胡敏敏，董慶利，秦曉杰，胡麗麗，王 園，2，劉陽(yáng)泰*

（1 上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院 上海 200093 2 上海中僑職業(yè)技術(shù)大學(xué) 上海 201514）

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，簡(jiǎn)稱單增李斯特菌）是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，廣泛分布在空氣、農(nóng)場(chǎng)、食品生產(chǎn)環(huán)境中，可在0℃以下繁殖，最適生長(zhǎng)pH 值范圍為4.6～9.5，可生長(zhǎng)水分活度低至0.92[1]。單增李斯特菌主要通過(guò)受污染的食物進(jìn)入人體，可導(dǎo)致侵襲性李斯特菌病，從而引發(fā)患者出現(xiàn)腦膜炎、流產(chǎn)，甚至死亡等嚴(yán)重后果，致死率高達(dá)20%～30%，是目前備受關(guān)注的一類食源性致病菌[2-3]。據(jù)報(bào)道，我國(guó)多類食品及其供應(yīng)環(huán)境中均發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌的污染問(wèn)題，如肉及肉制品[4]、即食食品[5]、果蔬農(nóng)產(chǎn)品[6]等，對(duì)其持續(xù)污染與生存能力的探究逐漸成為該領(lǐng)域研究人員關(guān)注的重點(diǎn)。

單增李斯特菌在食品供應(yīng)鏈的不同環(huán)節(jié)會(huì)遭遇多種環(huán)境壓力，如熱、冷、酸、干燥、高滲透壓、營(yíng)養(yǎng)缺失等，耐受復(fù)雜的環(huán)境壓力是其能持久污染的重要前提和原因[7]。同時(shí)，單增李斯特菌還可在逆境下形成生物膜以抵抗外界消毒劑或抗生素作用，并能產(chǎn)生交叉抗性[8]，導(dǎo)致相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步提升。明確單增李斯特菌在不同壓力條件下的生態(tài)表現(xiàn)與調(diào)控過(guò)程，是闡明和評(píng)估其在食品及相關(guān)環(huán)境潛在危害的重要途徑。在上述環(huán)境壓力中，營(yíng)養(yǎng)缺失條件常見(jiàn)于食品加工儲(chǔ)運(yùn)等環(huán)節(jié)的食品接觸表面或不支持微生物生長(zhǎng)的食品中，已有學(xué)者開(kāi)展了部分基礎(chǔ)性研究。然而，目前尚無(wú)文獻(xiàn)能較為全面地總結(jié)相關(guān)條件下單增李斯特菌的表型特征及調(diào)控機(jī)制。對(duì)此，本文從單增李斯特菌的生物膜形成能力、抗性和毒性3 個(gè)方面闡述其在不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下的表型特征，并闡釋?duì)褺、（p）ppGpp 和sRNA 3 類物質(zhì)在單增李斯特菌營(yíng)養(yǎng)調(diào)控過(guò)程中的重要作用。

1 微生物與營(yíng)養(yǎng)脅迫

在生態(tài)學(xué)上，脅迫（Stress）是指一種顯著偏離于生物適宜生活需求的環(huán)境條件。然而，在微生物的營(yíng)養(yǎng)脅迫相關(guān)研究中，針對(duì)其營(yíng)養(yǎng)脅迫的定義及條件設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一，因此可認(rèn)為微生物的營(yíng)養(yǎng)脅迫即不能滿足微生物生存需求的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境條件。

