章素芬，胡幼芳

注意缺陷多動障礙(attention deficit hyperactivity disorder，ADHD)是以注意缺陷、多動及沖動為主的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，兒童期較常見。流行病學資料顯示，全球ADHD發(fā)病率為7.2%，我國ADHD患病率為5.6%[1-2]，這不僅導致兒童注意缺陷、認知障礙，影響兒童早期智力發(fā)展，同時約60%的病人ADHD癥狀持續(xù)至成年期，且ADHD亦是青春期和成年期社交障礙和犯罪的重要危險因素[3]。腦特異性血管發(fā)生抑制劑1相關(guān)蛋白2(brain-specific angiogenesis inhibitor 1-associated protein 2，BAIAP2)基因位于人類染色體17q25.3，在大腦皮層中高度富集，參與神經(jīng)元的再生和成熟[4]。相關(guān)研究表明，大腦半球不對稱表達的BAIAP2與ADHD存在聯(lián)系，且BAIAP2基因多態(tài)性與兒童ADHD發(fā)病相關(guān)，提示BAIAP2可能參與ADHD的發(fā)病過程[5-6]。BAIAP2在ADHD患兒中的表達及臨床意義尚未明確。BAIAP2通過調(diào)控樹突棘形態(tài)和密度參與突觸可塑性改變[7]，然而BAIAP2能否通過調(diào)控突觸可塑性參與ADHD的發(fā)生尚未明確。本研究旨在分析BAIAP2 mRNA在臨床ADHD患兒中的表達及臨床意義，通過構(gòu)建動物模型探討B(tài)AIAP2 mRNA調(diào)控ADHD癥狀的潛在作用機制，以期為闡明ADHD的發(fā)病機制及臨床診療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年7月—2021年7月在江蘇省人民醫(yī)院婦幼保健分院確診的60例ADHD兒童作為ADHD組，其中男36例，女24例，年齡5～13(8.57±2.20)歲。同時納入同期我院健康體檢的健康兒童40名為對照組，其中男24名，女16名，年齡5～13(8.48±1.93)歲。ADHD納入標準：所有患兒均符合《中國注意缺陷多動障礙防治指南》第二版[8]中ADHD診斷標準；首次就診且近6個月內(nèi)未服用任何抗精神藥物；經(jīng)頭顱MRI或CT檢查證實不存在任何腦組織缺損或缺血；韋氏幼兒智力量表第4版(WISC-Ⅳ)[9]測試智商>70分；視力及聽力正常；所有患兒家屬知情同意并簽署知情同意書。排除標準：既往存在或合并精神疾病史、精神疾病藥物治療史；合并慢性感染性、代謝性或免疫性疾?。淮嬖诩易寰襁z傳??；無法配合治療和隨訪。本研究經(jīng)江蘇省人民醫(yī)院倫理委員會審查并批準通過。

1.2 臨床研究方法

1.2.1 一般資料收集 記錄研究對象年齡、性別、身高、體重、體質(zhì)指數(shù)、分娩方式及多胞胎情況等。

1.2.2 WISC-Ⅳ測試 采用WISC-Ⅳ評估研究對象的認知水平，分別統(tǒng)計言語理解指數(shù)(verbal comprehension index，VCI)、知覺推理指數(shù)(perceptual reasoning index，PRI)、工作記憶指數(shù)(working memory index，WMI)和加工速度指數(shù)(processing speed index，PSI)4項指標的得分，最終計算獲得總智商(full scale IQ，F(xiàn)SIQ)分值。

1.2.3 血液采集及RNA提取 未采接受任何治療前，由專業(yè)醫(yī)師抽取研究對象靜脈血液1 mL并加入3 mL紅細胞裂解液室溫裂解10 min，3 000 r/min離心5 min后收集底部白細胞沉淀，之后加入1 mL TRIzol室溫裂解5 min，12 000 r/min離心10 min后，去上清并加入200 μL氯仿，震蕩后將上層水相轉(zhuǎn)移至新的Ep管中，加入等體積的異丙醇室溫放置20 min，之后離心獲得RNA沉淀，使用75%的乙醇清洗后加入30 μL RNase-free水，檢測RNA濃度和純度。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR) 將血液中獲得的RNA按照試劑盒說明書將合格RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件：50 ℃反應(yīng)2 min；95 ℃反應(yīng)2 min；95 ℃反應(yīng)15 s；60 ℃反應(yīng)32 s。每個樣品重復3次。BAIAP2 mRNA的相對表達量計算公式：△Ct=(均值±靶基因Ct-內(nèi)參比Ct標準差)；△△Ct=(被試樣本目標基因△Ct-參考樣本目標基因△Ct)均值±標準差；相對表達=(2-△△Ct)均值±標準差。引物序列：BAIAP2正向引物5′-AGGAGGTGTTTCTGCTCTGG-3′，反向引物5′-AATAGCAGTCTGGGGTCTGG-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.3 動物實驗方法

