陳宏宇，陳金華，3，熊立瑰，3，李 勤，3，李 娟，3，李 適，3，江鴻鍵，張慶華，黃建安，3*，劉仲華，3

（1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 長沙 410128 2 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心 長沙 410128 3 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心 長沙 410128 4 云南省臨滄市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 云南臨滄 675800 5 云南省臨滄市云縣地方產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心 云南臨滄 675800）

普洱茶是我國特有名茶之一，歷史悠久，廣受歡迎。根據(jù)加工工藝與品質(zhì)特征，普洱茶分為普洱生茶與普洱熟茶[1]。作為普洱茶原料，云南大葉種曬青茶品質(zhì)與普洱茶品質(zhì)密切相關(guān)。云南大葉種曬青茶以地理保護(hù)范圍內(nèi)的云南大葉種鮮葉為原料，經(jīng)攤放、殺青、揉捻、解塊、日光干燥等工藝制成，其香氣清香濃郁，滋味濃醇回甘[1]。目前，云南大葉種曬青茶品質(zhì)研究主要集中于不同產(chǎn)地品質(zhì)差異及加工工藝對(duì)其的影響等方面。楊雪梅等[2]研究表明不同茶區(qū)曬青茶氨基酸、咖啡堿、兒茶素多樣性指數(shù)和變異系數(shù)均較高，說明云南大葉種茶樹資源存在較大變異。戴宇樵等[3]研究發(fā)現(xiàn)，“云抗10 號(hào)”曬青茶加工過程中，從鮮葉到曬青葉，兒茶素類含量明顯下降，茶氨酸含量則先升后降，總趨勢為上調(diào)，說明加工過程中曬青茶內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生急劇轉(zhuǎn)化。

茶葉鮮葉也是影響云南大葉種曬青茶品質(zhì)的重要因素，其受到環(huán)境條件的影響，如氣候、土壤、生物脅迫等[4-6]。云南大葉種的栽培區(qū)域很廣，主要分布在21°～26°N、97°～105°E、海拔1 000～2 100 m、坡度≤25°的中山山地[1]。研究表明，不同海拔的茶園環(huán)境迥異，海拔每上升100 m，年平均氣溫下降0.65 ℃，降水量增加36.3 mm，相對(duì)濕度增加3.85%，日光照強(qiáng)度曲線呈開口向下的拋物線趨勢[7]。分析海拔對(duì)云南大葉種曬青茶品質(zhì)的影響，對(duì)云南大葉種曬青茶的開發(fā)和利用具有重要意義。本研究以無量山不同海拔的云南大葉種曬青茶為對(duì)象，對(duì)其感官品質(zhì)、主要生化成分、揮發(fā)性成分進(jìn)行比較分析，揭示不同海拔的大葉種曬青茶品質(zhì)成分差異，旨在為普洱茶加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

茶葉樣品原料來自云南省普洱市無量山（23°～24°N，100°～101°E），于2018年4月采摘一芽一葉或二葉，經(jīng)殺青、揉捻、干燥制成曬青茶，具體海拔信息見表1。

表1 不同海拔曬青茶樣品原料信息Table 1 Raw material information of dried green tea samples at different altitudes

1.2 試劑

N，N-二甲基甲酰胺（色譜純級(jí)）、乙腈（色譜純級(jí)）、冰醋酸（色譜純級(jí)）、甲醇（色譜純級(jí)）、甲醇（分析純級(jí)）、碳酸鈉、福林酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、茚三酮、氯化亞錫、三氯化鋁、蒽酮、無水葡萄糖、濃硫酸，上海國藥集團(tuán)試劑有限公司。表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（D，LC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酯（ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、半肱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、癸酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司。

1.3 儀器與設(shè)備

LC-2010AHT 高效液相色譜儀、UV-2250 型紫外分光光度計(jì)、GC/MS-QP 2010 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；DSY-2-8 型水浴鍋，常州國華有限公司；MS204TS/00 型電子分析天平，美國Metttler Toledo 公司；AccQ.TagTM色譜柱，美國Waters 公司；ECOSIL C18色譜柱，中國CNW 公司。