從營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)的角度來(lái)看，營(yíng)養(yǎng)脅迫可以是缺少某類或多類微生物生存所需的營(yíng)養(yǎng)組分的條件，通常也被稱為饑餓（Starvation）條件。例如，有研究將大腸桿菌懸浮在磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中引發(fā)饑餓適應(yīng)進(jìn)而探索大腸桿菌的存活[9]，也有研究將鼠傷寒沙門氏菌懸浮在滅菌后的海水中引發(fā)饑餓進(jìn)而探索鼠傷寒沙門氏菌膜脂肪酸的變化[10]。PBS 和滅菌后的海水雖不能給細(xì)胞提供充足營(yíng)養(yǎng)，但可維持滲透壓平衡（即穩(wěn)定環(huán)境pH 值）并引發(fā)微生物饑餓適應(yīng)。此外，部分研究還重點(diǎn)關(guān)注了碳氮營(yíng)養(yǎng)組分缺失情況下微生物的生存[11-12]。饑餓條件會(huì)引發(fā)微生物饑餓生存反應(yīng)（Starvation survival response，SSR）[13]。SSR 是微生物對(duì)生長(zhǎng)和存活所需營(yíng)養(yǎng)不足時(shí)產(chǎn)生的生理適應(yīng)，這種生理適應(yīng)表現(xiàn)在蛋白質(zhì)和細(xì)胞壁的生物合成以及攝取死亡細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。需要說(shuō)明的是SSR 是在葡萄糖或多種營(yíng)養(yǎng)物的缺乏下誘導(dǎo)的，而不是在氨基酸的限制下[14]。SSR 提供了微生物饑餓環(huán)境下存活的機(jī)制，等到環(huán)境條件變得適宜后繼續(xù)正常生長(zhǎng)。

從營(yíng)養(yǎng)量的角度來(lái)看，營(yíng)養(yǎng)脅迫可以是營(yíng)養(yǎng)組分種類齊全，而某類營(yíng)養(yǎng)組分或多類營(yíng)養(yǎng)組分的數(shù)量不能滿足生長(zhǎng)需要的條件，營(yíng)養(yǎng)素通常以一種低濃度的形式存在。目前相關(guān)研究對(duì)此類營(yíng)養(yǎng)脅迫環(huán)境多用稀釋的培養(yǎng)基進(jìn)行模擬，是一種寡營(yíng)養(yǎng)（Oligotrophication）狀態(tài)[15-17]。值得注意的是，大部分研究對(duì)所設(shè)置稀釋倍數(shù)的依據(jù)缺乏詳細(xì)說(shuō)明，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果可能無(wú)法應(yīng)用于食品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中。

表1 單增李斯特菌營(yíng)養(yǎng)脅迫相關(guān)條件設(shè)置Table 1 Condition setting related to nutrient stress of Listeria monocytogenes

此外，真實(shí)食品基質(zhì)也會(huì)對(duì)微生物造成營(yíng)養(yǎng)脅迫，食品微環(huán)境可能同時(shí)存在營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)缺失和營(yíng)養(yǎng)量的不足。例如，Casadei 等[21]的研究表明，黃油中基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限和這種食物的物理結(jié)構(gòu)可能會(huì)導(dǎo)致單增李斯特菌處于饑餓狀態(tài)。未來(lái)研究可針對(duì)真實(shí)食品基質(zhì)，探討食品基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)對(duì)單增李斯特菌的生長(zhǎng)、失活等特性產(chǎn)生的影響。

由此可見(jiàn)，營(yíng)養(yǎng)脅迫這一概念包含的處理十分廣泛，稀釋的培養(yǎng)基、某一組分缺失的培養(yǎng)基、真實(shí)食品基質(zhì)、接觸表面食物殘存、自然環(huán)境都可以納入其中，然而每一種處理的營(yíng)養(yǎng)脅迫程度是不同的。單增李斯特菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中需要不斷地吸收各種營(yíng)養(yǎng)素，并將這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于合成細(xì)胞物質(zhì)以及為細(xì)胞的各種生命活動(dòng)提供能量。然而，在實(shí)際的食品供應(yīng)鏈環(huán)節(jié)中，環(huán)境不能總是給予單增李斯特菌的充足的營(yíng)養(yǎng)，單增李斯特菌在接觸面上的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源可能依賴于食物殘留，真實(shí)食品基質(zhì)中的單增李斯特菌依賴于食品成分，上述情況都不是最適宜單增李斯特菌生長(zhǎng)的養(yǎng)分條件，迫使單增李斯特菌處于營(yíng)養(yǎng)脅迫中。

