曾 羲，趙甜甜，劉春生，戚 平，錢振杰，曹霞飛，王 宇*，周慶瓊，汪 寧

（1 廣州市食品檢驗(yàn)所 廣州 511400 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510642 3 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 廣州 510610）

近些年，我國保健食品市場份額逐年攀升，保健食品行業(yè)涉及非法添加的化學(xué)藥物主要有輔助降血壓類、抗疲勞類、減肥類、提高免疫力類和輔助降血脂類[1]。我國的高血壓患者已超2 億，作為社會(huì)常見疾病之一，輔助降血壓類保健食品也倍受消費(fèi)者青睞，其中可能添加的化學(xué)藥物主要涉及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抵制劑（如卡托普利、阿替洛爾）、中樞神經(jīng)和交感神經(jīng)抑制劑（如鹽酸可樂定、利血平）和β-受體阻滯劑（如美托洛爾）等[2]。已報(bào)道且常添加的降壓物質(zhì)包括鹽酸可樂定、阿替洛爾、利血平、卡托普利、硝苯地平、氫氯噻嗪、哌唑嗪等[3-4]。長期服用高劑量添加降壓物質(zhì)的保健食品雖然可以實(shí)現(xiàn)快速降低血壓的功效，但是會(huì)造成血壓劇烈波動(dòng)，對產(chǎn)品強(qiáng)烈依賴，損害肝腎和停藥嚴(yán)重反彈等危害[5]。

保健食品中非法添加降壓物質(zhì)的檢測方法主要有高效液相色譜（HPLC）法[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS）法[7]、液相色譜-四級桿-靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜（HPLC Q-Orbitrap HRMS）法[8]、表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）法[9]等。其中，HPLC 法分離效率高、重復(fù)性好[10]，HPLC-MS 法靈敏度高和強(qiáng)特異性[11]，現(xiàn)階段這兩種方法應(yīng)用廣泛；HPLC Q-Orbitrap HRMS 法可實(shí)現(xiàn)比HPLC-MS 法更高靈敏度的定性、定量檢測；SERS 法操作簡便，對實(shí)驗(yàn)人員的要求不高。上述方法前處理復(fù)雜，檢測過程耗時(shí)長，基質(zhì)效應(yīng)顯著[12]，且需消耗大量的試驗(yàn)耗材和有機(jī)試劑，不適合多批次、大批量保健食品中非法添加降壓物質(zhì)的篩查。

基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）技術(shù)具有靈敏度高，可高效精確判斷分子質(zhì)量，無需對樣品進(jìn)行分離就可直接點(diǎn)靶上機(jī)，樣品和溶劑量消耗少，測定時(shí)間短等優(yōu)勢[13-14]，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域，包括小分子藥物[15]、寡糖[16]、脂質(zhì)[17]、多肽和蛋白質(zhì)[18-19]和聚合物[20]等。MALDI-TOF MS 的軟電離方式能很好地保存小分子的完整性、分辨率高，在小分子分析篩查、鑒定方面存在巨大的潛力與優(yōu)勢[21]。雖然傳統(tǒng)基質(zhì)在質(zhì)譜的低分子質(zhì)量（<500 u）區(qū)域會(huì)產(chǎn)生較多基質(zhì)碎片，但是在部分低分子質(zhì)量區(qū)域并沒有干擾，仍可實(shí)現(xiàn)對部分小分子化合物的檢測。張培等[22]利用傳統(tǒng)基質(zhì)HCCA 和SA 實(shí)現(xiàn)了對孔雀石綠的定性、定量快速分析，樣品分析時(shí)間僅需5 s 即可獲得定量結(jié)果，說明傳統(tǒng)基質(zhì)在小分子化合物的檢測領(lǐng)域還有很大的開發(fā)空間。本研究基于MALDI-TOF MS 法的優(yōu)勢以HCCA 為基質(zhì)，研究鹽酸可樂定、阿替洛爾和利血平等3 種降壓效果明顯、原料價(jià)格低廉的非法添加物的快速篩查方法，旨在填補(bǔ)MALDI-TOF MS 法傳統(tǒng)基質(zhì)在保健食品中小分子非法添加物定性、定量分析上的空白，減少單個(gè)樣品的篩查時(shí)間，用于大批量樣品的篩查和陽性樣品的精準(zhǔn)定量，為保健食品行業(yè)的健康有序發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