1.4 方法

1.4.1 感官審評(píng)方法參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23776-2018《茶葉感官審評(píng)方法》和GB/T 14487-2017《茶葉感官審評(píng)術(shù)語》，由3 名專業(yè)人員對(duì)樣品進(jìn)行100 分制評(píng)分，并按照加權(quán)法計(jì)算總分（總分=外形×25%+湯色×10%+香氣×25%+滋味×30%+葉底×10%）。

1.4.2 主要生化成分檢測方法 茶多酚參考GB/T 8313-2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》中的方法進(jìn)行測定，水浸出物參考GB/T 8305-2013《茶 水浸出物》中的方法進(jìn)行測定，游離氨基酸總量參考GB/T 8314-2013《茶 游離氨基酸總量》中的方法進(jìn)行測定，可溶性糖總量采用蒽酮比色法進(jìn)行測定[8]。

1.4.3 兒茶素組分、生物堿組分、沒食子酸含量測定方法 采用高效液相色譜法同時(shí)測定6 種兒茶素組分（EC、EGC、D，L-C、EGCG、ECG、GCG）、3 種生物堿組分（咖啡堿、可可堿、茶堿）和沒食子酸。色譜條件：色譜柱為C18（4.6 mm×150 mm），檢測波長278 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，流動(dòng)相A 為超純水，流動(dòng)相B 為N，N-二甲基甲酰胺、甲醇、冰醋酸混合液（VN，N-二甲基甲酰胺∶V甲醇∶V冰醋酸=39.5∶2∶1.5）。洗脫梯度：流動(dòng)相B 初始為9%，10 min 后上升為14%，27 min 后升至36%，保持4 min，隨后于32 min 降至9%，至37 min 時(shí)結(jié)束。

1.4.4 氨基酸組分測定方法 采用高效液相色譜法同時(shí)測定18 種氨基酸組分。色譜條件：色譜柱為Waters ACCQ·TagTM（3.9 mm×150 mm，5 μm），檢測波長248 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫37 ℃，流速1 mL/min，流動(dòng)相A 為10% ACCQ.TagTM液，流動(dòng)相B 為60%乙腈。洗脫梯度：流動(dòng)相B 初始為2%，15 min 時(shí)上升至7%，19 min 時(shí)上升至10%，32 min 時(shí)上升至33%，34 min 時(shí)上升至100%，保持3 min，隨后39 min 時(shí)降至0%結(jié)束。

1.4.5 揮發(fā)性成分測定方法

1.4.5.1 香氣成分的提取 采用同時(shí)蒸餾萃取法（Simultaneous distillation and extraction，SDE）提取揮發(fā)性成分。A 瓶（2 000 mL）中裝茶樣粉末50 g 和蒸餾水1 000 mL，B 瓶（250 mL）中裝入乙醚50 mL。在A 瓶中加入癸酸乙酯（50 μg/mL）1 mL，分別用電熱恒溫套和水浴加熱A、B 瓶，A 瓶保持微沸狀態(tài)，B 瓶50 ℃，蒸餾45 min。收集萃取液，加入無水NaSO4后在冰箱中靜置過夜后過濾，濾液用液氮濃縮1.0 mL，待GC/MS 分析用。

1.4.5.2 氣相色譜條件 采用RTX-5ms 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），升溫程序如下：柱溫50 ℃，保溫4 min；保持2 ℃/min 升溫速率升溫至150 ℃保溫1 min；保持5 ℃/min 升溫速率升溫至180 ℃保溫5 min；保持10 ℃/min 升溫速率升溫至280 ℃保溫30 min。進(jìn)樣口溫度210 ℃，MS接口溫度220 ℃，分流比1∶10 進(jìn)樣。載氣N2，流速0.7 mL/min，MS 檢測。

1.4.5.3 質(zhì)譜條件 電子能量70 eV，電離方式EI，離子源溫度200 ℃進(jìn)樣量2 μL，掃描范圍：35～500 amu，溶劑延滯時(shí)間（Solvent delay）2.8 min。