2 營(yíng)養(yǎng)脅迫下單增李斯特菌的表型特征

營(yíng)養(yǎng)脅迫下的單增李斯特菌與純培養(yǎng)狀態(tài)的單增李斯特菌會(huì)有生理表型和菌體狀態(tài)的差異。單增李斯特菌能夠在完全營(yíng)養(yǎng)缺乏的情況下存活4 周，饑餓細(xì)胞可能會(huì)進(jìn)入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)（Viable but nonculturable，VBNC）。本部分將從營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)生物膜形成能力、抗性和毒性3 方面的影響，說(shuō)明單增李斯特菌在營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下的表型特征。

2.1 生物膜形成能力

在食品加工環(huán)境中，細(xì)菌通常黏附在表面并形成生物膜，保護(hù)自己免受外部不利影響，從而造成了其在環(huán)境中的持久污染[22-24]。單增李斯特菌通常以生物膜態(tài)從食品工廠中分離出來(lái)[25]，可見(jiàn)食品鏈環(huán)境與單增李斯特菌生物膜的形成密切相關(guān)。其中，營(yíng)養(yǎng)脅迫可能是促進(jìn)其生物膜形成重要原因之一[22]。Kadam 等[26]研究了單增李斯特菌在腦心浸出液（BHI）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）、基礎(chǔ)培養(yǎng)基（HTM）中生物膜形成情況，指出生物膜在營(yíng)養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)基中比在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中形成能力強(qiáng)，寡營(yíng)養(yǎng)條件促進(jìn)了單增李斯特菌生物膜的形成。然而，Choi 等[27]的研究發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌在TSB 形成的生物膜水平高于十倍稀釋的TSB，這可能是由于菌株特性的差異，較大的稀釋倍數(shù)導(dǎo)致形成生物膜的營(yíng)養(yǎng)素過(guò)于匱乏從而形成較低水平的生物膜。目前，到底多少程度的營(yíng)養(yǎng)脅迫條件促進(jìn)生物膜的形成還沒(méi)有定論。Cherifi 等[20]研究了動(dòng)態(tài)條件下不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)培養(yǎng)基中生物膜的生物量和結(jié)構(gòu)情況，發(fā)現(xiàn)在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（BHI）和寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（1/10 BHI）中生長(zhǎng)的生物膜在結(jié)構(gòu)和生物量上顯著差異。BHI中，生物膜結(jié)構(gòu)為多層排列而成；1/10 BHI 中，生物膜呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，膜中細(xì)胞呈長(zhǎng)鏈狀，且1/10 BHI的生物膜中生物量明顯高于BHI，同時(shí)研究還表明有限的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞死亡和釋放細(xì)胞外DNA 對(duì)穩(wěn)定單增李斯特菌生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起重要作用。營(yíng)養(yǎng)脅迫環(huán)境下，生物膜采用鏈狀排列形態(tài)而不是多層排列形態(tài)，增加比表面積，增強(qiáng)細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)的能力。Liu 等[28]的研究表明PBS 稀釋的豬肉汁促進(jìn)了單增李斯特菌生物膜的形成。

需要說(shuō)明的是，上述標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基和豬肉汁營(yíng)養(yǎng)成分仍較為復(fù)雜，雖然尚不能確定是糖類、脂肪、脂肪酸還是礦物質(zhì)對(duì)單增李斯特菌生物膜的形成產(chǎn)生了促進(jìn)作用，但仍可認(rèn)為在該營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下，生物膜的形成延長(zhǎng)了單增李斯特菌種群的存活時(shí)間。同時(shí)，單增李斯特菌在食品接觸表面形成生物膜后，難以通過(guò)一般清洗方法進(jìn)行徹底，對(duì)于清洗較為困難的設(shè)備，如切片機(jī)和制冷機(jī)等，更是為單增李斯特菌提供了庇護(hù)，成為交叉污染的潛在源頭和媒介，進(jìn)而導(dǎo)致了食用風(fēng)險(xiǎn)上升。

