張曉寧，張高煉，高玉廣，梁煒斌，郭建輝，曾敬，陳銳，陳云鵬

廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023

創(chuàng)傷性腦外傷(traumatic brain injury，TBI)是神經(jīng)外科常見的急危重癥[1]，是導致死亡和永久性殘疾的主要原因之一。目前，創(chuàng)傷性腦外傷的治療主要以手術為主，經(jīng)過治療后，患者的生命得以救治，但是大多數(shù)患者都會留下后遺癥，如偏癱、繼發(fā)性癲癇、頭痛等，甚至生活不能自理，因此，研究其發(fā)病機制和治療靶點對新藥開發(fā)、針對性治療、提高患者生存率至關重要。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是一種新型促炎性細胞因子，為真核細胞核內的一種高度保守的非組蛋白，具有調節(jié)基因轉錄、穩(wěn)固胞核結構、介導炎癥反應等生物學功能，為炎癥反應的關鍵調控分子。研究表明，HMGB1通過介導炎癥反應調控炎性因子白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)[2-3]，影響創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程?；诖?，本文擬通過動物實驗觀察通竅活血湯對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠HMGB1、IL-6的影響，以期為創(chuàng)傷性腦損傷的治療靶點和新藥開發(fā)提供思路。

1 材料

1.1 動物90只18周齡健康雄性無特定病原體(specific pathogen free，SPF)的SD大鼠自長沙市天勤生物技術有限公司購買，許可證號：SCXK(湘)2019-001。動物飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對濕度50%～65%，12 h光照、12 h黑暗晝夜變化周期。動物實驗經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學倫理委員會批準，倫理批號：DW20201011-7。實驗過程符合國家和單位有關實驗動物的管理和使用規(guī)定。

1.2 藥物及試劑依達拉奉注射液(規(guī)格：20 mL：30 mg，國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司，國藥準字：H20080056)。TUNEL試劑盒(瑞士ROCHE公司，貨號：116848202010)；HMGB1 ELISA試劑盒(Arigo Biolaboratories公司，貨號：ARG81351)；IL-6 ELISA試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司，貨號：SP12279)。

1.3 儀器腦立體定位儀(成都儀器廠，型號：ST-4ND)；電子分析天平(奧豪斯儀器常州有限公司，型號：AR224CN)；高速低溫組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司，型號：KZ-III-F)。

2 方法

2.1 藥物制備通竅活血湯組方中藥(丹參 30 g，紅花、川芎、生姜、菊花、牛膝、天麻各10 g，生地黃、赤芍、桃仁、柴胡、枳殼、郁金各15 g，甘草6 g，蔥白、大棗各5 g，石菖蒲20 g)由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房代煎，每劑煎得藥液150 mL。藥物根據(jù)《現(xiàn)代醫(yī)學實驗動物學》進行換算，通竅活血湯低、中、高劑量組大鼠灌胃濃度分別相當于成人等效劑量的1倍、2倍、4倍，根據(jù)大鼠灌胃體積 10 mL·kg-1將通竅活血湯配成濃度為2.25 g·mL-1、4.5 g·mL-1、9 g·mL-1(生藥量)的溶液。

2.2 創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型制備采用改良的Feeney′s重物自由落體撞擊法建立創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型[4]，具體如下：大鼠于術前禁食禁水8 h后，以2 mL·kg-1的體積腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液進行麻醉后，對大鼠頭部進行剃毛，并固定于立體定位儀上，用碘伏消毒大鼠頭部，沿頭頂中線縱行切開皮膚全層(長度為2.0～3.0 cm)。將顱骨表面皮下組織與骨膜推向兩側后，在大鼠人字縫與冠狀縫連線的中線及矢狀縫右側磨開骨質缺損區(qū)(直徑 5 mm)，操作中注意保持硬腦膜的完整性，調整50 g打擊砝碼的下落位置，使其與大鼠頭部骨質缺損區(qū)重合，并升高至20 cm處后，打擊砝碼沿外周導管自由墜落，打擊撞桿從而撞擊大腦硬膜，使大鼠右側頂葉重度挫裂傷。最后將大鼠轉移至恒溫板上，使用明膠海綿及骨蠟封閉顱骨缺損及手術區(qū)，用線縫合頭皮并使用碘伏消毒。

