冉鵬飛，王艷敏，關(guān)曉蕾，張雅素

1.平頂山市第一人民醫(yī)院，河南 平頂山 467000； 2.平頂山市中醫(yī)醫(yī)院，河南 平頂山 467000； 3.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

流行病學(xué)研究顯示，全世界每年約有1 500萬(wàn)新發(fā)腦卒中患者，而我國(guó)每年新發(fā)病例約150～200萬(wàn)，且每年以9%的發(fā)病速度上升，約70%～80%腦卒中患者會(huì)遺留不同程度功能障礙[1]，其中以肢體痙攣?zhàn)顬槌Ｒ?jiàn)，痙攣可阻礙機(jī)體運(yùn)動(dòng)功能重建，影響神經(jīng)功能恢復(fù)，是腦卒中康復(fù)治療的重難點(diǎn)[2]。近年，中醫(yī)療法在腦卒中恢復(fù)中顯示出獨(dú)特治療價(jià)值，氣血逆亂、上犯于腦是其主要病機(jī)，而針刺可通過(guò)辨證取穴刺激促進(jìn)腦損傷恢復(fù)，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)可[3-5]。中醫(yī)依據(jù)“少陽(yáng)主樞”理論提出通利少陽(yáng)樞機(jī)法防治中風(fēng)相關(guān)性疾病，研究發(fā)現(xiàn)，其可提高患者活動(dòng)能力與生活質(zhì)量[6-7]。研究證明，Notch通路與神經(jīng)損傷性疾病密切相關(guān)，可調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞分化、存活、凋亡等，在神經(jīng)發(fā)育、再生中起決定作用[8]?；诖?，本研究以Notch通路為切入點(diǎn)，探討通利樞機(jī)針刺法對(duì)腦卒中后肢體痙攣大鼠神經(jīng)與肢體功能的改善作用及其機(jī)制，為腦卒中后肢體痙攣的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠80只，體質(zhì)量 260～300 g，8周齡，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005，自由飲水?dāng)z食，滅菌型飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度21～25 ℃，濕度30 %～33 %，每3日更換墊料1次，12 h晝夜循環(huán)照明，實(shí)驗(yàn)操作符合平頂山市第一人民醫(yī)院動(dòng)物倫理學(xué)批準(zhǔn)，倫理批號(hào)：20200312。

1.2 藥品與試劑N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR，上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，貨號(hào)：YM-kk9079)；DAPT(γ-分泌酶抑制劑，分子式：C23H26F2N2O4，美國(guó)Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)：D5942-5MG)；γ-氨基丁酸a型((γ-aminobutyricacid type A，GABAa)、γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(γ-aminobutyric acid transporter-1，GAT-1)、Notch1、Jagged1、β-actin抗體(美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab229678、ab177483、ab167441、ab85763、ab50599)。

1.3 儀器SLY-B型四道生理記錄儀(上海康為醫(yī)療科技發(fā)展有限公司)；DYCZ-40D型轉(zhuǎn)印電泳儀(武漢純度生物科技有限公司)；Q1600型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(杭州柏恒科技有限公司)；GenoSens 1860型凝膠成像分析系統(tǒng)(上海臻諾生物科技有限公司)；HFJ-8(10)型內(nèi)切式勻漿機(jī)(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；一次性無(wú)菌針灸針(規(guī)格：0.25 mm×25.00 mm、0.25 mm×13.00 mm，河南澤垣醫(yī)療器械銷售有限公司)。