21 批保健食品均購于網(wǎng)絡(luò)；甲醇（色譜純級），美國Thermo Fisher Scientific 公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid），德國Bruker 公司；鹽酸可樂定標(biāo)準(zhǔn)品（HCD，批號：100071-201607）、阿替洛爾標(biāo)準(zhǔn)品（ANL，批號：100117-201606）、利血平標(biāo)準(zhǔn)品（RSP，批號：100041-202015），中國食品藥品檢定研究院提供；本試驗(yàn)用水均由Milli-Q 超純水制備系統(tǒng)制得，美國Millipore 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MS205DU 電子天平，上海梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司；ultraflextreme MALDI-TOF MS儀（配有flexAnalysis 3.4 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)）、384 孔ground steel 靶板，德國Bruker 公司；2600TH 超聲清洗儀，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；M3 7610-33CN 渦旋混合儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；Allegra X-30R 高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman 公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，用甲醇振蕩溶解并定容于10 mL 容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18 ℃避光貯存。分別精密量取上述儲備液0.1 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，得到10 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。臨用時(shí)將上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇-水（1 ∶1，體積比）液稀釋至100 ng/mL，分別移取適量100 ng/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成質(zhì)量濃度為10，20，40，60，80 ng/mL 和100 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以同樣方法配制100 ng/mL 鹽酸可樂定（HCD）、阿替洛爾（ANL）、利血平（RSP）單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 基質(zhì)的配制 稱取4.0 mg HCCA 基質(zhì)于離心管中，加入甲醇-水（1 ∶1，體積比），配成質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL 的HCCA 基質(zhì)溶液，超聲溶解10 min。

1.4 樣品前處理

在前期研究[7]基礎(chǔ)上稍作修改，即固體或半固體樣品研細(xì)混均、液體樣品搖勻后，準(zhǔn)確稱取0.2000 g 樣品于10 mL 比色管中，加入甲醇-水（1 ∶1，體積比）溶液定容，超聲提取10 min，固體和半固體樣品經(jīng)8 000 r/min 離心3 min 后取上清液備用，液體樣品可直接上機(jī)測定。加標(biāo)樣品在稱量后分別加入對應(yīng)質(zhì)量濃度（即0.75，2.0 μg/g 和4.0 μg/g）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再進(jìn)行定容提取操作，每個(gè)樣品重復(fù)測定3 次。

1.5 點(diǎn)樣與MALDI-TOF MS 分析條件

1.5.1 點(diǎn)樣方式 基質(zhì)結(jié)晶質(zhì)譜信號不穩(wěn)定、響應(yīng)重復(fù)性差和甜點(diǎn)效應(yīng)是影響MALDI-TOF MS定量分析測定的關(guān)鍵問題，不同基質(zhì)與不同樣品生成的結(jié)晶不同，產(chǎn)生的問題也不盡相同[21]。本試驗(yàn)將100 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣品、以HCCA 為基質(zhì)，考察雙鋪法a、雙鋪法b、混合法和三明治法等4 種不同的點(diǎn)樣方式，解決樣品與HCCA 基質(zhì)混合所得結(jié)晶不均造成質(zhì)譜信號不穩(wěn)定及響應(yīng)重復(fù)性差的問題。

1.5.1.1 雙鋪法a 先移取1 μL 樣品于384 孔ground 靶板上，自然揮干后，再移取1 μL 基質(zhì)覆蓋，自然揮干待測。

1.5.1.2 雙鋪法b 先移取1 μL 基質(zhì)于384 孔ground 靶板上，自然揮干后，再移取1 μL 樣品覆蓋，自然揮干待測。

1.5.1.3 混合法 取2 μL 樣品和2 μL 基質(zhì)混合均勻后，取2 μL 混合物直接于384 孔ground 靶板上點(diǎn)樣，自然揮干待測。

1.5.1.4 三明治法 取0.5 μL 基質(zhì)溶液于384 孔ground 靶板上，自然揮干后，取1 μL 樣品覆蓋基質(zhì)，自然揮干后，再取0.5 μL 基質(zhì)溶液揮干待測。

1.5.2 MALDI-TOF MS 條件 點(diǎn)靶光源：氮?dú)饧す?；離子源：電噴霧電離（ESI）源；波長：337 nm；檢測模式：反射線性正離子模式；采集范圍：160～3 580 u；激光強(qiáng)度為：60%；光譜響應(yīng)強(qiáng)度疊加次數(shù)均為20 次，利用儀器配置的flex Control 軟件對質(zhì)譜圖進(jìn)行質(zhì)量軸的質(zhì)荷比（m/z）進(jìn)行標(biāo)記和默認(rèn)平滑處理，并用flexAnalysis 3.4 軟件分析原始數(shù)據(jù)，根據(jù)疊加所得目標(biāo)物對應(yīng)離子的峰面積換算成對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線中鹽酸可樂定、阿替洛爾和利血平的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究

