系中的MDA 含量顯著增加149.88%；與NaCl 處理相比，Spd+NaCl 處理幼苗根系中MDA 含量顯著降低31.01%。這說明外源Spd 能有效降低鹽脅迫下活性氧引起的傷害，進(jìn)而緩解膜脂過氧化傷害，降低細(xì)胞膜的受損程度。

圖6 外源Spd 對(duì)鹽脅迫下水稻幼苗根系MDA 含量的影響

2.6 外源Spd 對(duì)鹽脅迫下水稻幼苗Na+的影響

由圖7 可知，與對(duì)照相比，NaCl 處理水稻幼苗根系中Na+熒光密度顯著增加35.52%。與NaCl 處理相比，Spd+NaCl 處理根系中Na+熒光密度顯著下降13.31%。說明外源Spd 可以減少根系中過多的Na+，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

圖7 外源Spd 處理對(duì)鹽脅迫下水稻幼苗根系Na+熒光密度的影響

3 討論

鹽脅迫是限制水稻生長(zhǎng)和產(chǎn)量形成的主要非生物脅迫之一[15]。大量研究表明，鹽脅迫抑制水稻種子的萌發(fā)、幼苗的生長(zhǎng)和根系的建成[6-7，11]。本研究中，50 mmol/L及以上濃度NaCl 處理顯著降低水稻幼苗的根長(zhǎng)，這與王燕等[9]的報(bào)道一致。

Spd 作為一種生理活性物質(zhì)，在參與調(diào)控植物各種抗逆性中發(fā)揮重要作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)，施用外源Spd提高幼苗抗氧化和滲透調(diào)節(jié)能力，維持葉片PSII 的活性和電子傳遞鏈的穩(wěn)定性，提高光合作用，減輕離子毒害，有效提高水稻、燕麥、甜高粱等作物的耐鹽性[9-12]。本試驗(yàn)中，在100 mmol/L NaCl 條件下，施加0.10 mmol/L Spd 能夠緩解鹽脅迫誘導(dǎo)的根系生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，這與李瑤等[7]采用調(diào)環(huán)酸鈣提高水稻幼苗鹽脅迫的研究結(jié)果一致。

在非生物逆境脅迫下，植物體內(nèi)大量積累活性氧（ROS），而過量的活性氧往往引起蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物甚至DNA 的破壞，造成植物細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p壞甚至死亡[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，NaCl 處理下水稻幼苗根系的ROS、·O2－和H2O2的含量顯著上升，且MDA 水平也隨著升高。這與鄒芳等[12]鹽脅迫處理甜高粱的結(jié)果一致。抗氧化酶是植物體內(nèi)ROS 清除系統(tǒng)，主要通過SOD、CAT 和POD 保護(hù)酶發(fā)揮作用，平衡細(xì)胞內(nèi)部的ROS[6]。首先由SOD 將·O2－歧化為H2O2和O2，再經(jīng)CAT 和POD 將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O 和O2。本研究中，SOD 酶活性無變化，而CAT 和POD 酶活性顯著降低，這與劉玲等[9]研究結(jié)果一致。本研究中，在100 mmol/L NaCl 條件下，施加0.1 mmol/L Spd 處理能夠顯著增強(qiáng)水稻幼苗根系中SOD、POD 和CAT 活性，MDA含量同步下降，這與海霞等[10]的研究結(jié)果一致。

在鹽脅迫條件下，保持植株體以及細(xì)胞內(nèi)的離子平衡是至關(guān)重要的。鹽生植物可以通過自身的Na+排除和Na+分隔來解毒過量的Na+[19]。本研究中，在100 mmol/L NaCl 條件下，施加0.1 mmol/L Spd 處理可以顯著降低水稻幼苗根系中Na+的含量，這與海霞等[10]的報(bào)道一致。

4 結(jié)論

綜上所述，在100 mmol/L NaCl 條件下，施加0.1 mmol·L-1Spd 處理，顯著提高水稻幼苗根系中SOD、POD、CAT 等抗氧化酶活性，降低ROS、·O2－和H2O2含量、MDA 生成量和Na+含量，減輕鹽脅迫下的氧化損傷，維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性。可見，0.10 mmol/L Spd 處理可以修復(fù)水稻幼苗因滲透脅迫和離子毒害引起的傷害，維持生理代謝和生化反應(yīng)的穩(wěn)定狀態(tài)，以增強(qiáng)水稻幼苗根系的抗鹽性。