張俊桃，趙艷梅，孫天松*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室 內(nèi)蒙古乳品生物技術與工程重點實驗室 呼和浩特 010018 2 中國科學院生物物理研究所 中國科學院生物大分子研究中心 RNA 生物學重點實驗室 北京 100101）

衰老是一種具有時間依賴性的生物復雜過程。衰老的標志是組織、細胞以及器官的功能衰退和死亡風險的增加，是機體隨年齡增加發(fā)生的退行性變化，主要受飲食、環(huán)境和遺傳因素等影響[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、心血管疾病乃至癌癥等疾病的發(fā)生率和死亡率均同患者的年齡呈正相關[2]。

益生菌（Probiotics）最早源自希臘語“for life”，意為“對生命有益”[3]。Metchnikoff[4]提出“益生菌”一詞，并推測保加利亞人的長壽可能與其攝入乳桿菌發(fā)酵乳制品密切相關。隨著時間的推移，益生菌有了較明確的定義：活的微生物，當攝入足夠數(shù)量時，對宿主健康產(chǎn)生有益作用[5]。目前發(fā)現(xiàn)的益生菌促進健康作用，包括改善腸道微生態(tài)平衡[6-7]，抵抗有害菌[8-9]，免疫調(diào)節(jié)[10]和延緩宿主衰老[11-12]等。

秀麗隱桿線蟲（簡稱線蟲）是一種體長約為1 mm 的無脊椎蠕蟲，實驗室培養(yǎng)多以大腸桿菌（Escherichia coliOP50）為食。由于其存活周期短（2～3 周），遺傳篩選可獲得大量純合突變體和易于培養(yǎng)且不存在倫理問題等特點，成為生物學研究的理想模型[13]。

1 益生菌延緩線蟲衰老的研究現(xiàn)狀

不同細菌攝食可能誘導特定的宿主反應，進而在宿主壽命調(diào)控中發(fā)揮重要作用[11]。一些致病菌會縮短線蟲的存活時間[14]，而益生菌會延長線蟲壽命并延緩其衰老[15]。這些效應與線蟲的宿主防御能力和抵抗外界環(huán)境壓力密切相關[16]。表1中總結了以線蟲為模式生物進行的益生菌延緩宿主衰老的信號通路研究，如營養(yǎng)感知信號通路、p38 MAPK 信號通路、線粒體信號通路和應激反應，為探討益生菌延緩宿主衰老的作用機理提供理論參考。

表1 益生菌延長線蟲壽命的分子機制Table 1 Molecular mechanisms of probiotics on the longevity of C.elegans

2 益生菌延長線蟲壽命的分子機制

2.1 益生菌與營養(yǎng)感知信號通路的調(diào)控研究

線蟲作為生物個體，其衰老受飲食、環(huán)境和遺傳因素等影響，并且也會受生理狀況的影響，包括生長和發(fā)育。補充益生菌對宿主有多種有益作用，可以保護宿主免受有害菌或病毒的侵害，增強免疫力，進而促進宿主健康。如圖1所示，益生菌作為膳食補充劑，通過一系列信號分子，最終激活或調(diào)節(jié)特定靶基因的轉錄，進而調(diào)控線蟲壽命。

圖1 益生菌影響營養(yǎng)感知信號通路示意圖Fig.1 Schematic diagram of probiotic influencing nutrient sensing signaling pathways

2.1.1 益生菌作用于胰島素信號通路 胰島素（IIS）信號通路包含多種進化保守的衰老調(diào)節(jié)途徑，是目前研究最為完整的應激反應和營養(yǎng)感知通路之一。