3 種降壓物質(zhì)的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)效果和質(zhì)譜裂解規(guī)律，均與溶劑空白的HCCA 基質(zhì)進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1所示。

MALDI-TOF MS 對目標(biāo)物離子化形式通常有[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+等3 種[23]，由圖1 可以看出，3 種降壓物質(zhì)質(zhì)譜峰的離子化形式均為[M+H]+，即分別為[HCD+H]+（m/z229.913）、[ANL+H]+（m/z267.099）和[RSP+H]+（m/z609.355），與Manka 等[23]報(bào)道的MALDI-TOF MS 帶電裂解規(guī)律一致。雖然HCCA 空白基質(zhì)在質(zhì)荷比（m/z）160～450 u范圍內(nèi)存在較多碎片，但是其在3 種降壓物質(zhì)對應(yīng)的質(zhì)荷比（m/z）處干擾很小，即HCCA 空白基質(zhì)在對應(yīng)質(zhì)荷比處的信噪比（S/N）小于3，故可忽略基質(zhì)的影響，可利用HCCA 作為3 種降壓物質(zhì)的分析測定基質(zhì)。

圖1 3 種降壓物質(zhì)與對應(yīng)空白基質(zhì)的MADLDI-TOF質(zhì)譜圖Fig.1 MALDI-TOF mass spectrum of 3 kinds of anti-hypertensive substances to corresponding blank matrix

2.2 點(diǎn)樣方式的考察

不同點(diǎn)樣方式對應(yīng)的樣品與基質(zhì)結(jié)晶在質(zhì)譜儀高倍放大鏡下的光學(xué)圖像見圖2，從樣品與基質(zhì)的結(jié)晶來看，混合法最均勻，其次為雙鋪法，最后為三明治法。通過對每個(gè)樣品進(jìn)行反射線性正離子模式采集20 次疊加得到的質(zhì)譜圖來看，混合點(diǎn)樣法隨機(jī)采集的20 次質(zhì)譜信號均較穩(wěn)定、重復(fù)性好且沒有甜點(diǎn)效應(yīng)；雙鋪法疊加得到響應(yīng)強(qiáng)度與混合點(diǎn)樣法相當(dāng)，無甜點(diǎn)效應(yīng)，但質(zhì)譜信號穩(wěn)定性和重復(fù)性劣于混合點(diǎn)樣法，且先點(diǎn)樣品再點(diǎn)基質(zhì)和先點(diǎn)基質(zhì)再點(diǎn)樣品對MALDI-TOF MS 疊加響應(yīng)強(qiáng)度基本無影響；三明治法產(chǎn)生的質(zhì)譜信號雖強(qiáng)于其它2 種方法，但質(zhì)譜信號的穩(wěn)定性和重復(fù)性不佳，且會(huì)出現(xiàn)部分甜點(diǎn)效應(yīng)。因此，綜合考慮試驗(yàn)操作方便快捷、甜點(diǎn)效應(yīng)、質(zhì)譜信號重復(fù)性、穩(wěn)定性和定量分析等因素，選用混合法作為本研究的點(diǎn)樣方式。

圖2 4 種點(diǎn)樣方式形成的HCCA 與樣品共結(jié)晶在質(zhì)譜儀高倍放大鏡下的光學(xué)圖像Fig.2 Images of HCCA and sample crystal formed by 4 kinds of spotting approaches under the high magnification lens in the mass spectrometer

2.3 激光強(qiáng)度的選擇

HCCA 基質(zhì)與100 ng/mL 的3 種降壓物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液形成的結(jié)晶在10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%等9 種激光能量強(qiáng)度的MALDI-TOF-MS 響應(yīng)效果如圖3所示。

從圖3 可以看出，激光能量強(qiáng)度為10%～60%時(shí)，隨著激光能量強(qiáng)度的增加，3 種化合物與HCCA 形成的共結(jié)晶質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度從105增加到106，說明激光能量強(qiáng)度對質(zhì)譜峰信號影響較大；當(dāng)激光強(qiáng)度超過60%時(shí)，HCD 和RSP 的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度增加較慢，ANL 的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度甚至略有降低。一般而言，質(zhì)譜峰疊加強(qiáng)度在105即可認(rèn)為響應(yīng)良好，且過高的激光強(qiáng)度不利于離子源的維護(hù)。因此，選用60%的激光強(qiáng)度作為MALDITOF MS 對3 種降壓物質(zhì)的定性定量研究分析。