2.2 抗性

食品加工過(guò)程中單增李斯特菌很少面臨單一壓力，通常是多種壓力的共同作用，單增李斯特菌采取不同的生存機(jī)制應(yīng)對(duì)不同的壓力，在這些機(jī)制中又有交叉的部分。例如，單增李斯特菌面臨冷脅迫時(shí)冷休克蛋白表達(dá)上調(diào)，然而滲透脅迫中也會(huì)激發(fā)冷休克蛋白的表達(dá)。冷休克蛋白影響單增李斯特菌的脫水耐受性、生物膜形成和運(yùn)動(dòng)性，這說(shuō)明不同的機(jī)制之間會(huì)相互作用存在交叉保護(hù)。有研究表明在食物基質(zhì)中生長(zhǎng)的單增李斯特菌對(duì)60 ℃處理?xiàng)l件的抗性是生長(zhǎng)在TSB 肉湯中相同菌株的4 倍[7]。Lungu 等[29]研究發(fā)現(xiàn)處于營(yíng)養(yǎng)脅迫中的單增李斯特菌抵抗食品加工過(guò)程中衛(wèi)生措施的能力會(huì)增強(qiáng)，與野生型菌株相比，sigB基因缺失（△-sigB）菌株在PBS 中抵抗丙酸鈉和乳酸鈉的能力高于野生型菌株，激發(fā)了SSR 單增李斯特菌對(duì)化學(xué)脅迫的較高抗性。Lou 等[30]研究了適應(yīng)環(huán)境脅迫后單增李斯特菌的熱抗性，發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)脅迫后的細(xì)胞熱抗性增強(qiáng)，饑餓后存活下來(lái)的細(xì)胞耐熱性比未經(jīng)饑餓處理的細(xì)胞顯著提高，且饑餓時(shí)間越長(zhǎng)，耐熱性增加越大。饑餓狀態(tài)下單增李斯特菌在56 ℃條件下的D值高達(dá)13.6 min。有學(xué)者研究表明饑餓8 d 后的單增李斯特菌對(duì)輻射的抵抗力增強(qiáng)[31]。Li 等[18]研究了啤酒花β 酸對(duì)火腿提取物中非應(yīng)激和應(yīng)激適應(yīng)單增李斯特菌的抑制情況，將無(wú)應(yīng)激、酸應(yīng)激、冷應(yīng)激和饑餓應(yīng)激后的單增李斯特菌接種至火腿提取物中，定期監(jiān)測(cè)儲(chǔ)存期間（7.2 ℃，26 d）細(xì)菌的存活和生長(zhǎng)，與非應(yīng)激細(xì)胞相比，饑餓應(yīng)激后的細(xì)胞在添加啤酒花β 酸的火腿提取物中生長(zhǎng)速率更快、遲滯期更短，說(shuō)明饑餓應(yīng)激后的單增李斯特菌對(duì)啤酒花β 酸這種防腐劑的抗性增強(qiáng)。以上研究均表明營(yíng)養(yǎng)脅迫條件可能誘發(fā)單增李斯特菌交叉抗性的產(chǎn)生。

2.3 毒性

單增李斯特菌的致病機(jī)理與幾個(gè)毒力因子的表達(dá)有關(guān)。其中包括InlA 蛋白和LLO 溶菌素，InlA 蛋白由inlA編碼，負(fù)責(zé)黏附和入侵宿主腸道細(xì)胞，LLO 溶菌素由hly編碼，與單增李斯特菌從真核細(xì)胞的內(nèi)化液泡中逃逸有關(guān)[32]。除此之外還有prfA、plcA、plcB、hly、act A、mpl、inl A、inl B、inl C、inl C2、inl D、inl E、inl F、inl G、inl H等毒力因子。Araujo 等[33]初步研究了營(yíng)養(yǎng)脅迫下單增李斯特菌的毒力變化，發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)脅迫下毒力是降低的。值得注意的是，此研究在低溫下進(jìn)行，低溫下細(xì)胞活性降低，營(yíng)養(yǎng)攝入減緩，因此可能是低溫導(dǎo)致了營(yíng)養(yǎng)脅迫下的單增李斯特菌較好的存活。營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激可能對(duì)降低細(xì)菌的毒力具有作用。然而，目前對(duì)營(yíng)養(yǎng)脅迫下毒力的關(guān)注較少，有必要研究營(yíng)養(yǎng)脅迫應(yīng)激下毒力的變化。

