范紅娟，康凱寧，栗志英

1.邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056000； 2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 邯鄲 056000

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是老年人群中較為常見(jiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是老年癡呆的主要分型，其致死率僅次于心血管疾病、腫瘤、腦卒中，嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量和生命健康。AD主要表現(xiàn)為認(rèn)知障礙、記憶力減退、人格及行為改變等[1]。海馬組織是與認(rèn)知、記憶等密切相關(guān)的腦功能區(qū)，研究發(fā)現(xiàn)，減輕海馬神經(jīng)元損傷能夠有效改善AD癥狀并延緩其進(jìn)展[2-3]。近年來(lái)病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，β淀粉樣蛋白(beta amyloid，Aβ)病理性沉積是AD最主要的病理改變，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在其病變過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4-5]。因此，探索以抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)為治療靶點(diǎn)的新型藥物對(duì)改善AD具有重要意義。

AD在中醫(yī)中又稱(chēng)為“老年呆病”，屬于“健忘”“呆癥”“文癡”等范疇，其病機(jī)在于脾胃虛弱、氣血虧虛、痰濁血淤、阻塞清竅，為本虛標(biāo)實(shí)之證[6-7]。芹菜具有養(yǎng)血補(bǔ)虛、清熱解毒等功效，芹菜素是天然存在于旱芹等植物中的一種黃酮類(lèi)化合物，具有良好的抗氧化、抗炎活性[8-9]。核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶1(nuclear factor E2 related factor 2/heme oxygenase 1，Nrf2/HO-1)是氧化應(yīng)激反應(yīng)重要的信號(hào)通路[10]；核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)對(duì)炎癥反應(yīng)具有重要調(diào)控作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素可調(diào)控Nrf2/HO-1通路抑制氧化應(yīng)激進(jìn)而有效減輕妊娠期糖尿病大鼠肝損傷，調(diào)控NF-κB核轉(zhuǎn)位抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)而有效抑制糖尿病腎損傷[12-13]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討芹菜素對(duì)β-淀粉樣蛋白1～42片段(β-amyloid 1～42 fragments，Aβ1-42)致AD大鼠海馬組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠100只，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公共服務(wù)平臺(tái)，許可證號(hào)：SYXK(冀)2020-001，動(dòng)物合格證號(hào)：20200925006。大鼠分籠飼養(yǎng)于室溫23～25 ℃、相對(duì)濕度55%～65%的環(huán)境中，自由飲水進(jìn)食，所有大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均按照3R原則給予人道主義關(guān)懷。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，審批號(hào)：HDZXLL(K)2020-024。

1.2 藥物與試劑芹菜素(陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司，純度≥98%，批號(hào)：191125)；吡拉西坦片(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1200413)。Aβ1-42凍干粉(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：119M8714V)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：200127、200319、200114、200407、191230、200319)；胞漿胞核蛋白制備試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)：0918A20)；Nrf2抗體、HO-1抗體、NF-κB p65抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bs-1074R、bs-23397R、bs-3485R)；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(美國(guó)Abclonal公司，批號(hào)：AC026)；IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：180511)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0018AS)。

