余長云，張倩倩，薛彬彬，張彩，張晨，李金映，曹華，吉倩婧

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，河南 鄭州 450052)

口底鱗狀細(xì)胞癌(簡稱口底鱗癌)系原發(fā)于口底黏膜的癌癥，是口腔頜面部腫瘤中較為常見的惡性腫瘤之一，具有易發(fā)生局部浸潤和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點[1-2]。目前，口底鱗癌的治療方式是以手術(shù)切除為主，并輔以放療、化療、基因治療的綜合治療。近年來，盡管診斷及治療手段不斷更新改進(jìn)，口底鱗癌患者的生存率及生存質(zhì)量并未得到顯著提高，其中重要原因就是腫瘤的早期轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)[3-5]。研究表明，大部分患者就診時已出現(xiàn)局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這部分患者容易復(fù)發(fā)，預(yù)后相對較差[6-7]。因此，探索新的對腫瘤預(yù)后有價值的檢測指標(biāo)，對提高口底鱗癌患者的生存率及生存質(zhì)量將具有重要意義。

長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt、不編碼蛋白的RNA，參與發(fā)育、分化、代謝等多方面的調(diào)控[8-9]。研究表明，lncRNA 在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞生長、分化、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、干細(xì)胞特性、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為相關(guān)[10-12]。近期，越來越多的證據(jù)表明，lncRNA可作為包括乳腺癌、肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤診斷或預(yù)后標(biāo)志物[13-15]。然而，目前l(fā)ncRNA與口底鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系并不十分清楚。在本研究中，以癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，采用Cox回歸分析構(gòu)建新的具有預(yù)測價值的lncRNA風(fēng)險模型，以期為口底鱗癌患者的生存預(yù)測提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 資料下載本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫下載原始研究數(shù)據(jù)集(https://cancergenome.nih.gov/)，并從中提取lncRNA表達(dá)矩陣。納入標(biāo)準(zhǔn)：口底鱗癌患者；完整的lncRNA表達(dá)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息；完整的隨訪資料。本研究共納入54例口底鱗癌樣本及3例對應(yīng)癌旁組織樣本。

1.2 lncRNA差異表達(dá)譜分析將下載的原始口底鱗癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(count)進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換，并添加基因?qū)傩?，提取lncRNA表達(dá)矩陣。在R語言軟件中，采用edgeR包對下載的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，先對表達(dá)量(count)進(jìn)行校正，并計算變異數(shù)；然后根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)(P≤0.001，倍數(shù)變化≥2)篩選在口底鱗癌組織和對應(yīng)癌旁組織樣本中差異表達(dá)的lncRNA。

1.3 lncRNA風(fēng)險預(yù)測模型的構(gòu)建采用單變量Cox回歸分析篩選與患者總生存率相關(guān)的差異表達(dá)lncRNA，將P<0.01的lncRNA納入隨后的多變量Cox回歸分析中，并刪除信息量重疊的lncRNA，建立lncRNA口底鱗癌預(yù)后模型。根據(jù)模型中l(wèi)ncRNA的表達(dá)量及表達(dá)系數(shù)計算口底鱗癌患者的風(fēng)險評分(risk score，RS)。采用如下公式計算風(fēng)險評分[16]：

S=ΣβiXi。

式中S為風(fēng)險評分，βi為lncRNA的表達(dá)系數(shù)，Xi為lncRNA在口底鱗癌患者中的表達(dá)水平。

1.4 檢測風(fēng)險評分與口底鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)性根據(jù)風(fēng)險評分公式計算每例口底鱗患者的風(fēng)險評分，按照中位風(fēng)險值將口底鱗癌患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組(風(fēng)險評分高于或等于中位風(fēng)險值的患者為高風(fēng)險組，風(fēng)險評分低于中位風(fēng)險值的患者為低風(fēng)險組)，繪制風(fēng)險評分曲線、生存狀態(tài)散點圖及l(fā)ncRNA的表達(dá)熱圖。Kaplan-Meier法繪制高、低風(fēng)險組患者的生存曲線。繪制受試者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線以評估口底鱗癌患者風(fēng)險評分對生存評估的靈敏度和特異度，曲線下面積(the area under curve，AUC)越接近1表明預(yù)測性能越好。