1.3.1 實驗動物及處理 有研究表明，4～10周齡的自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertension rat，SHR)表現(xiàn)出與ADHD癥狀相似的行為學和中樞系統(tǒng)變化，是目前模擬ADHD實驗的理想動物模型，廣泛應(yīng)用于ADHD的癥狀學、機制及治療的基礎(chǔ)研究[10]。本研究選擇無特定病原體(SPF)級雄性SHR 30只，SPF級雄性Wistar大鼠10只，4周齡，體質(zhì)量180～240 g，每籠5只，購自北京維通利華公司。飼養(yǎng)在SPF級動物實驗室，室溫(25±2)℃，光照循環(huán)時間為08：00～20：00，濕度為50%～60%。

將30只SHR隨機分為SHR組、生理鹽水組(Sal組)及鹽酸哌甲酯組(MH組)，各10只。其中SHR組不進行任何處理，Sal組大鼠給予生理鹽水(1.5 mg/kg)灌胃處理2周，MH組大鼠給予鹽酸哌甲酯(安楊森制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：每片18 mg，批號：7JE540)1.5 mg/kg灌胃處理2周。正常Wistar大鼠納入Con組(10只)不進行任何干預。

1.3.2 行為學測定

1.3.2.1 曠場實驗(open field test，OFT) OFT評定SHR模型自發(fā)性活動能力及焦慮樣水平。首先將曠場(100 cm×100 cm)劃分為外周區(qū)和中央?yún)^(qū)(30 cm×30 cm)，觀察時將單只大鼠置于光潔曠場中央，采用視頻攝像系統(tǒng)Smart 3.0軟件記錄大鼠5 min內(nèi)運動距離及在中心區(qū)的時間。

1.3.2.2 Y迷宮實驗(Y maze test，YMT) YMT評定SHR模型認知缺陷。該裝置包括3個閉合臂(50 cm×10 cm，40 cm壁)，與中心平臺之間角度呈120°。將每只大鼠輕輕置于中心平臺中，面對相同的迷宮，并許其自由探索3條手臂，持續(xù)6 min。由視頻攝像系統(tǒng)Smart 3.0記錄進入手臂的順序。成功交替的定義：大鼠連續(xù)進入第3個手臂，之后進入前2個手臂。自發(fā)交替次數(shù)(%)=(成功交替次數(shù)/單項總數(shù)-2)×100%。

1.3.3 透射電鏡實驗 大鼠拉頸處死立即在冰上將前額葉取出，并切割為1 mm3，之后置于電鏡固定液中固定24 h，使用1%鋨緩沖液固定2 h。依次使用丙酮/環(huán)氧樹脂(2∶1)、丙酮/環(huán)氧樹脂(1∶1)、環(huán)氧樹脂溶液中浸泡，使用環(huán)氧樹脂包埋組織。將下丘腦樣本切成約50 nm厚薄片，在醋酸二惡烷鈾中浸泡45 min，進行電子染色。使用H-7650透射電鏡采集神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)圖像。

1.3.4 免疫熒光實驗 行為學檢測結(jié)束后將大鼠前額葉分離，甲醛固定并脫水沉糖后采用OCT包埋前額葉并按照冠狀位進行切片(20 μm)以備后續(xù)的免疫熒光染色。首先將腦片進行抗原修復，之后采用10%的正常山羊血清室溫封閉處理1h，使用BAIAP2抗體(abcam，ab126057)4 ℃孵育過夜，次日將腦片從冰箱取出后進行室溫復溫30 min，采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3次，每次10 min，二抗室溫下孵育2 h，采用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進行復染細胞核。顯色后，采用熒光顯微鏡觀察PSD95及SYN蛋白的陽性細胞數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料及WISC-Ⅳ評分比較 兩組臨床資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表1。與對照組比較，ADHD組VCI、PRI、WMI、PSI和FSIQ得分均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表2。

表1 兩組臨床資料比較

表2 兩組WISC-Ⅳ評分比較(±s) 單位：分

2.2 兩組BAIAP2 mRNA表達及臨床意義 ADHD組血液BAIAP2 mRNA表達低于對照組(t=-8.550，P<0.05)，詳見圖1。BAIAP2 mRNA表達量與WISC-Ⅳ得分的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：血液BAIAP2 mRNA表達與VCI、PRI、WMI、PSI及FSIQ評分均呈正相關(guān)，詳見圖2。以血液BAIAP2 mRNA濃度為檢驗變量，以ADHD為狀態(tài)變量，繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，BAIAP2mRNA的ROC曲線下面積(AUC)為0.879 4，95%CI[0.810 5，0.914 2]，靈敏度為77.1%，特異度為80.0%，P<0.001，詳見圖3。