2 方法

2.1 分組、建模與干預(yù)80只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，取12只為對(duì)照組，12只為假手術(shù)組，其余56只大鼠采用Zea Longa線栓法與內(nèi)囊注射NMDAR法建立腦卒中后肢體痙攣模型[9]，具體如下，建立腦卒中模型(Zea Longa線栓法)：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，麻醉成功后，將大鼠仰臥位綁縛于手術(shù)臺(tái)，備皮、消毒、鋪巾，于頸項(xiàng)部正中偏右做切口，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、迷走神經(jīng)，暴露頸總動(dòng)脈分叉處、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端、頸外動(dòng)脈近心端使用6-0線結(jié)扎，動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，阻斷血流；頸總動(dòng)脈分叉(膨大5 mm)處剪“V”型切口，栓線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，打開(kāi)動(dòng)脈夾，當(dāng)進(jìn)線約18～20 mm稍感阻力處停止插線，頸內(nèi)動(dòng)脈近心端及栓線一同結(jié)扎，縫合切口；術(shù)后常規(guī)抗感染、防腦水腫，單籠喂養(yǎng)，保證大鼠呼吸通暢。Zea Longa評(píng)分1～3分說(shuō)明模型成功。建立肢體痙攣模型(內(nèi)囊注射NMDAR法)：腦卒中模型建立后的第2天，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后將內(nèi)含5 μL NMDAR的微量注射器縛于腦立體定位儀上，消毒鋪巾后沿大鼠顱頂矢狀縫做切口(1.5～2 cm)，逐層分離皮膚組織等，暴露前囟，拉開(kāi)局部組織以暴露右側(cè)額骨、頂骨交界骨縫，定位內(nèi)囊位置(矢狀縫偏右側(cè)2.4 mm、前囟偏后1.4 mm)，記號(hào)筆標(biāo)記，鉆孔，以破開(kāi)顱骨為深度標(biāo)準(zhǔn)，微量注射器垂直插入(7 mm)，緩慢注射5 μL NMDAR(注射時(shí)間5 min)，拔出微量注射器，明膠海綿壓迫止血，消毒，縫合切口，改良版Ashworth量表評(píng)定1～4級(jí)表明模型成功。假手術(shù)大鼠僅分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，不結(jié)扎、不插線，內(nèi)囊注射5 μL生理鹽水，其余同上。對(duì)照組大鼠不做任何處理。在造模過(guò)程中，5只大鼠因神經(jīng)功能嚴(yán)重受損剔除，3只大鼠因血管破裂出血剔除，2只大鼠因呼吸道炎癥反應(yīng)死亡剔除，將剩余46只造模成功大鼠分為模型組(n=11)、DAPT組(n=11)、針刺組(n=12)、針刺+DAPT組(n=12)。針刺組大鼠于術(shù)后第1天開(kāi)始針刺治療，參照動(dòng)物穴位結(jié)合人體同身寸取穴進(jìn)行定位，左側(cè)天井穴直刺5 mm，左側(cè)正營(yíng)穴平刺 5 mm，左側(cè)環(huán)跳穴直刺10 mm，留針15 min，留針期間，間隔5 min施展1次平補(bǔ)平瀉手法，每次 10 s，每日針刺1次，共持續(xù)2周；DAPT組大鼠以 0.1 mg·kg-1劑量進(jìn)行腹腔注射，每日1次，持續(xù)2周；針刺+DAPT組干預(yù)手段同上述針刺組、DAPT組；假手術(shù)組、模型組大鼠在相同時(shí)間仰臥位固定于鼠板上，不進(jìn)行針刺治療，腹腔注射生理鹽水，時(shí)間同上；對(duì)照組大鼠不捆綁、不治療。

2.2 神經(jīng)功能評(píng)估干預(yù)2周結(jié)束后，采用Zea Longa評(píng)分評(píng)估各組大鼠神經(jīng)功能，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下，0分：活動(dòng)正常，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展患側(cè)前爪，輕微神經(jīng)功能受損；2分：向外側(cè)轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)受損；3分：向患側(cè)傾倒，重度神經(jīng)受損；4分：無(wú)法自發(fā)行走，意識(shí)明顯下降或喪失；5分：死亡。

2.3 肢體功能檢查評(píng)估神經(jīng)功能后采用Feeney平衡木評(píng)分[10]評(píng)價(jià)大鼠肢體功能，在距離地面高 10 cm 處放置長(zhǎng)80 cm、寬2.5 cm的平衡木，觀察大鼠在平衡木上的狀態(tài)，評(píng)分如下，0分：能跳上平衡木，能行走，不跌倒；1分：能跳上平衡木，能行走，跌倒幾率<50%；2分：能跳上平衡木，可行走，跌倒幾率≥50%；3分：在健側(cè)后肢支持下可跳上平衡木，患側(cè)后肢無(wú)法讓大鼠移動(dòng)；4分：可坐于平衡木上，但不能行走；5分：放在平衡木上會(huì)掉下來(lái)。

2.4 肌張力評(píng)估神經(jīng)、行為評(píng)估結(jié)束后，使用電生理描記結(jié)果評(píng)估肌張力。各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉淺度全麻后，使用四道生理記錄儀測(cè)定大鼠肌張力，測(cè)定方法：一端點(diǎn)擊插入左后肢股四頭肌，另一端插入尾部，于左后肢下端系低順應(yīng)性棉線，將棉線通過(guò)張力傳感器與生理記錄儀相連，定時(shí)刺激股四頭肌，刺激時(shí)間10 s，刺激量3 mA，據(jù)此產(chǎn)生的電信號(hào)反映肌張力變化，肌張力越低，刺激痙攣肢體被動(dòng)運(yùn)動(dòng)幅度越大，描記電信號(hào)越高。