1.5 統(tǒng)計分析本研究中所有統(tǒng)計分析均在R軟件(版本3.5.1)中進(jìn)行。采用edgeR包篩選差異lncRNA；Survival包進(jìn)行單變量和多變量Cox風(fēng)險回歸分析，并建立基于多個lncRNA的風(fēng)險預(yù)測模型；Survival ROC包繪制ROC曲線，并計算AUC。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)lncRNA在口底鱗癌組織與對應(yīng)癌旁組織中共識別出138個差異lncRNA，其中40個上調(diào)lncRNA和98個下調(diào)lncRNA，圖1中熱圖和火山圖顯示上調(diào)和下調(diào)的差異lncRNA。根據(jù)倍數(shù)變化(fold change，F(xiàn)C)值排序前10位差異表達(dá)lncRNA，表1中顯示前5位上調(diào)和下調(diào)的lncRNA。

A為熱圖;B為火山圖。圖1 138個差異表達(dá)lncRNA的熱圖和火山圖

表1 前5位下調(diào)和上調(diào)的lncRNA

2.2 口底鱗癌患者lncRNA風(fēng)險預(yù)測模型的建立對篩選出的40個上調(diào)lncRNA和98個下調(diào)lncRNA進(jìn)行單變量Cox回歸分析，確定與口底鱗癌患者總生存相關(guān)的lncRNA。根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)(P<0.01)，納入5個與總生存期相關(guān)的lncRNA(MIR1-1HG、HOXC13-AS、RAMP2-AS1、LINC02454、LINC00702)，進(jìn)一步使用多變量Cox回歸對5個lncRNA與生存的關(guān)系進(jìn)行分析，并刪除信息量重疊的lncRNA，最終建立包含MIR1-1HG、HOXC13-AS、RAMP2-AS1的3個lncRNA的口底鱗癌患者風(fēng)險預(yù)測模型，一致性系數(shù)(concordance index，CI)為0.77(表2，圖3)。S=0.291X1+0.280X2-0.433X3，S為風(fēng)險評分，X1為MIR1-1HG的表達(dá)水平，X2為HOXC13-AS的表達(dá)水平，X3為RAMP2-AS1的表達(dá)水平。風(fēng)險系數(shù)顯示MIR1-1HG、HOXC13-AS為危險因素(β>0)，RAMP2-AS1為保護(hù)因素(β<0)(表2)。Kaplan-Meier生存曲線顯示MIR1-1HG、HOXC13-AS高表達(dá)組患者生存率低于低表達(dá)組患者，RAMP2-AS1高表達(dá)組患者生存率高于低表達(dá)組患者(圖2)。

表2 多變量Cox回歸分析結(jié)果

圖2 口底鱗癌患者預(yù)后相關(guān)lncRNA的Kaplan-Meier生存曲線

圖3 多變量Cox回歸模型中3個lncRNA森林圖

2.3 lncRNA預(yù)測模型的評估風(fēng)險評分曲線(圖4)、生存狀態(tài)散點圖(圖4)顯示，隨著風(fēng)險評分的增高，患者死亡率也增高。風(fēng)險基因表達(dá)熱圖(圖4)顯示，MIR1-1HG、HOXC13-AS在高風(fēng)險口底鱗癌患者中表達(dá)相對較高，而RAMP2-AS1在低風(fēng)險口底鱗癌患者中表達(dá)相對較高。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，高風(fēng)險口底鱗癌患者的總生存率低于低風(fēng)險口底鱗癌患者(P<0.001)(圖5)。ROC曲線顯示口底鱗癌預(yù)后相關(guān)lncRNA AUC為0.895，模型具有較好的靈敏度和特異度(圖6)。

A為風(fēng)險評分點圖；B為生存時間點圖；C為lncRNA表達(dá)熱圖。圖4 風(fēng)險評分與生存時間點圖及相關(guān)lncRNA表達(dá)熱圖