1.4.5.4 定性與定量分析 用計(jì)算機(jī)譜庫檢索（NST05sLIB）經(jīng)GC-MS 分析獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，與文獻(xiàn)值對(duì)照并結(jié)合質(zhì)譜匹配度來進(jìn)行核對(duì)，參考有關(guān)茶葉芳香物質(zhì)成分的分析結(jié)果進(jìn)行組分比較鑒定再從特征離子、相對(duì)豐度、實(shí)際成分和保留時(shí)間等方面進(jìn)行比較，確定其化學(xué)成分。采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，計(jì)算出各組分的相對(duì)含量（組分峰面積占總峰面積的百分比）。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)分析采用Excel、SPSS 25.0、Simca-p 14.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔云南大葉種曬青茶的感官品質(zhì)分析

感官審評(píng)結(jié)果見表2，外形、湯色、香氣、滋味和葉底評(píng)分均在85～93 之間，說明不同海拔的云南大葉種曬青茶等級(jí)相當(dāng)，具有較好的代表性。不同海拔的云南大葉種曬青茶湯色和滋味差異較大。湯色分析表明，海拔1 800 m 以下試樣（W1～W6）主要表現(xiàn)為淺黃亮，海拔1 800 m 以上試樣（W7～W12）主要表現(xiàn)為黃較亮、黃帶暗和黃尚亮，海拔更高湯色色澤加深而亮度降低。滋味分析表明，W7～W12 主要表現(xiàn)為醇濃，而W1～W6 主要表現(xiàn)為醇濃或醇厚帶澀，尚爽，海拔更高其澀味減輕且鮮爽味增強(qiáng)。

表2 不同海拔曬青毛茶感官審評(píng)結(jié)果Table 2 Sensory evaluation results of sun-dried green tea at different altitudes

2.2 不同海拔云南大葉種曬青茶的主要生化成分分析

本研究共測定了12 個(gè)試樣中水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、可溶性糖、沒食子酸、生物堿、兒茶素組分以及氨基酸組分等34 種主要生化成分含量，其變化規(guī)律如圖1所示。結(jié)果顯示，不同海拔區(qū)間的12 個(gè)試樣主要分為兩類W1～W6 與W7～W12；W1～W6 的水浸出物、可可堿、咖啡堿、可溶性糖、酚氨比、茶多酚、兒茶素總量以及兒茶素組分含量高于W7～W12，而游離氨基酸總量以及氨基酸組分含量（除蛋氨酸）均為W1～W6 低于W7～W12。

圖1 不同海拔曬青毛茶主要生化成分熱圖Fig.1 Heat map of main biochemical components of sun-dried green tea at different altitudes

主成分分析（Principal component analysis，PCA）是利用降維思想對(duì)多個(gè)變量的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的方法[9-10]。采用Simca-p 14.1 軟件對(duì)12 個(gè)試樣的34 種主要生化指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果顯示，PCA 模型共提取2 個(gè)主成分，擬合指數(shù)為R2=0.671，表明2 個(gè)主成分共累計(jì)方差貢獻(xiàn)度67.1%，其中主成分1 與主成分2 分別為46.2%，20.9%。由PCA 得分圖（圖2）可看出，12 個(gè)試樣區(qū)分明顯，W1～W6 分散于主成分1 正軸方向，W7～W12 分散于主成分2 負(fù)軸方向。根據(jù)PCA結(jié)果，可將12 個(gè)試樣以海拔1 800 m 為界分為兩組，W1～W6 為海拔1 400～1 800 m（H1），W7～W12為海拔1 800～2 000 m（H2），這與感官審評(píng)結(jié)果吻合。

