王倩，陳亭亭，王守梅，張樹(shù)輝

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437

原發(fā)性肝癌是我國(guó)第4位常見(jiàn)惡性腫瘤及第2位致死腫瘤，嚴(yán)重威脅人民的生命安全和健康，其中75%～85%原發(fā)性肝癌為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，常由慢性乙型或丙型肝炎病毒感染所致[1]。大多數(shù)HCC在中晚期才被確診，選擇合理和規(guī)范化的多學(xué)科綜合治療可獲得最佳療效[2]。肝癌以氣血虧虛為本，肝失疏泄為基本病機(jī)，氣血濕熱瘀毒互結(jié)為標(biāo)，蘊(yùn)結(jié)于肝，漸成癥積，HCC不同病期分別采用疏肝理氣、活血化瘀、清熱解毒等扶正祛邪、標(biāo)本兼治的辨證論治法恢復(fù)肝主疏泄之功能，使氣血流暢，祛濕熱瘀毒之邪，對(duì)控制癥狀、提高免疫力、預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及提高生存質(zhì)量等優(yōu)勢(shì)明顯。以往研究顯示，清熱解毒藥半枝蓮在原發(fā)性肝癌的治療中使用頻率較高[3-5]。半枝蓮為唇形科黃芩屬植物半枝蓮的全草，具有清熱解毒、散腫消癰等功效。藥理學(xué)及臨床研究表明，半枝蓮及其活性成分具有良好的抗腫瘤作用，常用于肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的治療[6-9]。本研究采用高、低轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞系MHCC-97H和MHCC-97L探究半枝蓮乙醇提取物對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，并分析其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株SPF級(jí)4周齡雄性BALB/c裸鼠16只，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：20180003007216。所有小鼠均飼養(yǎng)于恒溫(25±2) ℃，濕度50%～ 60%的SPF環(huán)境中，高壓滅菌后的水和飼料隨意進(jìn)食。所有實(shí)驗(yàn)方案均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物治療和使用委員會(huì)的指南進(jìn)行，并獲得上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)號(hào)：YYLAC-2019-036-4-2。人高、低轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞株MHCC-97H和MHCC-97L購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 試劑半枝蓮(產(chǎn)地：浙江，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，貨號(hào)：0306901)；5-氟尿嘧啶(美國(guó)MCE公司，貨號(hào)：HY-90006，規(guī)格：1 g/瓶)；DMEM高糖型培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司，貨號(hào)：SH30243.01)；胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司，貨號(hào)：16000-044)；青鏈霉素混合液、結(jié)晶紫、RNase A(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：P1400-100、C8470、R8020-25)；CCK-8 試劑盒(美國(guó)Signalway Antibody公司，貨號(hào)：CP002)；BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，貨號(hào)：PICPI23223)；PI染液(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司，貨號(hào)：C001-200)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：C1063)；CD133、EpCAM抗體(美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)：11-1339-42、A15782)；CycinD1、P27抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司，貨號(hào)：2922、3686)；Bcl-2、Bax、Ki-67抗體(英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：Ab194583、Ab32503、Ab209897)；E-cadherin、GAPDH抗體(美國(guó)Proteintech公司，貨號(hào)：20874-1-AP、60004-1-Ig)；Vimentin抗體(英國(guó)Affinity公司，貨號(hào)：AF0292)；二抗(上海譽(yù)源有限公司，貨號(hào)：70678)。

1.3 儀器精密電子天平(德國(guó)Sartorius公司，型號(hào)：CP225D)；高速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)：TDZ4-WS)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，型號(hào)：Thermo Forma 3111)；酶標(biāo)分析儀(北京普朗新公司，型號(hào)：DNM-9602)；顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：XDS-500C)；Transwell小室(美國(guó)COSTAR公司，型號(hào)：3422)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，型號(hào)：Accuri C6)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能生命科學(xué)有限公司，型號(hào)：5200)；Leica石蠟切片機(jī)、全自動(dòng)免疫組織化學(xué)儀(德國(guó)Leica公司，型號(hào)：RM2235、Bond Max)。