3 營(yíng)養(yǎng)脅迫下單增李斯特菌的應(yīng)答調(diào)控機(jī)制

細(xì)菌適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)脅迫環(huán)境既取決于營(yíng)養(yǎng)豐富時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)的速度，也取決于逆境時(shí)細(xì)胞的存活情況[34]。逆境時(shí)細(xì)胞存活情況取決于該脅迫下采用的調(diào)控機(jī)制，基因表達(dá)是調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵，而后續(xù)的調(diào)控通路因脅迫條件的不同而有所區(qū)別。本部分總結(jié)了營(yíng)養(yǎng)脅迫下不同物質(zhì)介導(dǎo)的調(diào)控，分別是σB介導(dǎo)的調(diào)控、（p）ppGpp 調(diào)控和sRNA 介導(dǎo)的調(diào)控，旨在深入了解營(yíng)養(yǎng)脅迫下的單增李斯特菌可能采取的應(yīng)答調(diào)控機(jī)制。

3.1 σB 介導(dǎo)的調(diào)控

σ 因子是原核生物RNA 聚合酶的亞單位，參與識(shí)別啟動(dòng)子特定的DNA 序列。單增李斯特菌包含5 個(gè)σ 因子，分別是σA、σB、σC、σH、σL，目前研究較多的是由sigB編碼而成的σB。σB與單增李斯特菌的應(yīng)激反應(yīng)和毒性密切相關(guān)[35]。σB參與較為廣泛的應(yīng)激反應(yīng)，包括酸應(yīng)激、滲透應(yīng)激、熱應(yīng)激以及營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激，引發(fā)一般壓力反應(yīng)（General stress response，GSR），促進(jìn)單增李斯特菌在壓力環(huán)境下的適應(yīng)。σB會(huì)導(dǎo)致大約300 個(gè)基因在單增李斯特菌的表達(dá)中上調(diào)[36]。此外，σB依賴基因還參與能量代謝、碳和核苷酸代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等過(guò)程。σB參與碳源代謝，尤其是1，2-丙二醇，1，2-丙二醇是致病菌感染宿主期間重要碳源之一[37]。由于σB可以應(yīng)對(duì)廣泛的壓力環(huán)境，進(jìn)而引發(fā)單增李斯特菌的交叉保護(hù)[38]。

營(yíng)養(yǎng)條件會(huì)影響sigB的激活情況。有學(xué)者研究了不同碳源下（葡萄糖、甘油、乳糖）sigB的激活情況，單增李斯特菌的sigB在添加乳糖的營(yíng)養(yǎng)肉湯中顯示較高的表達(dá)水平，且其中的細(xì)胞對(duì)熱脅迫和酸脅迫具有較高的抗性和較高的生物膜形成量[39]。Marinho 等[40]研究了單增李斯特菌在營(yíng)養(yǎng)缺乏的土壤中存活情況，發(fā)現(xiàn)sigB缺失株與野生型的生長(zhǎng)無(wú)明顯差異，sigB和AgrA同時(shí)缺失株與野生型有顯著差異，這表明sigB和AgrA對(duì)單增李斯特菌在土壤中的存活有協(xié)同作用。AgrC/AgrA雙組分系統(tǒng)感知環(huán)境脅迫壓力，AgrA調(diào)節(jié)氨基酸運(yùn)輸和代謝的基因、運(yùn)動(dòng)和趨化性的基因，Agr調(diào)控子和σB因子相互聯(lián)系進(jìn)而影響非生物脅迫條件下的單增李斯特菌[41]。Ferreira 等[42]研究了△-sigB菌株和10403S野生型菌株在營(yíng)養(yǎng)脅迫下的生存能力，發(fā)現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)脅迫下△-sigB菌株更易喪失生存能力，表明σB在單增李斯特菌營(yíng)養(yǎng)脅迫期間的存活能力方面發(fā)揮了作用。