兩組比較，＊P<0.05。圖1 兩組BAIAP2 mRNA表達量比較柱狀圖

圖2 BAIAP2 mRNA與WISC-Ⅳ得分的相關(guān)性散點圖(A為VCI與BAIAP2 mRNA相關(guān)性；B為PRI與BAIAP2 mRNA相關(guān)性；C為WMI與BAIAP2 mRNA相關(guān)性；D為PSI與BAIAP2 mRNA相關(guān)性；E為FSIQ與BAIAP2 mRNA相關(guān)性)

圖3 BAIAP2 mRNA的ROC曲線

2.3 動物行為檢測結(jié)果 OFT結(jié)果顯示，與Con組比較，SHR組大鼠曠場中運動距離增加(P<0.05)，且曠場中央?yún)^(qū)滯留時間延長(P<0.05)；MH組大鼠運動距離和進入曠場中央?yún)^(qū)時間較Sal組大鼠減少(P<0.05)。YMT結(jié)果顯示，與Con組比較，SHR組大鼠自發(fā)交替次數(shù)正確率降低(P<0.05)；與Sal組比較，MH組大鼠自發(fā)交替次數(shù)正確率升高(P<0.05)。詳見圖4。

SHR組與Con組比較，＊P<0.05；MH組與Sal組比較，#P<0.05。圖4 SHR模型大鼠行為學改變(A為曠場的行動軌跡；B為大鼠曠場的運動距離柱狀圖；C為曠場中央?yún)^(qū)時間柱狀圖；D為自發(fā)交替次數(shù)正確率柱狀圖)

2.4 SHR模型BAIAP2 mRNA表達情況 與Con組比較，SHR組BAIAP2 mRNA表達降低(P<0.05)；與Sal組比較，MH組BAIAP2 mRNA表達升高(P<0.05)。免疫熒光染色進一步提示，SHR組和Sal組大鼠前額葉BAIAP2 mRNA陽性細胞數(shù)量少于Con組和MH組(P<0.05)。詳見圖5。

SHR組與Con組比較，＊P<0.05；MH組與Sal組比較，#P<0.05。

圖5 SHR模型BAIAP2 mRNA表達情況(A為BAIAP2 mRNA相對表達量柱狀圖；B為BAIAP2陽性細胞數(shù)柱狀圖；C為前額葉BAIAP2 mRNA陽性細胞免疫熒光檢測圖)

2.5 SHR模型突觸結(jié)構(gòu)改變 與Con組比較，SHR組大鼠突觸超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化，主要表現(xiàn)為突觸間隙增寬，突觸后致密物減少及突觸曲面率降低(P<0.05)；與Sal組比較，MH組大鼠突觸間隙減小，突觸后致密物增多及突觸曲面率升高(P<0.05)。采用Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：額葉BAIAP2 mRNA表達與突觸后致密物和突觸曲面率呈正相關(guān)，與突觸間隙呈負相關(guān)。詳見圖6、圖7。

SHR組與Con組比較，＊P<0.05；MH組與Sal組比較，#P<0.05。圖6 SHR模型突觸結(jié)構(gòu)改變(A為SHR模型突觸結(jié)構(gòu)改變；B為SHR模型突觸結(jié)構(gòu)改變柱狀圖)

圖7 SHR模型突觸結(jié)構(gòu)與BAIAP2 mRNA相關(guān)性分析散點圖(A為觸曲面率與BAIAP2 mRNA相關(guān)性；B為突觸間隙與BAIAP2 mRNA相關(guān)性；C為突觸后致密物與BAIAP2 mRNA相關(guān)性)

3 討 論

ADHD是嚴重影響兒童體智發(fā)展的常見神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病。有研究顯示，罹患ADHD的患兒出現(xiàn)注意力不集中、多動和沖動等癥狀，且伴有不同程度的認知、情感和運動控制障礙，這些癥狀不僅嚴重影響患兒認知功能和智力發(fā)展，同時成為誘導青春期和成年期社交障礙和犯罪的重要危險因素[3]。本研究結(jié)果顯示，ADHD患兒VCI、PRI、WMI、PSI和FSIQ得分均降低，提示ADHD患兒注意力和執(zhí)行功能出現(xiàn)嚴重缺陷，與房海波等[11]研究結(jié)果一致。由于ADHD病因較多，涉及復雜的遺傳生理學、心理學及環(huán)境等綜合因素，目前關(guān)于ADHD的機制及臨床標志物的研究尚未明確，需積極研究尋找ADHD的潛在病理機制及生物學標志物，有助于闡明發(fā)病機制并協(xié)助臨床診斷。