2 方法

2.1 藥物的制備參考文獻(xiàn)[10]介紹的方法制備半枝蓮乙醇提取物，取半枝蓮1 000 g，按1 g10 mL 的固液比加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，加熱回流提取3次，過(guò)濾后合并濾液，60 ℃真空干燥3 d，最后減壓濃縮得到粉末，將得到的粉末制成濃度為100 g·L-1的半枝蓮乙醇提取物儲(chǔ)備液，4 ℃冰箱備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)人高、低轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞株MHCC-97H和MHCC-97L復(fù)蘇后置于含 100 U·mL-1青鏈霉素混合液和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)取MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞，制成3×104mL-1的細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，每孔加入100 μL不同濃度(0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、1.0 g·L-1、2.0 g·L-1和3.0 g·L-1)的半枝蓮乙醇提取物，對(duì)照組加入等體積完全培養(yǎng)液，每組3個(gè)復(fù)孔，分別處理0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含10%CCK-8溶液的無(wú)血清必需培養(yǎng)基，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h后，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(optical density，OD)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。以50%最大抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)作為半枝蓮乙醇提取物組的實(shí)驗(yàn)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、半枝蓮乙醇提取物組和5-氟尿嘧啶組(10 mg·L-1)。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%

2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)取MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞，制成3×103mL-1的單細(xì)胞懸液，接種于37 ℃培養(yǎng)皿中，每皿1 mL，培養(yǎng)24 h。按照2.3項(xiàng)所述進(jìn)行分組及給藥，每組3個(gè)復(fù)孔，5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2周，每隔3 d換液1次并觀察細(xì)胞狀態(tài)，克隆完成后，PBS洗滌2次，4%甲醛固定15 min，加1%結(jié)晶紫染色30 min，流水沖洗、干燥，顯微鏡下觀察并按文獻(xiàn)介紹的方法計(jì)算細(xì)胞克隆形成率[11]。

2.5 細(xì)胞周期和凋亡實(shí)驗(yàn)取MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞，制成3×105mL-1的單細(xì)胞懸液，分別接種在6孔板中，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h。按照2.3項(xiàng)所述進(jìn)行分組及給藥，每組3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)：胰酶消化細(xì)胞，離心 5 min 后，PBS洗滌2次，加入-20 ℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇700 μL，于4 ℃固定24 h，繼續(xù)離心5 min，PBS重懸細(xì)胞，加入濃度為100 mg·L-1的RNase A溶液 100 μL，重懸沉淀細(xì)胞，避光下37 ℃溫浴30 min，每管加入濃度為50 mg·L-1的PI溶液400 μL，避光下4 ℃孵育10 min，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和分析。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：胰酶消化細(xì)胞，離心5 min后PBS洗滌2次，計(jì)數(shù)10×104個(gè)重懸細(xì)胞，離心5 min，棄上清，分別加入195 μL Annexin V和5 μL FITC結(jié)合液混勻，避光下4 ℃孵育15 min；再加入PI染色液 5 μL 混勻，避光下4 ℃孵育5 min，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和分析。

2.6 細(xì)胞劃痕、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)[12]記載的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞，胰酶消化后計(jì)數(shù)8×105個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞分組同2.3項(xiàng)所述，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，用槍頭劃去皿中細(xì)胞，PBS沖洗，按實(shí)驗(yàn)分組給藥處理后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別在劃痕0 h、24 h取出培養(yǎng)皿，在倒置顯微鏡下拍照，使用Image J軟件測(cè)量劃痕面積和寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞Transwell小室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)：先將MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓培養(yǎng)24 h，在各組Transwell小室的上室中加入細(xì)胞密度為2×105mL-1的細(xì)胞懸液0.3 mL(侵襲實(shí)驗(yàn)另需在小室的上室中加入80 μL基質(zhì)膠)，分組同2.3項(xiàng)所述，對(duì)照組在transwell小室的下室中加入0.7 mL含10%FBS的完全培養(yǎng)液；半枝蓮乙醇提取物組在transwell小室的下室中加入0.7 mL含2 g·L-1半枝蓮乙醇提取物和10%FBS的完全培養(yǎng)液；5-氟尿嘧啶組在transwell小室的下室中加入0.7 mL含 10 mg·L-15-氟尿嘧啶和10%FBS的完全培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)72 h后甲醛固定，結(jié)晶紫染色后PBS洗滌，晾干，顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)。

細(xì)胞遷移率=(1-24 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度)×100%

2.7 細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)取MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞，制成1×104mL-1的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每組3個(gè)復(fù)孔，按2.3項(xiàng)所述進(jìn)行分組給藥后，用無(wú)血清成球培養(yǎng)基培養(yǎng) 14 d，期間每隔3 d換液1次，觀察細(xì)胞成球狀態(tài)，并計(jì)算球體形成率。