圖5 高、低風(fēng)險組口底鱗癌患者的Kaplan-Meier生存分析

圖6 多變量Cox分析模型ROC曲線

3 討論

口底區(qū)域解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有豐富的淋巴管，相對口腔其他部位，該部位腫瘤更易淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[17]，預(yù)后較口腔其他部位腫瘤差，患者生存質(zhì)量及生存率均較低[18-19]。因此，口底鱗癌的早期篩查及早期干預(yù)至關(guān)重要。目前，TNM分期系統(tǒng)常用于臨床確定治療方案、評估治療效果及預(yù)后。然而，TNM分期僅考慮腫瘤的臨床特點，并未考慮腫瘤的分子特點，并不能精確反映腫瘤特征，尤其是早期腫瘤[20]。同一分期的腫瘤具有不同的進(jìn)展正說明了這一點[4]。因此，急需尋找新的、有效的預(yù)后指標(biāo)用于口底鱗癌患者預(yù)后評估及治療方案的指導(dǎo)。

隨著生物信息技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究人員開始關(guān)注lncRNA對腫瘤患者預(yù)后的意義。一些lncRNA具有組織特異性，在疾病發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。Zhang等[21]觀察到在胃癌中，lncRNA AOC4P可通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，進(jìn)而促進(jìn)胃癌不良預(yù)后。Bo等[22]的研究表明，lncRNA AFAP1-AS1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Beltrán-Anaya等[23]的研究也證實lncRNA KLHDC7B的低表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)。

在本研究中，共篩選出138個差異lncRNA，其中40個上調(diào)lncRNA和98個下調(diào)lncRNA。通過單變量和多變量Cox回歸分析，構(gòu)建了一個基于3-lncRNA的風(fēng)險模型預(yù)測口底鱗癌患者的預(yù)后，該模型的一致性系數(shù)為0.77。風(fēng)險分層及ROC曲線分析結(jié)果顯示，高風(fēng)險組患者生存率及生存時間低于低風(fēng)險組患者，ROC曲線下面積為0.895。這些表明，基于這3個lncRNA的風(fēng)險預(yù)測模型具有很好的靈敏度和特異度，能為口底鱗癌患者提供一個很好的預(yù)測工具。

模型中3個lncRNA中僅HOXC13-AS、RAMP2-AS1在口底鱗癌及其他腫瘤中被研究過。Li等[24]研究表明，HOXC13-AS在乳腺癌中高表達(dá)，并通過miR-497-5p/PTEN通路促乳腺癌細(xì)胞增殖。一項鼻咽癌的研究表明，HOXC13-AS在鼻咽癌組織中高表達(dá)，并通過miR-383-3p/HMGA2通路促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲[25]。在口腔鱗癌中，HOXC13-AS呈高表達(dá)，可作為競爭性內(nèi)源RNA，通過miR-378g/HOXC13軸促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化形成[26]。本研究中HOXC13-AS風(fēng)險系數(shù)大于0，且高表達(dá)HOXC13-AS組患者生存率低于低表達(dá)組患者，這些提示HOXC13-AS在口底鱗癌發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用。在舌鱗狀細(xì)胞癌中，檢測舌鱗狀細(xì)胞癌中l(wèi)ncRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HOXC13-AS與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[27]。本研究中RAMP2-AS1風(fēng)險系數(shù)小于0，且高表達(dá)RAMP2-AS1組患者生存率低于低表達(dá)組患者，提示RAMP2-AS1可抑制喉鱗癌發(fā)生發(fā)展。以上這些表明，本研究篩選出的lncRNA將為口底鱗癌研究提供新的生物指標(biāo)。

本研究經(jīng)過TCGA口底鱗癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫的挖掘，篩選出差異表達(dá)lncRNA，并成功構(gòu)建一個基于3個lncRNA的新的口底鱗癌風(fēng)險預(yù)測模型，為口底鱗癌風(fēng)險分層及臨床預(yù)后判斷提供幫助，并為基礎(chǔ)研究提供更多可供選擇的生物標(biāo)志物。該模型僅包含3個lncRNA，在臨床應(yīng)用中可操作性強(qiáng)。然而，一方面本研究納入患者相對較少，模型的預(yù)測能力仍需大量臨床試驗證據(jù)證實；另一方面，納入模型的lncRNA在口底鱗癌細(xì)胞及生物體內(nèi)的功能尚不明確，其在口底鱗癌發(fā)生發(fā)展中起的作用尚缺乏實驗證據(jù)的支持，仍需進(jìn)一步的功能實驗研究。