2.5 RT-PCR檢測(cè)Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1mRNA的表達(dá)水平上述檢測(cè)完成后處死大鼠，快速取出大鼠腦組織，置于凍存管，凍存管液氮降溫1 d，-80 ℃環(huán)境凍存，待測(cè)。RT-PCR操作步驟如下：①提取總RNA，加入裂解液，內(nèi)切式勻漿機(jī)勻漿，溫育，添加氯仿、異丙醇、乙醇(體積分?jǐn)?shù)75%)后離心，40 μL DEPC水溶解提取RNA；②cDAN合成，剔除總RNA中的DNA、DNase 1，反轉(zhuǎn)錄cDNA；③擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性 60 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃充分延伸、采集熒光30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；④以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法評(píng)估PCR產(chǎn)物的表達(dá)水平。引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.6 Western Blot測(cè)定Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1的蛋白表達(dá)水平研磨大鼠腦組織，加入裂解液，勻漿至裂解充分，4 ℃ 15 000 r·min-1離心15 min，取酶標(biāo)板，依次添加試劑，各孔加入BCA工作液，振蕩30 s，562 nm下測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，完成蛋白定量；制備SDS-PAGE膠，取樣品蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳分離后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間2 h，電流380 mA，TBST配置5 %脫脂牛奶，封閉1 h，加一抗(稀釋比例12 000)4 ℃孵育過(guò)夜，第二日復(fù)溫，TBST液漂洗3次，每次 10 min，加二抗(稀釋比例15 000)常溫孵育1 h，漂洗3次，β-actin為內(nèi)參，顯影定影，采用凝膠圖像處理分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行處理統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能比較對(duì)照組、假手術(shù)組大鼠Zea Longa評(píng)分為0，神經(jīng)功能正常。與對(duì)照組、假手術(shù)組比較，模型組及DAPT組大鼠Zea Longa評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組、DAPT組比較，針刺組、針刺+DAPT組大鼠Zea Longa評(píng)分顯著降低(P<0.05)；與針刺組比較，針刺+DAPT組大鼠Zea Longa評(píng)分顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 分)

3.2 各組大鼠肢體功能與肌張力比較對(duì)照組、假手術(shù)組大鼠肢體功能與肌張力正常。與對(duì)照組、假手術(shù)組比較，模型組及DAPT組大鼠Feeney平衡木評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組、DAPT組比較，針刺組、針刺+DAPT組大鼠Feeney平衡木評(píng)分顯著降低(P<0.05)，電生理描記結(jié)果顯著升高(P<0.05)；與針刺組比較，針刺+DAPT組大鼠Feeney平衡木評(píng)分顯著升高(P<0.05)，電生理描記結(jié)果顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠肢體功能與肌張力水平比較

3.3 各組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1mRNA表達(dá)水平比較與對(duì)照組、假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAamRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，GAT-1mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，針刺組、針刺+DAPT組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAamRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，GAT-1mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與針刺組比較，針刺+DAPT組大鼠腦Notch1、Jagged1、GABAamRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)，GAT-1mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1 mRNA表達(dá)水平比較

3.4 各組大鼠腦組織中Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1蛋白表達(dá)水平比較與對(duì)照組、假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAa蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，GAT-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，針刺組、針刺+DAPT組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAa蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，GAT-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與針刺組比較，針刺+DAPT組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAa蛋白表達(dá)水平顯著降低，GAT-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表5、圖1。

表5 各組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1蛋白表達(dá)水平比較

注：A：對(duì)照組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：DAPT組；E：針刺組；F：針刺+DAPT組圖1 各組大鼠腦組織Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1蛋白條帶圖

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中后肢體痙攣本質(zhì)是腦卒中發(fā)病后高級(jí)中樞受損，引起下位中樞運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元抑制或減弱，干擾大腦下位中樞調(diào)控，脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元因神經(jīng)遞質(zhì)易化作用興奮性增高，出現(xiàn)肢體痙攣，以肢體活動(dòng)受限、攣縮變形等為主要表現(xiàn)，嚴(yán)重降低生活質(zhì)量[11-12]。改善腦卒中患者神經(jīng)功能、糾正異常肢體功能障礙，是腦卒中后恢復(fù)的首要目標(biāo)[13-15]。