球體形成率=(成球細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%

2.8 干細(xì)胞標(biāo)記EpCAM+和CD133+細(xì)胞比例檢測(cè)取MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞，按2.3項(xiàng)所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組給藥后計(jì)數(shù)(5～10)×104個(gè)重懸細(xì)胞，加入200 μL PBS、5 μL EpCAM和5 μL CD133抗體混勻，4 ℃避光30 min，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析結(jié)果。

2.9 Western Blot檢測(cè)按2.3項(xiàng)所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組給藥后，參考文獻(xiàn)的方法提取MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞蛋白質(zhì)[11]，用BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度，制備PAGE膠、上樣和電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉，加一抗CyclinD1、P27、Bcl-2、Vimentin、Ki-67(稀釋比例為11 000)、Bax(稀釋比例12 000)、E-cadherin(稀釋比例15 000)、GAPDH(稀釋比例18 000))和膜4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，加二抗(稀釋比例110 000)與膜37 ℃孵育1 h，洗膜后加入配制的ECL發(fā)光液，放入凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá)，再用灰度分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2.10 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)將16只BALB/C裸鼠分為半枝蓮乙醇提取物組和對(duì)照組，每組8只。在每只裸鼠左側(cè)腋窩皮下注射100 μL(約2×106個(gè))MHCC-97H細(xì)胞，SPF級(jí)條件下喂養(yǎng)，按文獻(xiàn)介紹的方法[11]，每日觀察裸鼠及移植瘤情況，待移植瘤直徑>0.5 cm時(shí)開(kāi)始給藥治療，給藥劑量參考文獻(xiàn)[9]，半枝蓮乙醇提取物組灌胃給予0.97 g·kg-1的半枝蓮乙醇提取物溶液，對(duì)照組每天灌胃給予2.0 mL的9 g·L-1生理鹽水，隔5 d記錄移植瘤的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，計(jì)算移植瘤的體積(體積=1/2×a×b2)[9]。灌胃35 d后處死裸鼠，取出腫瘤、肝和肺組織置于10%中性甲醛液固定。

2.11 形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查將移植瘤、肝和肺組織進(jìn)行取材，常規(guī)石蠟包埋，3～5 μm厚石蠟切片行HE染色和Ki-67免疫組織化學(xué)染色。免疫組化染色在全自動(dòng)免疫組織化學(xué)儀中進(jìn)行。顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判讀參考文獻(xiàn)進(jìn)行[13]。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度半枝蓮乙醇提取物對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和克隆形成的影響與對(duì)照組比較，不同濃度半枝蓮乙醇提取物可明顯抑制MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞的增殖，且呈劑量-時(shí)間依賴性(P<0.05)，見(jiàn)圖1A，其中半枝蓮乙醇提取物作用72 h的抑制作用最明顯，通過(guò)SPSS軟件分析顯示半枝蓮乙醇提取物組干預(yù)MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞 72 h 的IC50值分別為 2.490 g·L-1及2.243 g·L-1，見(jiàn)圖1B，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取2.0 g·L-1為半枝蓮乙醇提取物組藥物濃度。與對(duì)照組比較，半枝蓮乙醇提取物可使MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞的克隆數(shù)目明顯減少(P<0.01)，見(jiàn)圖1C。

注：A：細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；B：細(xì)胞抑制率；C：細(xì)胞平板克隆形成。與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與半枝蓮乙醇提取物組比較，#P<0.05；n=3圖1 不同濃度半枝蓮乙醇提取物對(duì)MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

3.2 半枝蓮乙醇提取物對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組比較，半枝蓮乙醇提取物組 MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.01)，S期和G2/M 期細(xì)胞比例顯著減少(P<0.01)，表明半枝蓮乙醇提取物將細(xì)胞周期停滯于G0/G1期。此外，與對(duì)照組比較，半枝蓮乙醇提取物顯著促進(jìn)MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞凋亡(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

注：A：細(xì)胞周期流式檢測(cè)圖；B：細(xì)胞周期分布比較；C：左側(cè)為細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)圖，右側(cè)為細(xì)胞凋亡指數(shù)比較；與對(duì)照組比較，**P<0.01；與半枝蓮乙醇提取物組比較，#P<0.05；n=3圖2 半枝蓮乙醇提取物對(duì)MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞周期和凋亡的影響