IIS 根據(jù)周圍環(huán)境條件傳遞信號[23]。營養(yǎng)充足時，DAF-2 激活AGE-1/PI3K，同時促進磷脂酰肌醇4，5-二磷酸肌醇【PI（4，5）P2】生成磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸肌醇【PI（3，4，5）P3】，激活PDK-1和AKT-1/2[24-25]，且激活的磷酸水解酶DAF-18/PTEN 通過水解PI（3，4，5）P3 生成PI（4，5）P2，進而影響下游信號通路[26]。此外，激活的AKT-1/2 磷酸化轉錄因子DAF-16，使得DAF-16 與14-3-3蛋白結合并停留在細胞質(zhì)中，阻止其進入細胞核發(fā)揮轉錄因子功能[27-28]。反之，饑餓時，類胰島素不足，DAF-2 受體激活受到抑制，AGE-1 激酶活性下調(diào)，使得PI（3，4，5）P3/PI（4，5）P2 比例隨之下降，同時抑制PDK-1 和AKT-1/2 活性，此時DAF-16 進入細胞核發(fā)揮其轉錄因子功能，進而延緩宿主衰老。Grompone 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳酪桿菌CNCM I-3690 通過激活DAF-2/DAF-16/SKN-1 信號通路延長線蟲壽命。

DAF-16 是IIS 下游的關鍵轉錄因子[29]，并且DAF-16 可由Jun-N 末端激酶[30]和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK/AAK-2）[31]磷酸化激活。Schifano 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵粘液乳桿菌MBC2 通過激活DAF-16 信號通路延長線蟲壽命。此外，益生菌代謝產(chǎn)物也具有延緩衰老的作用，例如大腸桿菌K-12 BW25113 代謝產(chǎn)物甲基乙二醛（Methylglyoxal）通過調(diào)節(jié)DAF-16 信號通路延長線蟲壽命[22]。

SKN-1 是一種氧化應激脅迫NRF 轉錄因子，與DAF-16 類似，IIS 蛋白激酶磷酸化SKN-1 使其停留在細胞質(zhì)中，參與應激脅迫和解毒相關基因的表達[33]。此外，SKN-1 還可以通過產(chǎn)生蛋白酶體從而促進蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，進而延長宿主壽命[34]。Kato 等[21]研究表明，丁酸梭狀芽孢桿菌MIYAIRI 588 通過調(diào)控IIS 信號通路激活SKN-1/Nrf2 轉錄因子進而延長線蟲壽命。Komura 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，長雙歧桿菌嬰兒亞種ATCC15697 通過調(diào)控IIS 和p38 MAPK 信號通路進而激活SKN-1/Nrf2 轉錄因子延長線蟲壽命。

HSF-1 是另一種作用于IIS 下游的轉錄因子，其降低蛋白毒性和促進長壽的作用與保守的IIS 通路密切相關[35]。此外，HSF-1 與包含熱休克因子（HSEs）的DNA 特定區(qū)域結合[36]，誘導編碼分子伴侶基因hsp-70 和hsp-16，使其過表達進而延長宿主壽命[37-38]。Donato 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌NCIB3610 形成的生物膜通過激活DAF-2/DAF-16/HSF-1 信號通路延長線蟲壽命。

2.1.2 益生菌作用于雷帕霉素靶蛋白信號通路 雷帕霉素靶蛋白（TOR）首次發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母中，隨后在其它物種中檢測到[39]，是一種跨物種的保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，包含TOR 復合物1（TORC1）和TOR 復合物2（TORC2），調(diào)節(jié)合成多個代謝途徑[40-41]。

當雷帕霉素存在時，TORC1 可以抑制TOR 激酶活性，進而調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)、自噬和能量代謝等生理過程[42]。此外，TORC1 調(diào)控壽命的關鍵因子為RSKS-1（核糖體蛋白S6 激酶S6K）和RAGA-1（Ras-related GTPase）[43-44]。Han 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌K-12 BW25113 ΔpsuK通過調(diào)節(jié)TORC1/RAGA-1/RSKS-1 信號通路延長線蟲壽命。

TORC2 亦稱作PDK2，可調(diào)控血清和糖皮質(zhì)激素誘導的蛋白激酶（SGK）的活性[22]，同時有助于激活Akt[45]。Shin 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌K-12 BW25113 代謝產(chǎn)物甲基乙二醛通過調(diào)節(jié)TORC2/SGK-1 信號通路延長線蟲壽命。

2.1.3 益生菌作用于飲食限制信號通路 飲食限制（DR）是指保證營養(yǎng)充足的同時適當減少食物攝入，廣泛應用于酵母、線蟲和果蠅等物種的長壽研究[46]。