3.2 （p）ppGpp 介導(dǎo)的調(diào)控

四磷酸鳥苷（ppGpp）和五磷酸鳥苷（pppGpp），統(tǒng)稱為（p）ppGpp 類物質(zhì)。（p）ppGpp 作為信號(hào)分子可促進(jìn)細(xì)菌的適應(yīng)和應(yīng)激能力，通常又其介導(dǎo)的反應(yīng)稱為嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)（Stringent response，SR）。參與（p）ppGpp 代謝的酶主要是有兩種：即只具有合成功能的單功能酶RelA 和既具有合成功能又具有分解功能的雙功能酶SpoT[43]。值得注意的是，單增李斯特菌的CbpB控制著（p）ppGpp 和c-di-AMP 的平衡[44]。（p）ppGpp 調(diào)節(jié)多個(gè)生理方面，如細(xì)菌的毒性、生物膜形成和群體感應(yīng)，RelA 感知氨基酸餓，SpoT 感知其它環(huán)境應(yīng)激源，如碳、鐵、磷酸、脂肪酸饑餓[45]。（p）ppGpp 感知營(yíng)養(yǎng)脅迫特別是氨基酸饑餓的情況，控制基因的表達(dá)程度，控制生長(zhǎng)，當(dāng)壓力改變后，又能恢復(fù)原本的生長(zhǎng)潛力[46]。此外，在營(yíng)養(yǎng)脅迫的條件下，（p）ppGpp 通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯水平和細(xì)胞周期，改變細(xì)胞的新陳代謝和生理狀態(tài)，增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性[47]，高濃度的（p）ppGpp 雖會(huì)增加抗生素耐藥性，但是其引起耐藥性機(jī)制尚不清楚，可能是（p）ppGpp 抑制磷脂的生物合成。（p）ppGpp 生成過(guò)程中GTP 的急劇下降和ATP 的增加影響了CodY的活性，CodY是一種廣泛存在于厚壁菌門的營(yíng)養(yǎng)感應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，（p）ppGpp 和CodY 之間存在反比關(guān)系[48]。然而，目前在營(yíng)養(yǎng)脅迫下（p）ppGpp介導(dǎo)的調(diào)控通路仍有待明確。

在致病菌中，（p）ppGpp 含量隨細(xì)胞狀態(tài)變化而變化，而其含量的高低直接影響細(xì)菌的環(huán)境適應(yīng)性。例如，含有較高（p）ppGpp 水平的大腸桿菌對(duì)環(huán)境脅迫的抵抗力更強(qiáng)，因?yàn)椋╬）ppGpp 刺激了RpoS或其脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)[49]。（p）ppGpp 含量的差異可能導(dǎo)致了菌株特性的差異。（p）ppGpp 在單增李斯特菌中（p）ppGpp 影響生物膜的形成，△-RelA菌株不能在氨基酸饑餓時(shí)積累（p）ppGpp，而野生型菌株在脅迫誘導(dǎo)30 min 內(nèi)積累（p_ppGpp；且△-RelA菌株生長(zhǎng)能力、黏附能力以及毒力都低于野生株[50]。（p）ppGpp 促進(jìn)單增李斯特菌在低溫下適應(yīng)的作用是與氨基酸饑餓相聯(lián)系的[51]，低溫下細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生變化，導(dǎo)致對(duì)氨基酸或其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收減少，誘導(dǎo)嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)。

（p）ppGpp 作用機(jī)制的研究主要集中在大腸桿菌和豬鏈球菌中，單增李斯特菌研究相對(duì)較少。然而，（p）ppGpp 在調(diào)控單增李斯特菌代謝方面有著不可忽視的作用，進(jìn)而影響單增李斯特菌的環(huán)境適應(yīng)能力和致病能力。