3.3 半枝蓮乙醇提取物對(duì)細(xì)胞劃痕愈合、遷移和侵襲的影響與對(duì)照組比較，半枝蓮乙醇提取物組MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞的劃痕愈合進(jìn)程明顯縮短(P<0.05)，細(xì)胞侵襲的數(shù)目明顯減少(P<0.05)；MHCC-97L細(xì)胞遷移數(shù)目明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

注：A：細(xì)胞劃痕試驗(yàn)；B：細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；C：細(xì)胞侵襲試驗(yàn)。左側(cè)為光鏡下觀察得到的圖片(×200)，右側(cè)為計(jì)數(shù)資料比較；與對(duì)照組比較，**P<0.01；與半枝蓮乙醇提取物組比較，#P<0.05；n=3圖3 半枝蓮乙醇提取物對(duì)MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞劃痕、遷移和侵襲的影響

3.4 半枝蓮乙醇提取物對(duì)細(xì)胞成球和干細(xì)胞特性的影響與對(duì)照組比較，半枝蓮乙醇提取物組MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞成球體積明顯變小，細(xì)胞球體形成率明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖4A。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與對(duì)照組比較，半枝蓮乙醇提取物組EpCAM+與CD133+細(xì)胞比例顯著下降(P<0.01)，見(jiàn)圖4B。

注：A：細(xì)胞成球情況(×200)；B：干性標(biāo)記EpCAM+和CD133+流式細(xì)胞術(shù)分布圖；左側(cè)為代表性圖片，右側(cè)為計(jì)數(shù)資料比較。與對(duì)照組比較，**P<0.01；與半枝蓮乙醇提取物組比較，#P<0.05；n=3圖4 半枝蓮乙醇提取物對(duì)MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞成球和干細(xì)胞特性的影響

3.5 半枝蓮乙醇提取物對(duì)細(xì)胞周期、凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，半枝蓮乙醇提取物組MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白Cyclin D1、Bcl-2、Ki-67表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，P27、Bax表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)，Vimentin表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

注：A：Western Blot蛋白條帶圖片；B：蛋白表達(dá)定量分析。與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；n=3圖5 半枝蓮乙醇提取物對(duì)MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞周期、凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

3.6 半枝蓮乙醇提取物對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及肝、肺轉(zhuǎn)移的影響與對(duì)照組比較，半枝蓮乙醇提取物組MHCC-97H細(xì)胞移植瘤體積明顯縮小(P<0.05)。見(jiàn)圖6A。移植瘤組織形態(tài)學(xué)檢查顯示，對(duì)照組腫瘤細(xì)胞呈彌散致密排列、有不同程度有絲分裂活性；半枝蓮乙醇提取物組腫瘤組織可見(jiàn)明顯的壞死和凋亡。見(jiàn)圖6B。免疫組織化學(xué)分析表明，與對(duì)照組比較，半枝蓮乙醇提取物組Ki-67蛋白染色減少，見(jiàn)圖6C。肝、肺組織形態(tài)學(xué)檢查顯示，與對(duì)照組比較，半枝蓮乙醇提取物組移植瘤肝、肺轉(zhuǎn)移灶的大小和數(shù)目明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖7。

注：A：移植瘤的大體形態(tài)和生長(zhǎng)曲線；B：移植瘤組織形態(tài)學(xué)(HE染色，×200)；C：移植瘤Ki-67免疫組化染色(×400)。與對(duì)照組比較，*P<0.05；n=8圖6 半枝蓮乙醇提取物對(duì)MHCC-97H細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)、肝肺轉(zhuǎn)移的影響

圖7 半枝蓮乙醇提取物對(duì)MHCC-97H細(xì)胞裸鼠移植瘤肺和肝轉(zhuǎn)移的影響(HE染色，×200)

表1 半枝蓮乙醇提取物對(duì)移植瘤肝、肺轉(zhuǎn)移的影響

4 討論

肝細(xì)胞癌惡性程度較高，易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，術(shù)后較高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率是治療肝癌的重大障礙。中醫(yī)上無(wú)“肝癌”這一病名，肝癌的“積聚”“癥瘕”“臌脹”“脅痛”“黃疸”等臨床癥狀與中醫(yī)經(jīng)典著作《內(nèi)經(jīng)》中的“積”病相似，因此，眾多中醫(yī)專家采用扶正祛邪、活血化瘀、疏肝理氣、解毒抑瘤等法治療肝癌[14-15]，發(fā)揮了中草藥獨(dú)特的功效和協(xié)同干預(yù)作用，在臨床廣泛應(yīng)用于抑制腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。半枝蓮是中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中常用的抗腫瘤組方藥物，已有研究報(bào)道，半枝蓮可抑制多種腫瘤如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、肝癌和胃癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[16-20]。