圖2 主要生化成分PCA 得分圖Fig.2 PCA scores of main biochemical components

為進(jìn)一步篩選H1 和H2 差異性生化成分，通過OPLS-DA 模型分析發(fā)現(xiàn)，OPLS-DA 模型擬合指數(shù)R2X=0.457，R2Y=0.815，Q2=0.745，表明該模型解釋45.7% X 矩陣與81.5% Y 矩陣，Q2為預(yù)測指數(shù)，說明該模型具有74.5%的預(yù)測能力。如圖3所示，H1 與H2 在Y 矩陣上區(qū)分明顯，進(jìn)一步說明H1 和H2 試樣存在特征性差異物質(zhì)。為證明此模型穩(wěn)定可靠，對(duì)其進(jìn)行置換檢驗(yàn)（圖4），結(jié)果顯示Q2截距小于0，表明該模型不存在過擬合現(xiàn)象。根據(jù)VIP＞1 結(jié)合S-plots，篩選出16 種特征性差異生化指標(biāo)，以VIP 值由大到小排序依次為甘氨酸、氨基酸總量、異亮氨酸、茶氨酸、兒茶素總量、茶多酚總量、酚氨比、賴氨酸、游離氨基酸總量、谷氨酸、水浸出物、ECG、天冬氨酸、苯丙氨酸、沒食子酸、GCG。

圖3 生化成分OPLS-DA 得分圖Fig.3 OPLS-DA score chart of biochemical components

圖4 生化成分OPLS-DA 模型置換檢驗(yàn)圖Fig.4 Permutations test diagram of OPLS-DA model of biochemical components

在PCA 和OPLS-DA 基礎(chǔ)上，對(duì)差異性生化成分進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)（P＜0.05），H1 水浸出物、茶多酚以及兒茶素總量、沒食子酸、酚氨比、GCG、ECG 顯著高于H2，游離氨基酸總量、茶氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸顯著低于H2（圖5）。

圖5 差異性成分分析結(jié)果Fig.5 Analysis results of difference components

2.3 不同海拔云南大葉種曬青茶揮發(fā)性成分分析

12 個(gè)試樣共確定65 種揮發(fā)性物質(zhì)（表3），其中，醇類18 種、醛類9 種、酯類9 種、酸類7 種、碳?xì)漕? 種、酮類12 種、酚類1 種、雜氧類2 種、其它1 種。醇類相對(duì)含量最高（總占比為40.05%～52.02%），其中芳樟醇、順式氧化芳樟醇、反式氧化芳樟醇、脫氫芳樟醇、α-松油醇、香葉醇、橙花醇、葉綠醇、反式橙花叔醇等占比較高。其次是酯類（總占比為5.15%～8.4%），其中乙酸乙酯、水楊酸甲酯、二氫獼猴桃內(nèi)酯等占比較高。除此之外，本研究還測定出壬醛、水芹醛、青葉醛、臧紅花等醛類化合物，月桂酸、油酸等酸類化合物，D-檸檬烯等碳?xì)浠衔?，?紫羅酮、茉莉酮等酮類化合物。

表3 揮發(fā)性成分測定結(jié)果Table 3 Determination results of volatile component

（續(xù)表3）

為探明不同海拔的云南大葉種曬青茶揮發(fā)性成分差異，進(jìn)行PCA 分析表明，PCA 模型擬合指數(shù)R2=0.502。如圖6所示，H1 和H2 有一定區(qū)分。通過OPLS-DA 模型進(jìn)一步分析H1 與H2 特征性差異揮發(fā)性成分表明，擬合指數(shù)R2X=0.431、R2Y=0.957、Q2=0.642（圖7），12 個(gè)試樣在Y 矩陣上得到很好的分離，該模型對(duì)Y 矩陣的解釋達(dá)95.7%，對(duì)該模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Q2截距小于0（圖8），表明不存在過擬合現(xiàn)象，模型穩(wěn)定可靠。根據(jù)VIP＞1 結(jié)合S-plots，篩選出17 種差異性揮發(fā)性成分（表4），包括醇類6 種、醛類3 種、酯類4 種、酮類3 種、酸類1 種，這些物質(zhì)的香氣特征多為花果香。

表4 差異揮發(fā)性物質(zhì)Table 4 Differential volatile substance

圖6 揮發(fā)性成分PCA 得分圖Fig.6 PCA scores of volatile components

圖7 揮發(fā)性成分OPLS-DA 得分圖Fig.7 OPLS-DA score chart of volatile components

圖8 揮發(fā)性成分OPLS-DA 模型置換檢驗(yàn)圖Fig.8 Permutations test diagram of OPLS-DA model of volatile components