2.3 動物分組及給藥采用SPSS 23.0產(chǎn)生的隨機序列對實驗動物進行分組，首先將大鼠隨機分為空白組(n=15)和造模組(n=75)，空白組大鼠不予任何處理，而造模組大鼠按2.2項所述方法制備創(chuàng)傷性腦損傷模型。造模完成后，采用SPSS 23.0產(chǎn)生的隨機序列將造模組大鼠分為模型組、通竅活血湯高劑量組、通竅活血湯中劑量組、通竅活血湯低劑量組及依達拉奉組，每組15只。分組完成以后進行藥物干預，通竅活血湯低劑量組、通竅活血湯中劑量組、通竅活血湯高劑量組大鼠的灌胃濃度分別為2.25 g·mL-1、4.5 g·mL-1、9.0 g·mL-1(生藥量)，依達拉奉組灌胃給予依達拉奉注射液，空白組和模型組灌胃給予生理鹽水，每日2次，灌胃體積為 10 mL·kg-1，連續(xù)干預7 d。

2.4 大鼠神經(jīng)功能評分本研究使用 改良的Garcia JH(mGarcia JH)評分來反映創(chuàng)傷性腦損傷后大鼠的行為變化及神經(jīng)功能損傷程度。mGarcia JH評分從大鼠自主運動、體態(tài)對稱性、前肢伸展功能、攀爬運動、身體雙側觸覺、雙側胡須碰觸反應6個方面進行評估，分值為3～18分，數(shù)值越大，神經(jīng)功能損傷越輕，18分為正常。選取3次重復檢測而得的平均分，每次檢測應間隔至少5 min。

2.5 ELISA法檢測腦組織HMGB1、IL-6的水平取部分腦組織勻漿后根據(jù)ELISA試劑盒說明書進行操作，于波長490 nm處分別測定各孔的吸光度值，采用GraphPad Prism4.0軟件計算HMGB1、IL-6的水平。

2.6 TUNEL染色檢測大腦皮質神經(jīng)細胞凋亡情況根據(jù)TUNEL染色試劑盒說明書的程序完成操作步驟，切片準備完畢后，隨機選取大鼠受傷腦組織部位，顯微鏡觀察細胞凋亡情況，同時計算細胞凋亡率。

2.7 HE染色觀察腦組織病理變化從儲存冰箱中取出大鼠的腦組織標本，在分析天平上分別稱取100 mg，采用甲醛進行固定，然后修剪、脫水、透明，采用石蠟對組織進行包埋，制成5μm厚度的切片，然后展片、脫蠟至水、染色，在熒光顯微鏡下對比觀察大鼠大腦組織病變情況。

2.8 濕干比法測定腦水腫含量麻醉并處死大鼠后，打開顱骨，取各只大鼠相同部位的部分腦組織，用濾紙吸干表面水分后，立即稱其質量即為腦組織濕質量。將稱量過的腦組織標本放置在70 ℃烘干箱中高溫72 h直至恒質量，稱其質量得到干質量，計算濕干比評估大鼠腦組織含水量。

3 結果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較與空白組比較，模型組大鼠的 mGarcia JH評分顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠的mGarcia JH評分顯著升高(P<0.05)；與通竅活血湯低劑量組比較，通竅活血湯高、中劑量組及依達拉奉組大鼠的mGarcia JH評分顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較

3.2 各組大鼠腦組織HMGB1、IL-6水平比較與空白組比較，模型組大鼠腦組織HMGB1、IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織HMGB1、IL-6水平顯著降低(P<0.05)；與通竅活血湯低劑量組比較，通竅活血湯高、中劑量組及依達拉奉組大鼠腦組織HMGB1、IL-6 水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腦組織HMGB1、IL-6水平比較

3.3 各組大鼠大腦皮質神經(jīng)細胞凋亡水平比較與空白組比較，模型組大鼠神經(jīng)凋亡細胞數(shù)量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠神經(jīng)凋亡細胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)；與通竅活血湯低劑量組比較，通竅活血湯高、中劑量組及依達拉奉組大鼠神經(jīng)凋亡細胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 各組大鼠大腦皮質神經(jīng)細胞凋亡水平比較