細(xì)胞增殖與凋亡的穩(wěn)態(tài)失衡是腫瘤的發(fā)病機(jī)制之一，因此，可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)展，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而減緩肝癌細(xì)胞的發(fā)展。研究顯示，半枝蓮乙醇提取物作用Hep-G2細(xì)胞72 h后，可促使早期凋亡細(xì)胞增多，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展，抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)[21]。半枝蓮主要活性成分木犀草素通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期G0/G1期(Huh 7細(xì)胞)或G2/M期(HepG2)，調(diào)控多個(gè)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因包括cyclinA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、p21、p27、Bax和Bcl-2等的表達(dá)[13]，抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞周期的相關(guān)蛋白，特別是CyclinD1在很多腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，加速了細(xì)胞周期進(jìn)展，在細(xì)胞增殖中起到癌基因的作用[22-23]。Bcl-2和Bax是調(diào)控凋亡的蛋白，兩者形成二聚體而又互相拮抗，當(dāng)機(jī)體受到外界異常刺激后，若Bcl-2表達(dá)高于Bax時(shí)，抑制細(xì)胞凋亡；若Bax表達(dá)高于Bcl-2時(shí)，激活Caspase-3蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24]。半枝蓮乙醇提取物作用人肝癌SMMC-7721細(xì)胞后，使得Caspase-3蛋白表達(dá)顯著上升，Bcl-2和Survivin蛋白表達(dá)明顯下降，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[25]。本研究結(jié)果顯示，半枝蓮乙醇提取物顯著抑制MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞的體外增殖和體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)，其機(jī)制與降低CyclinD1、Bcl-2、Ki-67蛋白表達(dá)水平，提高P27和Bax蛋白表達(dá)水平，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等有關(guān)。

惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移在腫瘤相關(guān)死亡中起著關(guān)鍵作用。EMT標(biāo)志物E-cadherin和Vimentin是HCC進(jìn)程和侵襲的決定性分子[12]。研究顯示，半枝蓮乙醇提取物通過(guò)阻斷TGF-β/Smad/AMPK信號(hào)通路，上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)水平，下調(diào)N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制肝癌 HepG2細(xì)胞遷移及侵襲[26]。課題組前期的研究顯示，半枝蓮提取物可降低HBV陽(yáng)性肝細(xì)胞癌HepG2.2.15和Hep3B細(xì)胞的劃痕愈合率，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲[9]。此外，半枝蓮乙醇提取物也可抑制HepG2肝癌細(xì)胞侵襲和遷移，誘發(fā)細(xì)胞自噬，該作用與半枝蓮提取物抑制Raf/MEK/ERK信號(hào)通路有關(guān)[27]。本研究結(jié)果顯示，半枝蓮乙醇提取物可下調(diào)Vimentin蛋白表達(dá)水平，上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)水平，降低細(xì)胞劃痕愈合率，減少遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目。

腫瘤干細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖和自我更新能力，與腫瘤細(xì)胞耐藥、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。研究顯示，腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物EpCAM和 CD133參與肝癌惡性進(jìn)程的發(fā)展，通過(guò)免疫組化檢測(cè)到這兩個(gè)指標(biāo)在肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織[28]，EpCAM和CD133的高表達(dá)可提示肝癌患者預(yù)后不良。本研究也顯示，半枝蓮乙醇提取物可降低干細(xì)胞EpCAM+與CD133+細(xì)胞數(shù)量及球體形成，與Liu等[29]的研究報(bào)道相同，提示半枝蓮乙醇提取物可通過(guò)調(diào)控干細(xì)胞特性相關(guān)分子，抑制肝癌MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，半枝蓮乙醇提取物可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程、促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡、調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和干細(xì)胞特性相關(guān)基因表達(dá)抑制肝癌MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞體內(nèi)外生長(zhǎng)和侵襲，為臨床上半枝蓮乙醇提取物治療HCC提供理論依據(jù)。