1.3 儀器MD-3000型動(dòng)物腦立體定位注射儀(美國(guó)BAS公司)；ZH-Morris型水迷宮及視頻分析系統(tǒng)(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；RM2016型石蠟切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；BMJ-A型包埋機(jī)(常州中威電子儀器有限公司)；5424R型離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；MK3 型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；DYCZ-24DN型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；JY200C型轉(zhuǎn)膜儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；GelDoc XR型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模與給藥適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法，將100只大鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常組、模型組、芹菜素低劑量組、芹菜素高劑量組和吡拉西坦組，每組20只。除正常組外，其他組大鼠均參照文獻(xiàn)[14]報(bào)道的方法復(fù)制AD大鼠模型，具體如下：以3 mL·kg-1體積腹腔注射10%水合氯醛溶液實(shí)施麻醉后，將大鼠固定于腦立體定位注射儀，于前囟后3.0 mm、正中矢狀縫左旁和右旁3.0 mm、顱骨表面下3.5 mm處分別緩慢注射 2.5 μL 的Aβ1-42溶液(濃度4 g·L-1)，注射時(shí)間 10 min；正常組大鼠緩慢注射2.5 μL 9 g·L-1氯化鈉溶液，注射時(shí)間10 min。造模完成后，芹菜素低劑量組、芹菜素高劑量組大鼠分別以20 mg·kg-1、40 mg·kg-1劑量腹腔注射芹菜素溶液[15]，吡拉西坦組大鼠以700 mg·kg-1劑量腹腔注射吡拉西坦溶液(根據(jù)人臨床劑量換算)，正常組和模型組大鼠腹腔注射給予9 ng·L-1氯化鈉溶液，注射體積均為5 mL·kg-1，每天1次，療程28 d。

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力將Morris水迷宮分為4個(gè)象限，平臺(tái)固定于第4象限的中心位置，水溫25 ℃。末次給藥24 h后，各組隨機(jī)取10只大鼠，適應(yīng)性訓(xùn)練3 d，每天訓(xùn)練4次，分別從4個(gè)象限頭朝器壁方向?qū)⒋笫蠓湃胨胁⒁龑?dǎo)大鼠尋找第4象限的平臺(tái)。定位航行實(shí)驗(yàn)：第4天將大鼠分別從4個(gè)象限頭朝器壁方向放入水中，記錄找到位于第4象限平臺(tái)的時(shí)間(120 s內(nèi)未找到則按120 s計(jì)算)，即為逃避潛伏期；空間探索實(shí)驗(yàn)：第5天撤掉位于第4象限的平臺(tái)，將大鼠從第2象限頭朝器壁方向放入水中，記錄120 s內(nèi)穿越第4象限原平臺(tái)位置的次數(shù)。

2.3 HE染色觀察海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元病理改變及病理分級(jí)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)完成后，麻醉、頸椎脫臼處死大鼠，取腦組織并去除小腦、腦干、嗅球后置于10%中性甲醛溶液中固定3 d，石蠟浸潤(rùn)包埋，5 μm厚連續(xù)切片，部分切片經(jīng)梯度乙醇脫蠟水化后行常規(guī)HE染色，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察海馬組織CA1區(qū)病理特點(diǎn)。參照文獻(xiàn)[16]報(bào)道的方法對(duì)海馬組織CA1區(qū)病理改變進(jìn)行分級(jí)：神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常為“-”；少量神經(jīng)元形態(tài)改變?yōu)椤?”；部分神經(jīng)元胞核固縮或溶解、神經(jīng)元排列疏松為“++”；大部分神經(jīng)元胞核固縮或溶解、神經(jīng)元層次紊亂為“+++”。

2.4 海馬組織SOD、GSH-Px活性，MDA含量及TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測(cè)分別取各組剩余的10只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，冰上取腦組織并剝?nèi)『ｑR體，取左側(cè)海馬組織，剪碎后加入6倍量4 ℃裂解液研磨勻漿，4 ℃、2 000 r·min-1離心 5 min，離心半徑10 cm，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)SOD、GSH-Px活性，MDA含量和TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

2.5 Western Blot檢測(cè)海馬組織Nrf2、HO-1、胞漿NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)水平取右側(cè)海馬組織100 mg，按照胞漿胞核蛋白提取試劑盒操作說(shuō)明制備胞漿胞核蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白含量后經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，50 g·L-1脫脂奶粉封閉處理后，滴加Nrf2抗體(稀釋比例1500)、HO-1抗體(稀釋比例1500)、NF-κB p65(稀釋比例1800)、β-actin抗體(稀釋比例11 000)，4 ℃ 孵育過(guò)夜，滴加IgG二抗(稀釋比例 12 000)室溫孵育2 h，滴加ECL顯影后通過(guò)Image J 軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶與β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 芹菜素對(duì)AD大鼠認(rèn)知功能的影響與正常組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05)；與模型組比較，芹菜素高劑量組和吡拉西坦組大鼠逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增多(P<0.05)；與吡拉西坦組比較，芹菜素高劑量組大鼠逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增多(P<0.05)。見(jiàn)表1。