對線蟲進行DR 的方式有很多種，不同的DR條件涉及的調(diào)控機制也不一樣，因此表型也有差異[47]。目前，研究較多的DR 主要是進食緩慢的“eat”突變體，eat-2 編碼維持線蟲咽部肌肉功能的配體門控離子通道，其突變后使得咽部蠕動緩慢，進而減少進食[48]。Zhao 等[49]研究發(fā)現(xiàn)，唾液聯(lián)合乳桿菌FDB89 通過DR（eat-2）依賴的方式延長線蟲壽命。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路也是高度保守的營養(yǎng)感知信號通路，在調(diào)節(jié)宿主衰老方面具有重要作用，通常在饑餓時激活[50]，通過增強抗應激能力延長線蟲壽命[51]。其中，aak-2 是哺乳動物AMPK 的α-催化亞基同源物，且在哺乳動物和線蟲中都具有保守性[52]。Lee 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，魏斯氏菌KACC11853 和KACC11845 延長線蟲壽命依賴于飲食限制AMPK（aak-2）信號通路。

Sirtuins 是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴蛋白去乙酰化酶，通常作為潛在抗衰老因子應用于衰老研究[53]。Sirtuins 起源于對酵母、果蠅和線蟲的一系列研究，通過DR 誘導細胞內(nèi)NAD+水平增加，激活Sirtuins，進而延長宿主壽命[54]。Sugawara 等[55]研究發(fā)現(xiàn)，熱滅活的長雙歧桿菌長亞種BR-108 通過激活SIR-2.1 信號通路延長線蟲壽命。

2.2 益生菌通過p38 絲裂原活化蛋白激酶信號通路調(diào)控線蟲壽命

p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是線蟲免疫系統(tǒng)中保守的MAPKs 亞家族信號通路，是通過遺傳篩選鑒定的對銅綠假單胞菌致死較敏感的突變體[56]。在人類中，p38 級聯(lián)反應通常由病原體暴露和炎癥性細胞因子激活[57-58]。在線蟲中，p38 級聯(lián)反應由NSY-1 MAPK 激酶、SEK-1 MAPK 激酶和PMK-1 激活[56]。Nakagawa 等[15]研究表明，格氏乳桿菌SBT2055 通過激活p38 MAPK 信號通路和增強氧化應激SKN-1 能力進而調(diào)控先天免疫應答延長線蟲壽命。此外，Park 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵粘液乳桿菌JDFM216 通過激活PMK-1 信號通路和核激素受體（NHR）家族延長線蟲壽命。

PMK-1 信號通路上游Toll-白細胞介素-1 受體（TIR）結構域效應蛋白TIR-1，其人源同源蛋白SARM 是線蟲中唯一的TIR 結構域效應蛋白[59]，該蛋白在p38 級聯(lián)反應上游發(fā)揮特異功能[60]，且是激活下游PMK-1 信號通路所必需的[61]。Zhao 等[62]研究表明，長雙歧桿菌長亞種BB68 通過激活TIR-1-JNK-1-DAF-16 信號通路延長線蟲壽命。Kim 等[63]研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌NCFM 通過調(diào)控p38 MAPK（TIR-1 和PMK-1）和β-catenin 信號通路（BAR-1），進而激活線蟲防御革蘭氏陽性細菌的關鍵免疫信號通路。

堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉錄因子家族保守的cAMP 反應元件結合蛋白（CREB）/激活轉錄因子（ATF）ATF-7，位于PMK-1 信號通路下游，是哺乳動物ATF2/ATF7/CREB5 的同源基因，參與p38 調(diào)控[64]。Wu 等[65]研究發(fā)現(xiàn)，通過飲食限制（DR）激活p38-ATF-7 信號通路，進而調(diào)控先天免疫應答延長線蟲壽命。

2.3 益生菌作用于線粒體信號通路

隨著細胞和機體的衰老，線粒體呼吸鏈功能隨之減弱，釋放的電子增加，合成的ATP 減少[66]，進而引起線粒體的功能和結構發(fā)生改變[67]。抑制線粒體呼吸鏈功能減弱有助于延緩宿主衰老[68-69]，如電子傳遞鏈（ETC）基因突變可延長線蟲和果蠅壽命[69-70]。