3.3 sRNA 介導(dǎo)的調(diào)控

圖1 營(yíng)養(yǎng)脅迫下單增李斯特菌（p）ppGpp 的生成和主要作用Fig.1 Production and main role of（p）ppGpp in Listeria monocytogenes under nutrient stress

小的非編碼RNA（sRNAs）是具有50～200 個(gè)堿基對(duì)的短鏈核糖核酸，sRNAs 可能通過(guò)多種機(jī)制起作用，大多數(shù)已被證明在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)與靶基因的堿基配對(duì)起作用，對(duì)翻譯或基因穩(wěn)定性有積極或消極的影響，從而調(diào)節(jié)多種生理活動(dòng)[52]。為了應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的應(yīng)激環(huán)境，細(xì)菌通過(guò)調(diào)節(jié)吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)sRNAs 對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖、生物膜形成、應(yīng)激耐受、營(yíng)養(yǎng)代謝吸收起著重要作用[53]。新月柄桿菌能營(yíng)養(yǎng)貧瘠的環(huán)境中生存，當(dāng)經(jīng)歷碳饑餓后，新月柄桿菌大量合成sRNA-CrfA，并誘導(dǎo)了27 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，這些靶基因中有三分之一編碼TonB依賴性受體，表明sRNA-CrfA與新月柄桿菌碳源脅迫調(diào)控相關(guān)，sRNA-CrfA能激活碳源吸收相關(guān)基因的表達(dá)[54]。Jonas 等[55]表明sRNA-CsrB和sRNACsrC的水平是響應(yīng)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)可用性的結(jié)果，在營(yíng)養(yǎng)不足的基本培養(yǎng)基中，sRNA-CsrB和sRNA-CsrC水平較高，而在復(fù)合LB 培養(yǎng)基中，sRNA-CsrB和sRNA-CsrB表達(dá)較低。

迄今為止，單增李斯特菌被鑒定出的sRNA已有200 多種。單增李斯特菌暴露于壓力環(huán)境時(shí)，會(huì)產(chǎn)生數(shù)百個(gè)sRNA[3]。sRNA-gcvB可抑制寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Opp）和二肽轉(zhuǎn)移蛋白（Dpp）的生成[56]，推測(cè)在氨基酸缺乏的培養(yǎng)基gcvB的表達(dá)或許受到抑制，以促進(jìn)胞外氮源向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移。最近有研究[57]利用計(jì)算機(jī)和試驗(yàn)相結(jié)合的方法揭示了sRNA-Rli47在單增李斯特菌營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激中的生理作用。sRNA-Rli47與ilvA-mRNA 核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，抑制異亮氨酸的生成中，在氨基酸缺失的培養(yǎng)基中，△-Rli47觀察到了更短的滯后期，說(shuō)明sRNA-Rli47在單增李斯特菌氨基酸代謝方面起作用，進(jìn)一步抑制生長(zhǎng)、促進(jìn)存活。sRNA-LhrC控制靶基因lmo 2349的表達(dá)，lmo 2349編碼氨基酸ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物結(jié)合蛋白和寡肽結(jié)合蛋白的oppA，影響毒力[58]。研究調(diào)查了單增李斯特菌sRNA-LhrC和sRNA-LisRK對(duì)土壤環(huán)境中生長(zhǎng)和存活的作用，與野生型菌株相比，缺乏lisR、lisK或LhrC在無(wú)菌和非無(wú)菌土壤中應(yīng)對(duì)惡劣條件的能力較低，同時(shí)單增李斯特菌存在于無(wú)菌土壤中時(shí)sRNA-LisRK和sRNA-LhrC影響基因表達(dá)[3]。

目前關(guān)于單增李斯特菌sRNAs 應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)脅迫的功能主要集中在營(yíng)養(yǎng)不充分的土壤中，未來(lái)的研究應(yīng)該集中在探索單增李斯特菌在食品生產(chǎn)和食品儲(chǔ)存過(guò)程中sRNAs 功能分析，以充分理解sRNA 介導(dǎo)的調(diào)控對(duì)單增李斯特菌引發(fā)食品暴發(fā)事件。