注：A：空白組；B：模型組；C：通竅活血湯高劑量組；D：通竅活血湯中劑量組；E：通竅活血湯低劑量組；F：依達拉奉組圖1 各組大鼠大腦皮質神經(jīng)細胞凋亡水平比較(TUNEL染色，×100)

3.4 各組大鼠腦組織病理變化比較HE染色顯示：空白組可見清晰的細胞膜和細胞核，未見明顯細胞壞死及增生等情況發(fā)生；模型組腦組織的血腫周圍呈充血腫脹，出血，細胞壞死，有膠質細胞增生；通竅活血湯中劑量和依達拉奉組腦組織血腫、出血的范圍及膠質細胞增生數(shù)量等明顯減少。見圖2。

注：A：空白組；B：模型組；C：通竅活血湯高劑量組；D：通竅活血湯中劑量組；E：通竅活血湯低劑量組；F：依達拉奉組圖2 各組大鼠腦組織病理變化比較(HE染色，×100)

3.5 各組大鼠腦組織含水量比較與空白組比較，模型組大鼠腦組織含水量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織含水量顯著降低(P<0.05)；與通竅活血湯低劑量組比較，通竅活血湯高、中劑量組及依達拉奉組大鼠腦組織含水量顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠腦組織含水量比較

4 討論

TBI的特征是損傷部位的持續(xù)性神經(jīng)炎性反應，最終導致廣泛的神經(jīng)元死亡[5]。HMGB1是創(chuàng)傷性腦損傷后釋放的最早的促炎細胞因子之一，是神經(jīng)炎癥的主開關[6]。HMGB1是一種位于細胞核中的染色質相關蛋白，是高度保守的非組蛋白DNA結合蛋白，可在生理條件下穩(wěn)定染色質結構、控制轉錄和DNA 修復[7]。但是，在病理條件下，HMGB1可損傷相關分子蛋白。HMGB1由壞死神經(jīng)元和募集到損傷部位的其他免疫細胞在細胞外釋放，然后與相應的靶受體結合，從而上調包括HMGB1在內的其他促炎細胞因子的釋放[8]。一旦HMGB1被釋放到細胞外，它就會成為一種重要的促炎因子[9]。鑒于HMGB1在介導神經(jīng)炎癥和神經(jīng)發(fā)生中的雙重作用，它有望成為治療TBI的潛在靶點。Gao等[10]通過腦損傷大鼠實驗發(fā)現(xiàn)，甘草素通過調節(jié)小膠質細胞/巨噬細胞的激活來減輕TBI，該作用至少部分是通過抑制HMGB1實現(xiàn)的。因此，靶向HMGB1以調節(jié)小膠質細胞/巨噬細胞極化應該是TBI 的一種潛在治療方法。Yang等[11]研究了HMGB1 A-box片段(一種與全長HMGB1競爭受體結合的拮抗劑)對抗TBI的治療效果發(fā)現(xiàn)，HMGB1 A-box可逆轉TBI后小鼠的腦損傷，還可通過保護血腦屏障的完整性，改善細胞變性，減少TBI后受損腦組織促炎細胞因子的釋放，顯著減輕腦水腫，因此，HMGB1 A-box片段可能具有治療TBI繼發(fā)性腦損傷的潛力。從中藥甘草中分離得到的甘草甜素治療TBI模型小鼠發(fā)現(xiàn)，其可抑制TBI小鼠中HMGB1的水平，從而降低腦水腫[12]。

腦外傷患者的腦脊液中存在高水平的IL-6 和可溶性IL-6 受體。為應對損傷，IL-6 充當創(chuàng)傷后炎癥發(fā)生和發(fā)展的重要介質，進一步導致細胞死亡和神經(jīng)功能障礙。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中IL-6 的過度產(chǎn)生會增加炎性細胞因子的產(chǎn)生，當中樞神經(jīng)系統(tǒng)失調時，IL-6 可能具有促炎作用，因此IL-6可能是治療干預腦損傷的靶點[13]。吡格列酮是過氧化物酶體增殖物激活的受體-γ的激活劑，可改善TBI后大鼠的神經(jīng)損傷，減輕腦水腫，并且吡格列酮的保護作用是通過調控PPARγ/NF-κB/IL-6信號通路來實現(xiàn)的[14]。Hergenroeder 等[15]對比健康志愿者和嚴重 TBI 患者血清中炎性細胞因子的水平發(fā)現(xiàn)，血清IL-6可用于TBI中升高的顱內壓的鑒別診斷。Aisiku 等[16]發(fā)現(xiàn)，血漿細胞因子IL-6與嚴重顱腦外傷患者的急性呼吸窘迫綜合征有關。去甲腎上腺素可通過阻斷ERK、MAPK和IL-6對幼豬的腦損傷發(fā)揮腦部自動調節(jié)功能改善的作用，并減少海馬壞死[17-18]。