國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者證實(shí)[16-18]，針刺療法在腦卒中及腦卒中后功能障礙性疾病中均取得確切效果。中醫(yī)認(rèn)為，機(jī)體內(nèi)部陽(yáng)氣于表里之間，如樞機(jī)一般，可入可出，升降出入自如，則樞機(jī)氣血運(yùn)行通順，陰陽(yáng)協(xié)調(diào)，開(kāi)闔有度[19-20]；而三焦統(tǒng)領(lǐng)五臟六腑、經(jīng)絡(luò)、榮衛(wèi)之氣，三焦通則樞機(jī)通、氣血經(jīng)絡(luò)通，手少陽(yáng)三焦經(jīng)疏風(fēng)行氣、開(kāi)竅解郁，足少陽(yáng)膽經(jīng)疏肝利膽通竅，故手足少陽(yáng)經(jīng)脈對(duì)樞機(jī)運(yùn)行順暢、全身經(jīng)絡(luò)協(xié)調(diào)有關(guān)鍵作用[21-22]。本研究成功構(gòu)建腦卒中后肢體痙攣大鼠模型發(fā)現(xiàn)，模型組、DAPT組大鼠Zea Longa評(píng)分升高，表明腦卒中大鼠神經(jīng)功能嚴(yán)重受損，選取手少陽(yáng)三焦經(jīng)“天井”穴與足少陽(yáng)膽經(jīng)“正營(yíng)”“環(huán)跳”穴位合用，予以通利樞機(jī)針刺法干預(yù)后，大鼠Zea Longa評(píng)分顯著降低，提示通利樞機(jī)針刺法能促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，取少陽(yáng)經(jīng)穴可調(diào)節(jié)陰陽(yáng)消長(zhǎng)，宣利上焦，通利下焦，使樞機(jī)正常運(yùn)轉(zhuǎn)，腦神得正，有效疏導(dǎo)神經(jīng)，促進(jìn)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放，進(jìn)而改善大鼠神經(jīng)功能。腦卒中后肢體痙攣大鼠肌張力明顯升高，運(yùn)動(dòng)功能受損，本研究顯示，模型組、DAPT組大鼠Feeney平衡木評(píng)分提高，電生理描記結(jié)果降低，提示腦卒中后肢體痙攣大鼠肢體功能異常，而予以通利樞機(jī)針刺法干預(yù)后，針刺組大鼠Feeney平衡木評(píng)分明顯降低，電生理描記結(jié)果明顯升高，說(shuō)明通利樞機(jī)針刺法在提高大鼠肢體功能方面效果顯著，針刺“天井”“正營(yíng)”“環(huán)跳”穴，切入腦脈痹阻病機(jī)，可引病邪由重轉(zhuǎn)輕，氣機(jī)開(kāi)闔有度，氣血陰陽(yáng)交通無(wú)礙，樞機(jī)通暢，四肢筋骨得以舒展，臟腑功能得以恢復(fù)，共奏樞機(jī)通利之功，從而降低大鼠肌張力，提高運(yùn)動(dòng)功能，促使大鼠肢體功能得到有效恢復(fù)。

國(guó)外學(xué)者廣泛研究Notch信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用，認(rèn)為Notch通路在神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，與諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，了解潛在機(jī)制或可為疾病治療提供新見(jiàn)解[23-24]。Notch通路由Notch受體(Notch1-4)、Notch配體(Jagged1-2、Delta-like1、3、4)、DNA結(jié)合蛋白、Notch調(diào)節(jié)分子等組成，作為一個(gè)多維基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，其調(diào)節(jié)功能多樣，現(xiàn)有研究表明，其在神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)干細(xì)胞分化等方面具有重要的調(diào)控作用[25-27]。謝莉娜[28]研究發(fā)現(xiàn)，電針可促進(jìn)腦卒中肢體痙攣大鼠海馬區(qū)突觸可塑性相關(guān)蛋白、GABAa受體等表達(dá)，以緩解肢體痙攣狀態(tài)。雖已知曉腦卒中后肢體痙攣與神經(jīng)再生密切相關(guān)，但具體作用機(jī)制尚缺乏研究支持，本研究為明確Notch通路與腦卒中后肢體痙攣狀態(tài)的關(guān)系，分組干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，模型組、DAPT組大鼠腦組織中Notch1、Jagged1、GABAamRNA與蛋白表達(dá)水平降低，GAT-1mRNA與蛋白表達(dá)水平升高，提示Notch通路參與腦卒中后肢體痙攣發(fā)展過(guò)程；使用通利樞機(jī)針刺法治療后，Notch1、Jagged1、GABAamRNA與蛋白表達(dá)水平升高，GAT-1mRNA與蛋白表達(dá)水平降低，提示通利樞機(jī)針刺法可能參與促進(jìn)Notch通路表達(dá)的作用，以通暢氣血經(jīng)絡(luò)；在應(yīng)用通利樞機(jī)針刺法治療同時(shí)，還使用Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，針刺組大鼠腦Notch1、Jagged1、GABAa蛋白表達(dá)水平高于針刺+DAPT組，GAT-1蛋白表達(dá)低于針刺+DAPT組，證實(shí)通利樞機(jī)針刺法可發(fā)揮調(diào)節(jié)樞機(jī)、通暢氣血的作用，以促進(jìn)Notch通路、GABAa受體蛋白表達(dá)，降低GAT-1蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)元突觸傳遞，利于神經(jīng)元再生，改善大鼠神經(jīng)與肢體功能。

綜上，通利樞機(jī)針刺法可改善腦卒中后肢體痙攣大鼠的神經(jīng)功能、肢體功能，作用機(jī)制可能與調(diào)控Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)，為臨床腦卒中后肢體痙攣治療提供實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。