3 討論

茶的風(fēng)味品質(zhì)受多種成分綜合影響，其中茶多酚是影響茶湯濃醇度、收斂性的主要物質(zhì)，氨基酸則賦予茶湯鮮爽味，其比值稱為酚氨比，常作為綜合判定茶葉品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)[11-12]。本研究中H2 水浸出物、茶多酚、酚氨比、ECG 等含量顯著低于H1，游離氨基酸、茶氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸等含量顯著高于H1，與感官審評(píng)結(jié)果澀味減輕，鮮爽味增強(qiáng)相符，這與吳道良[13]的研究結(jié)果基本一致。此外，不同海拔的烏龍茶、紅茶、綠茶等研究也報(bào)導(dǎo)了相似的結(jié)果[14-18]。茶氨酸在光照條件下會(huì)分解成乙胺和谷氨酸，用于合成兒茶素[19-23]。兒茶素屬于黃烷醇類化合物，是茶葉中多酚類物質(zhì)的主體成分，適度遮蔭會(huì)減少茶葉中多酚類物質(zhì)含量[24-26]。高海拔地區(qū)降雨量大，云霧繚繞等因素會(huì)減少茶園光照時(shí)間與強(qiáng)度，這可能是H2 茶多酚含量低，茶氨酸含量高的原因之一。沒食子酸是可水解單寧的組成部分，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種生物學(xué)作用，在普洱茶中含量較高[27]。吳雪釵等[28]研究表明沒食子酸在堿性、中性、強(qiáng)氧化條件下不穩(wěn)定，在酸性環(huán)境、強(qiáng)光、高溫條件下穩(wěn)定。隨著海拔升高，無量山土壤呈強(qiáng)酸性，光照減弱，氣溫降低，因此可能是高海拔地區(qū)漫射光效應(yīng)及低溫導(dǎo)致其含量發(fā)生變化[29]。這可能是本研究中H2沒食子酸含量顯著低于H1 的潛在原因之一。

香氣是決定茶葉品質(zhì)的重要因素之一，其形成除與品種、工藝相關(guān)外，與海拔也有一定關(guān)聯(lián)。劉敏等[30]研究表明芳樟醇、香葉醇、葉綠醇、青葉醛、橙花醇等是云南大葉種曬青茶的主要香氣成分，這與本研究結(jié)果一致。孫慕芳等[31]研究表明高海拔處信陽毛尖香氣物質(zhì)種類及含量都顯著高于低海拔處，其中高海拔萜烯醇類含量更高、種類更豐富，低海拔含有較高比例的具有木香的芳香物質(zhì)，與本研究結(jié)果不完全一致，可能是產(chǎn)地和品種不同導(dǎo)致。本研究發(fā)現(xiàn)，高海拔H2 試樣中具有花香和果香特征的醇類物質(zhì)含量最高。Kfoury 等[32]研究表明云南勐海縣大葉種茶香氣主要差異物質(zhì)為2-苯基-2-丙醇、壬醛、反式橙叔花醇、異丁香酚、Z-茉莉、4-甲基苯甲酸甲酯、十二醛等，具有花香或果香特征香氣，與本研究結(jié)果不完全一致，可能是產(chǎn)地不同所致。

4 結(jié)論

本研究對(duì)無量山海拔1 400～2 000 m 云南大葉種曬青茶進(jìn)行感官審評(píng)、主要生化成分及揮發(fā)性成分測定，分析發(fā)現(xiàn)試樣以海拔1 800 m 為界存在顯著差異，海拔更高試樣湯色色澤加深、亮度降低，澀味減輕、鮮爽味增強(qiáng)，氨基酸含量更高而茶多酚含量低；海拔1 400～1 800 m 與1 800～2 000 m 試樣共有差異揮發(fā)性成分17 種，其中花香和果香成分共11 種。本研究結(jié)果為海拔對(duì)云南大葉種曬青茶品質(zhì)影響和云南大葉種曬青茶品質(zhì)特征研究提供了科學(xué)依據(jù)，為云南大葉種曬青茶的開發(fā)和利用以及普洱茶加工奠定了理論基礎(chǔ)。