此外，線粒體內(nèi)蛋白的表達情況也與線粒體功能密切相關。若線粒體的轉錄或翻譯過程受損，則會引起一些未折疊或錯誤折疊的蛋白聚集，發(fā)生線粒體未折疊蛋白反應（UPRmt）。UPRmt是線粒體啟動核基因編碼的線粒體熱休克蛋白和蛋白酶等基因的轉錄激活過程的應激反應，有助于維持線粒體穩(wěn)態(tài)，減少線粒體內(nèi)錯誤折疊的蛋白大量聚集[71]。調(diào)控UPRmt的轉錄因子ATFS-1 具有線粒體核定位和靶向序列[72]，當ATFS-1 從線粒體轉位到細胞核時，激活UPRmt[73]。此外，具有延長壽命效應的ETC 突變也可以激活UPRmt[74]。Han 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌K-12 BW25113 代謝產(chǎn)物莢膜異多糖酸（CA）通過調(diào)節(jié)宿主線粒體動態(tài)變化和UPRmt，進而延長線蟲壽命，且純化的CA 聚合物通過ATFS-1 促進線蟲壽命延長。隨后，Shin 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌K-12 BW25113 Δhns通過激活UPRmt進而延長線蟲壽命。

2.4 益生菌作用于壓力應激反應

應激反應是指機體或細胞在其所處環(huán)境發(fā)生改變時抵抗壓力的能力，包括熱應激、氧化應激、蛋白毒性應激和滲透脅迫應激等[47]。隨著機體的衰老其在壓力作用下生存能力逐漸下降[75]，線蟲對熱應激、百草枯、滲透脅迫和致病菌的抵抗能力隨之減弱[75-77]。然而，具有長壽效應的age-1和daf-2突變體其抗氧化應激和熱應激能力明顯增強[16，78]。因此，增強機體抗應激能力可能有助于延緩宿主衰老[79]。Martorell 等[80]研究表明，動物雙歧桿菌乳亞種CECT8145 通過激活IIS 信號通路增強線蟲氧化應激能力進而延緩衰老。此外，Schifano 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵粘液乳桿菌MBC2 不僅可以減緩老年線蟲肌肉功能衰退，并且通過降低線蟲體內(nèi)活性氧（ROS）積累水平及增加GST-4 解毒酶的表達延緩線蟲衰老。Donato 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌NCIB3610 通過增強線蟲耐熱性、滲透壓應激、金屬脅迫和H2O2氧化應激能力延長線蟲壽命。

3 總結與展望

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)益生菌具有促進健康的益處。膳食中補充益生菌廣泛應用于探究延緩宿主衰老，增強機體健康以及減少年齡相關疾病的發(fā)生。目前應用最多的益生菌是乳酸菌和雙歧桿菌，因其普遍存在于人和動物的胃腸道中，常作為益生菌研究的首選菌株。利用線蟲作為模式生物來探究益生菌延緩宿主衰老相比無菌小鼠、無特定病原菌小鼠和果蠅，具有生命周期短、易獲得大量純合突變體，且可以同時研究多種益生菌間的相互作用等特點。

益生菌的益生特性大多通過益生菌具有維持腸道菌群平衡、提高免疫力、減少炎癥、降低膽固醇等方面來表征，因此需要進一步明確益生菌延緩衰老的相關作用機制，進而深入探究益生菌延緩宿主衰老可能作用的信號通路，為益生菌有助于延緩宿主衰老提供理論依據(jù)。此外，明確益生菌中延緩衰老的主要成分尤為重要，針對不同益生菌菌株所具有的不同益生特性，有望開發(fā)復合益生菌產(chǎn)品以增強其促進健康作用。一些研究發(fā)現(xiàn)，益生菌作為膳食補充劑有助于減緩老年人的腸道微生物組成變化，以及免疫功能的下降，從而降低年齡相關疾病的發(fā)生。然而，益生菌對哺乳動物長壽效應的影響還需要進一步的研究。