圖3 9 種激光能量強(qiáng)度的HCCA 與樣品共結(jié)晶響應(yīng)強(qiáng)度比較（n=3）Fig.3 Comparison of response intensity on HCCA and sample crystal formed by 9 different laser energy intensities（n=3）

2.4 方法學(xué)評價(jià)

2.4.1 篩查限及線性范圍 按1.3 節(jié)中方法配制混合標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3 個(gè)降壓物質(zhì)疊加所得目標(biāo)離子峰面積（y）對應(yīng)的質(zhì)量濃度（x，ng/mL）分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表1。本研究的篩查限[24]（Limit of identification, LOI）為儀器測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的最低質(zhì)量濃度（S/N≥3）對陰性樣品提取液加標(biāo)試驗(yàn)后，驗(yàn)證所得實(shí)際加標(biāo)樣品最低質(zhì)量濃度（S/N≥3），結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，3 種小分子降壓物質(zhì)在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)（r）≥0.99，說明線性良好，能滿足篩查測定要求；3 種樣品中的LOI 范圍為0.005～0.25 μg/g，LOI 值從低到高依次為RSP、HCD、ANL；同種降壓物質(zhì)比較，液體樣品的LOI 值最低，其次為半固體樣品，最高為固體樣品。

表1 3 種降壓物質(zhì)在3 種陰性樣品中線性范圍、相關(guān)系數(shù)和篩查低限Table 1 Linear range, correlation coefficients（r）and limit of identification（LOI）of 3 anti-hypertensive substances on 3 negative samples

2.4.2 加標(biāo)回收試驗(yàn)及精密度 3 種陰性樣品外標(biāo)法定量的回收率結(jié)果見表2。結(jié)果表明，采用傳統(tǒng)基質(zhì)HCCA 作為MALDI-TOF MS 測定3 種降壓物質(zhì)的加標(biāo)回收率67.56%～104.70%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為0.43%～10.51%，說明本試驗(yàn)方法可滿足定量分析測定要求。

表2 3 種降壓物質(zhì)在低、中、高3 個(gè)水平下的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）Table 2 Spiked recoveries and relative standard deviations of 3 anti-hypertensive substances on low,medium and high levers（n=3）

2.5 實(shí)際樣品檢測

應(yīng)用本研究方法檢測21 種市售保健食品，包括口服液、保健酒等液體，片劑、硬膠囊等固體，軟膠囊等半固體，通過對比實(shí)際樣品在對應(yīng)目標(biāo)物質(zhì)荷比的峰響應(yīng)強(qiáng)度，進(jìn)行定性分析篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有1 種樣品添加了鹽酸可樂定，含量為（10.79±0.95）μg/g。

3 結(jié)論

本研究建立了傳統(tǒng)基質(zhì)HCCA 作為基質(zhì)，應(yīng)用MALDI-TOF MS 軟電離分析技術(shù)快速定性、定量檢測保健食品中添加的3 種降壓物質(zhì)的方法，填補(bǔ)了傳統(tǒng)基質(zhì)對小分子化合物分析測定保健食品非法添加藥物的空白。該方法不僅靈敏度高、篩查結(jié)果準(zhǔn)確、精密度好，且抵抗樣品干擾的能力強(qiáng)、無需復(fù)雜前處理、流動(dòng)相和色譜柱，每個(gè)樣品經(jīng)儀器分析僅需0.3 s 即獲得篩查結(jié)果，且靶板可重復(fù)使用，可滿足應(yīng)急抽檢、日常檢驗(yàn)等大批量、多批次保健食品中降壓物質(zhì)的篩查檢測，一次最多可檢測384 個(gè)樣品。

MALDI-TOF MS 在小分子分析測定方面存在巨大優(yōu)勢，可為保健食品非法添加物的風(fēng)險(xiǎn)評估提供快速、準(zhǔn)確和極其高效的篩查方法，然而目前的基質(zhì)難以實(shí)現(xiàn)對所有非法添加物的分析篩查，因此，開發(fā)廣譜性、適用所有小分子分析篩查的基質(zhì)是接下來的重點(diǎn)研究方向。