3.2 芹菜素對(duì)AD大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元病理改變及病理分級(jí)的影響正常組大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)呈圓形或橢圓形，排列整齊，層次清晰。模型組大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，胞體固縮深染。與模型組比較，各給藥組大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)改變呈不同程度減輕，芹菜素高劑量組改善效果最為顯著。與正常組比較，模型組病理分級(jí)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，芹菜素高劑量組和吡拉西坦組病理分級(jí)顯著降低(P<0.05)；與吡拉西坦組比較，芹菜素高劑量組病理分級(jí)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表2。

表1 芹菜素對(duì)AD大鼠認(rèn)知功能的影響

注：A：正常組；B：模型組；C：芹菜素低劑量組；D：芹菜素高劑量組：E：吡拉西坦組圖1 芹菜素對(duì)AD大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元病理改變的影響(HE，×400)

表2 芹菜素對(duì)AD大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元病理分級(jí)的影響

3.3 芹菜素對(duì)AD大鼠海馬組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響與正常組比較，模型組海馬組織SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，芹菜素高劑量組和吡拉西坦組SOD、GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)；與吡拉西坦組比較，芹菜素高劑量組SOD、GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

3.4 芹菜素對(duì)AD大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響與正常組比較，模型組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，芹菜素高劑量組和吡拉西坦組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05)；與吡拉西坦組比較，芹菜素高劑量組 TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 芹菜素對(duì)AD大鼠海馬組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

表4 芹菜素對(duì)AD大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響

3.5 芹菜素對(duì)AD大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平的影響與正常組比較，模型組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，芹菜素高劑量組和吡拉西坦組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與吡拉西坦組比較，芹菜素高劑量組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表5。

注：A：正常組；B：模型組；C：芹菜素低劑量組；D：芹菜素高劑量組；E：吡拉西坦組圖2 大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白條帶圖

3.6 芹菜素對(duì)AD大鼠海馬組織胞漿NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的影響與正常組比較，模型組海馬組織胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)量及胞核NF-κB p65、胞漿NF-κB p65蛋白表達(dá)量比值均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，芹菜素高劑量組和吡拉西坦組胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)量及胞核NF-κB p65、胞漿NF-κB p65蛋白表達(dá)量比值均顯著降低(P<0.05)；與吡拉西坦組比較，芹菜素高劑量組胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)量及胞核NF-κB p65、胞漿NF-κB p65蛋白表達(dá)量比值均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表6。

注：A：正常組；B：模型組；C：芹菜素低劑量組；D：芹菜素高劑量組；E：吡拉西坦組圖3 大鼠海馬組織胞漿NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白條帶圖

表5 芹菜素對(duì)AD大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平的影響

表6 芹菜素對(duì)AD大鼠海馬組織胞漿、胞核中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平及比值的影響