BAIAP2主要富集在大腦皮層中的興奮性神經(jīng)元中，BAIAP2表達紊亂參與自閉癥、多動癥和精神分裂癥等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[12-13]。一項研究顯示，BAIAP2基因多態(tài)性是ADHD易感性的重要危險因素[6]。有研究顯示，ADHD受試者BAIAP2基因rs7210438和rs8079626位點變異與注意缺陷的嚴重程度、沖動和憤怒等行為有關(guān)，且BAIAP2基因多態(tài)性與ADHD大腦影像的默認模式網(wǎng)絡(luò)連通性和不對稱性改變有關(guān)[5]。然而ADHD患兒血液BAIAP2 mRNA表達水平及臨床意義尚未明確。本研究結(jié)果顯示，ADHD患兒血液BAIAP2 mRNA相對表達量與WISC-Ⅳ量表中各子指標得分均呈正相關(guān)，表明血液BAIAP2 mRNA相對表達量降低程度與注意缺陷程度和認知障礙程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，BAIAP2 mRNA的AUC為0.879 4，靈敏度為77.1%，特異度為80.0%，95%CI[0.810 5，0.914 2]，P<0.001，表明BAIAP2 mRNA診斷ADHD具有較高的臨床價值，因此，臨床醫(yī)師可結(jié)合患兒血清BAIAP2 mRNA相對表達量和臨床癥狀，協(xié)助ADHD臨床診斷。

突觸可塑性是突觸結(jié)構(gòu)與功能受到外界刺激后的適應(yīng)性改變，突觸結(jié)構(gòu)變化是突觸功能變化的基礎(chǔ)，涉及ADHD認知及記憶等特征改變[14]。有研究顯示，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路通過改變神經(jīng)發(fā)育過程中突觸結(jié)構(gòu)可塑性，導致ADHD，因此，突觸可塑性可能是涉及ADHD發(fā)生的潛在機制[15]。腦區(qū)中富含樹突棘的區(qū)域BAIAP2高度表達，在培養(yǎng)神經(jīng)元中BAIAP2 表達下調(diào)，引起樹突棘密度和大小減低，導致突觸結(jié)構(gòu)改變[16]。因此，本研究通過構(gòu)建SHR模型，基于動物實驗探討B(tài)AIAP2介導的突觸結(jié)構(gòu)改變是否涉及ADHD樣行為的發(fā)生和治療。

SHR是模擬ADHD癥狀的動物模型，鹽酸哌甲酯是臨床治療ADHD的一線藥物，基礎(chǔ)實驗研究可改善SHR模型缺陷行為。本研究結(jié)果顯示，與Con組比較，SHR組大鼠曠場中的運動距離增加，在曠場中央?yún)^(qū)滯留延長；給予鹽酸哌甲酯治療后，SHR大鼠運動距離和進入曠場中央?yún)^(qū)時間減少，表明SHR大鼠表現(xiàn)為沖動和多動行為，治療后這種缺陷行為得到改善。同時本研究結(jié)果顯示，與Con組比較，SHR組自發(fā)交替次數(shù)正確率降低，治療后自發(fā)交替次數(shù)正確率升高，表明SHR認知功能減輕，鹽酸哌甲酯可逆轉(zhuǎn)SHR大鼠的認知缺陷。同時本研究結(jié)果顯示，與Con組比較，SHR組大鼠前額葉中BAIAP2 mRNA表達水平降低；給予鹽酸哌甲酯治療后，BAIAP2 mRNA升高，提示BAIAP2有缺陷行為和按治療的SHR中存在變化。透射電鏡結(jié)果顯示：SHR大鼠突觸后致密物減少，突觸間隙增寬；治療后突觸后致密物增多，突觸間隙減小，且BAIAP2 mRNA表達量與突觸后致密物、突觸間隙存在相關(guān)性，表明BAIAP2 mRNA涉及SHR的突觸結(jié)構(gòu)變化。Sawallisch等[17]研究顯示，BAIAP2敲除通過降低突觸后密度，導致海馬長時程增強和嚴重學習缺陷。生物信息學研究表明，BAIAP2參與突觸后致密物的形成，其缺陷導致突觸結(jié)構(gòu)功能障礙，并誘導注意功能缺陷[18]。提示BAIAP2介導的突觸結(jié)構(gòu)可塑性是參與SHR行為學癥狀改變的重要病理機制。

綜上所述，臨床隊列發(fā)現(xiàn)ADHD患兒血液BAIAP2 mRNA相對表達量降低，BAIAP2 mRNA相對表達量與WISC-Ⅳ量表得分呈正相關(guān)，且BAIAP2 mRNA對診斷ADHD發(fā)生具有較高的靈敏度和特異度，有助于臨床醫(yī)師診斷ADHD發(fā)生。同時SHR發(fā)現(xiàn)BAIAP2介導的突觸結(jié)構(gòu)可塑性是參與SHR行為學癥狀改變的重要機制，有助于從突觸結(jié)構(gòu)方面解釋BAIAP2生物學意義和ADHD的發(fā)病機制。