3.4 其它可能的調(diào)控

eut、pdu和cob/cbi操縱子參與乙醇胺（EA）和丙二醇（PD）的代謝，三者組成一個(gè)大的基因座，統(tǒng)稱為鈷胺素依賴基因簇（CDGC），CDGC 在單增李斯特菌中是保守的，一些研究表明當(dāng)單增李斯特菌暴露于食品及食品加工環(huán)境相關(guān)的壓力時(shí)CDGC 會(huì)發(fā)揮作用，然而CDGC 在應(yīng)激方面的功能表征遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于毒力方面。Tang 等[59]發(fā)現(xiàn)，與富培養(yǎng)基中生長(zhǎng)相比，低溫真空包裝鮭魚上生長(zhǎng)的單增李斯特菌CDGC 表達(dá)增強(qiáng)。σ 因子，雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，sRNA 如sRNA-Rli39參與調(diào)節(jié)CDGC，上述中說(shuō)明σ 因子和sRNA 參與營(yíng)養(yǎng)脅迫下的調(diào)控，然而CDGC 調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，更詳細(xì)的調(diào)節(jié)功能及過(guò)程需要更深入的研究[60]。

4 結(jié)論與展望

營(yíng)養(yǎng)脅迫是重要壓力因子，然而目前單增李斯特菌的環(huán)境脅迫方面中營(yíng)養(yǎng)脅迫關(guān)注較少。營(yíng)養(yǎng)脅迫影響致病菌的定殖、存活、生長(zhǎng)、抗性等，進(jìn)而影響了致病菌的環(huán)境適應(yīng)性和毒力，且營(yíng)養(yǎng)脅迫存在于食品供應(yīng)鏈的各個(gè)環(huán)節(jié)。目前單增李斯特菌在營(yíng)養(yǎng)脅迫期間的調(diào)控機(jī)制的研究多集中于單基因的研究，第二信使（p）ppGpp 的研究相對(duì)較少。研究營(yíng)養(yǎng)脅迫下單增李斯特菌的生理表型和調(diào)控機(jī)制對(duì)食源性疾病的防控具有重要意義，未來(lái)研究可從以下3 個(gè)方面展開(kāi)：

1）營(yíng)養(yǎng)脅迫下的表型研究 首先是營(yíng)養(yǎng)脅迫下單增李斯特菌采取了怎樣的應(yīng)激表型去適應(yīng)環(huán)境；其次是考慮到真實(shí)食品加工很少存在只有一種脅迫的場(chǎng)景，進(jìn)一步研究多種脅迫因素下單增李斯特菌的應(yīng)答反應(yīng)，有助于建立更為有效的防控措施。例如，冰箱冷藏環(huán)境同時(shí)存在冷脅迫和營(yíng)養(yǎng)脅迫，雙重脅迫下單增李斯特菌是否具有更強(qiáng)的環(huán)境耐受能力；

2）營(yíng)養(yǎng)脅迫下的調(diào)控機(jī)制研究 目前已報(bào)導(dǎo)的幾種調(diào)控因子在單增李斯特菌應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)脅迫中發(fā)揮著重要作用，但具體作用靶標(biāo)還不完全明確，后續(xù)可結(jié)合組學(xué)、凝膠遷移、DNA 足跡等技術(shù)挖掘調(diào)控因子作用的靶標(biāo)，有助于了解單增李斯特菌在營(yíng)養(yǎng)脅迫下的生存機(jī)制，為單增李斯特菌的精準(zhǔn)防控提供關(guān)鍵基因；

3）營(yíng)養(yǎng)脅迫下的交叉保護(hù)研究 交叉保護(hù)對(duì)致病菌的抗性和致病性有著不可忽視的作用，營(yíng)養(yǎng)脅迫下會(huì)誘發(fā)交叉保護(hù)，交叉保護(hù)響應(yīng)了不同的壓力下的應(yīng)答機(jī)制，應(yīng)弄清楚這些機(jī)制之間的相互作用關(guān)系。