4 討論

AD患病人群主要為65歲以上老年人，隨著我國(guó)人口老齡化的加劇，AD發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，已成為我國(guó)亟待解決的社會(huì)問(wèn)題和醫(yī)學(xué)難題[17]。中醫(yī)藥具有防治結(jié)合、標(biāo)本兼治的優(yōu)勢(shì)，在慢性病防治方面得到廣泛關(guān)注與認(rèn)可。芹菜為一年或二年生傘形科植物，其根、莖、葉、籽均可入藥，具有養(yǎng)血補(bǔ)虛、清熱解毒、防癌抗癌之功效，具有較高的藥用價(jià)值。芹菜素為芹菜的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎等多種藥理學(xué)作用，涂豐霞等[15]研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素對(duì)腦缺血所致認(rèn)知功能障礙具有明顯改善作用。吡拉西坦是一種神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑，對(duì)AD所致認(rèn)知障礙、思維功能減退等具有明顯改善作用，常用做AD新型藥物實(shí)驗(yàn)研究的陽(yáng)性對(duì)照藥物[18]。雙側(cè)海馬定向注射Aβ1-42制備AD大鼠模型具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)率高、與人類(lèi)AD病理特點(diǎn)近似等優(yōu)勢(shì)，是國(guó)內(nèi)外普遍認(rèn)可的造模方法。本研究發(fā)現(xiàn)，AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，大腦海馬組織CA1區(qū)呈現(xiàn)神經(jīng)元數(shù)量減少、形態(tài)不規(guī)則、排列紊亂、胞體固縮深染等病變，與李喜香等[19]研究報(bào)道一致，經(jīng)芹菜素治療則能夠明顯提高AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，改善海馬組織CA1區(qū)病變、降低病理分級(jí)，并且芹菜素高劑量組效果優(yōu)于吡拉西坦組，提示芹菜素能夠減輕AD大鼠海馬組織損傷，改善AD癥狀。

Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Aβ病理性沉積可導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量生成，SOD、GSH-Px等抗氧化酶過(guò)度消耗，不能及時(shí)清除的ROS將攻擊生物膜和生物大分子引發(fā)氧化應(yīng)激損傷并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，Aβ病理性沉積將誘發(fā)炎癥因子大量釋放而引起炎癥反應(yīng)，其中具有趨化因子屬性的TNF-α、IL-1β、IL-6能夠刺激粒細(xì)胞等進(jìn)一步釋放炎癥因子而加重炎癥反應(yīng)[21]。Nrf2普遍存在于真核細(xì)胞中，能夠誘導(dǎo)SOD、GSH-Px等抗氧化酶表達(dá)而抑制氧化應(yīng)激，并且Nrf2能夠調(diào)控其下游基因HO-1的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，而HO-1則能夠催化血紅素分解成亞鐵、一氧化碳、膽綠素，而膽綠素對(duì)ROS具有較強(qiáng)的還原活性，從而降低氧化應(yīng)激損傷[22]。王珊等[23]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)藥物激活Nrf2/HO-1通路能夠減輕Aβ致AD大鼠海馬組織氧化應(yīng)激損傷。NF-κB是一種以p50/p65二聚體形式存在的核轉(zhuǎn)錄因子，生理狀態(tài)下與特異性酶抑制劑結(jié)合而無(wú)生理活性；病理狀態(tài)下，ROS等將誘導(dǎo) NF-κB 與酶抑制劑解離而使其活化，核轉(zhuǎn)位后p65亞基與DNA特異性位點(diǎn)結(jié)合誘導(dǎo)炎性因子表達(dá)與釋放，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)[24]。HO-1則能夠抑制NF-κB活化與核轉(zhuǎn)位，從而間接抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)[25]。王海英等[26]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)藥物抑制 NF-κB活化和核轉(zhuǎn)位能夠減輕AD所致炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)芹菜素治療能夠明顯提高AD大鼠海馬組織SOD、GSH-Px活性并降低MDA含量，降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平，提高Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量，降低胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)量及胞核NF-κB p65、胞漿NF-κB p65蛋白表達(dá)量的比值，芹菜素高劑量組作用優(yōu)于吡拉西坦組，提示芹菜素具有抑制AD大鼠海馬組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用，其機(jī)制可能與激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位有關(guān)。

綜上所述，芹菜素能夠抑制Aβ1-42致AD大鼠海馬組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，改善AD癥狀，該作用可能與激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位有關(guān)。本研究結(jié)果為芹菜素治療AD提供參考，為AD藥物開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。