中醫(yī)古籍中沒有對創(chuàng)傷性腦損傷的明確描述，大部分醫(yī)家根據(jù)創(chuàng)傷性腦損傷后出現(xiàn)的學習認知能力、記憶能力、情感障礙等把其歸屬于中醫(yī)的“頭痛”“頭部內傷”等范疇。臨床上病人頭部外傷后多呈現(xiàn)明顯頭痛，故而醫(yī)者認為本病病機主要為跌撲閃挫、頭部外傷，氣血滯澀，瘀血阻于腦絡，其代表性方藥常選用通竅活血湯，此方活血化瘀、通竅止痛，臨床效果確切。

通竅活血湯由清代醫(yī)家王清任所創(chuàng)，原記載于《醫(yī)林改錯》，是活血化瘀的名方、驗方，其方選丹參、赤芍、川芎行血活血，桃仁、紅花活血化瘀，生地黃、當歸生血養(yǎng)血，蔥白、生姜通陽散結，牛膝活血且可導瘀下行，柴胡疏肝解郁，枳殼行氣，菊花清熱且可載藥上達，甘草、大棗益氣和中。通竅活血湯治療腦組織及腦血管疾病方面的臨床及實驗研究廣泛，為創(chuàng)傷性腦損傷的臨床治療及動物實驗提供了良好的基礎。劉昌亞等[19]研究通竅活血湯對動脈瘤破裂蛛網(wǎng)膜下腔出血的患者早期腦損傷的作用發(fā)現(xiàn)，加用通竅活血湯患者比單純動脈瘤栓塞治療的患者血清細胞內黏附分子-1、IL-1β的水平更低。安聰[20]發(fā)現(xiàn)，通竅活血湯對重型顱腦損傷大鼠急性期的神經(jīng)損傷有一定的治療效果，其作用可能是通過降低IL-6的含量，從而減輕繼發(fā)性炎癥反應實現(xiàn)的。金正龍等[21]發(fā)現(xiàn)，采用通竅活血湯聯(lián)合丁苯酞治療的老年慢性腦缺血患者的HMGB1水平顯著低于單純丁苯酞治療患者。以上研究從炎癥反應角度說明了通竅活血湯對腦損傷相關性疾病的作用。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，通竅活血湯能降低腦缺血再灌注損傷小鼠腦中伊文思藍的含量，提高腦損傷后單胺類神經(jīng)遞質的水平，對腦缺血再灌注模型小鼠神經(jīng)功能有一定的保護作用[22]。通竅活血湯還可通過激活PI3K/AKt/mTOR通路抑制腦缺血損傷后大鼠的神經(jīng)細胞自噬，發(fā)揮神經(jīng)保護的作用[23]。薛廣團等[24]對中重度創(chuàng)傷性腦損傷患者在對癥治療基礎上增加針灸和通竅活血湯加味治療，為期8周，用格拉斯哥昏迷評分、殘疾分級評分、日常生活能力評分和格拉斯哥預后評分比較臨床療效發(fā)現(xiàn)，增加針灸和通竅活血湯加味組患者的相關評分和有效率更佳。本研究采用通竅活血湯治療腦外傷大鼠發(fā)現(xiàn)，通竅活血湯組大鼠的神經(jīng)功能評分顯著升高，HMGB1、IL-6含量、神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量、腦組織含水量顯著降低，提示通竅活血湯可通過降低HMGB1、IL-6的含量，減少神經(jīng)細胞凋亡和腦組織含水量，促進創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)恢復。

綜上所述，通竅活血湯可以降低HMGB1、IL-6的含量，減少神經(jīng)細胞凋亡和腦組織含水量，促進創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)恢復。本研究存在一定的局限性，尚缺乏相關機制研究，后續(xù)需要通過細胞學、動物學方面的實驗研究闡明相關機制。