范金波，麻 奧，周素珍，王長霞，呂長鑫

（1 渤海大學食品科學與工程學院 遼寧省食品安全重點實驗室 生鮮農產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2 錦州益多樂乳業(yè)有限公司 遼寧錦州 121018）

功能性乳制品作為一種有利于養(yǎng)成健康飲食習慣的商品，在預防慢性病方面受到日益關注。其不僅含有植物多酚、維生素等保持人體健康的附加成分，還富含乳蛋白、鈣、活性肽等關鍵營養(yǎng)物。

β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin，β-Lg）約占總乳蛋白的7%～12%，與α-乳白蛋白（α-Lactalbumin，α-La）同屬于乳清蛋白[1-2]。作為乳酪生產(chǎn)過程中回收的副產(chǎn)品，可廣泛獲得，且相對廉價[3]。β-Lg 的“花萼”空腔可以運載甘油三酯、維甲酸和視黃醇等疏水小分子[4-5]。β-Lg 外表面的疏水口袋、Trp19-Arg124 附近、β-桶孔徑和二聚體的單體-單體交界面也被認為是結合親水性和兩親性配體的潛在位點[6-7]。

二酮類多酚姜黃素（Curcumin，Cur）、芪類多酚白藜蘆醇（Resveratrol，Res）、黃酮類多酚槲皮素（Quercetin，Que）、酯類多酚咖啡酸-β-苯乙醇酯（Caffeic acid phenylethyl ester，CAPE）和苯丙烷類多酚綠原酸（Chlorogenic acid，CGA）在內的多酚類化合物具有抗炎抗氧化、降壓降脂以及阻止癌癥細胞起始、生長和轉移等眾多藥理作用，然而，氧、光、熱不穩(wěn)定的特點導致多酚在體內半衰期短，并且較差的水溶性使其生物利用度受限，因此常將其裝入兩親性共聚物膠束的疏水核心來發(fā)揮有益功效[8-17]。

莧菜紅（Amaranth，Ama）是一種合成偶氮類染料，廣泛應用于紅色或棕色食品中，包括軟飲料、蛋糕混合物、冰淇凌、谷類食品、葡萄酒、沙拉醬和咖啡[18]。然而，Ama 與人體內的某些藥物（如阿司匹林、苯甲酸）接觸時，可引起敏感人群的過敏和哮喘反應[19]。此外，有充分的證據(jù)表明，食用合成偶氮染料，其含有的偶氮（N=N）官能團和芳香環(huán)結構可被還原裂解成芳香胺，具有致癌毒性[20]。

功能性乳制品廣受青睞，而在多酚類有益物質被人體吸收的同時，為其外觀色澤加分的著色劑也在一定程度上危害健康。借助控制載體蛋白-有害色素復合物的解離來抑制其人體吸收，成為蛋白小分子互作研究需攻克的重點。通過熒光光譜法結合分子對接研究多酚和Ama 與β-Lg 的競爭結合，不僅可改善配體的溶解性和穩(wěn)定性，達到控制釋放的作用，還可以延申到發(fā)揮多酚類物質生物活性的同時，降低有害添加劑對人體健康的影響研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-Lg（純度≥95%），合肥博美生物科技有限責任公司；Ama、Cur、Res、Que、CAPE、CGA（純度≥98%），上海生工生物工程有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（分析純級），天津市北辰方正試劑廠；無水乙醇（分析純級），天津市天力化學試劑有限公司；試驗用水皆為超純水。

1.2 儀器與設備

F-7000 熒光分光光度計，日本日立高新技術公司；XH-2000-I 旋渦混合器，天津市泰斯特儀器有限公司；ML104 電子天平、FE20K 實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Milli-Q HX7000 型超純水機，德國默克密理博有限公司。

1.3 方法

1.3.1 莧菜紅、多酚與β-乳球蛋白的分子對接 以分子對接模擬預測多酚、Ama 與β-Lg 結合的相應位點。β-Lg 的3D 結構采用RCSB PDB 蛋白質數(shù)據(jù)站中的5IO5 并去除水分子；Ama（CID：13506）、Cur（CID：969516）、Res（CID：445154）、Que（CID：5280343）、CAPE（CID：5281787）、CGA（CID：1794427）的3D 結構來自PubChem 數(shù)據(jù)庫。Autodock Vina v4.0 軟件用于分子對接模擬。設置對接區(qū)域（x=91，y=58，z=89）以覆蓋整個β-Lg 單體的結合位點，β-Lg 剛性對接，配體柔性對接，其它參數(shù)均默認。選擇對接分數(shù)中的最低能量構象，利用Pymol 結合Discovery Studio 2017 v2.0 做圖，Adobe Photoshop CS6 與PowerPoint 2013 軟件美化圖像[21]。

1.3.2 溶液配制 參考但倩譽[22]的方法并稍作修改，以二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉配制成10 mmol/L 的PBS 磷酸緩沖溶液（pH 7.4），4℃冷藏條件下有效期一個月。并以此緩沖液配制200 μmol/L 的β-Lg 溶液，以及1 mmol/L 的Ama、Cur、Res、Que、CAPE、CGA 溶液（除Ama 外均用70%乙醇溶液預溶），現(xiàn)配現(xiàn)用（如需暫存置于4℃冰箱）。

1.3.3 莧菜紅、多酚對于β-乳球蛋白的熒光猝滅

1.3.3.1 莧菜紅和多酚與β-乳球蛋白相互作用的熒光測定 參考張婕[23]的方法并稍作修改，將β-Lg 溶液以及一定量的Ama、多酚溶液與離心管中的PBS 緩沖溶液混合，在旋渦混合器上充分震蕩。每管溶液總體積為3 mL，β-Lg 濃度均為20 μmol/L，Ama、多酚濃度分別為0，2，6，10，14，20，30，40 μmol/L，即配體蛋白比為0，0.1∶1，0.3∶1，0.5∶1，0.7∶1，1.0∶1，1.5∶1，2∶1。上述樣品每種配制兩組，分別于25，37 ℃反應30 min 后取出。

熒光掃描按如下條件進行：每次取300 μL 配制好的樣品潤洗標準石英比色皿3 次，取2 mL 樣品于比色皿中利用熒光分光光度計進行熒光掃描。固定激發(fā)波長為295 nm，發(fā)射波長300 nm～500 nm，激發(fā)、發(fā)射的狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速度為700 nm/min。

1.3.3.2 熒光內濾效應的消除 熒光內濾效應指由于熒光體的高濃度或存在其它吸光物，熒光體和吸光物吸收激發(fā)、發(fā)射光而減弱熒光的現(xiàn)象[24]。因此，有必要從熒光數(shù)據(jù)中消除這種影響。使用式（1）可消除熒光內濾效應，其中Fc和Fm分別為校正熒光和測量熒光，A1和A2分別是Ama 或多酚在激發(fā)和發(fā)射波長下的吸光度[24]。

1.3.3.3 猝滅常數(shù)計算 利用Stern-Volmer（2）方程對所得熒光數(shù)據(jù)進行計算，以求得猝滅速率常數(shù)Kq和Stern-Volmer 猝滅常數(shù)Ksv[25]。

式中，F(xiàn)0——猝滅劑加入前熒光體的熒光強度峰值；F——猝滅劑加入后熒光體的熒光強度峰值；[Q]——猝滅劑濃度，mol/L；τ0——未加猝滅劑時熒光體的平均壽命，10-8s；Ksv——Stern-Volmer猝滅常數(shù)；Kq——生物分子猝滅速率常數(shù)。

1.3.3.4 結合常數(shù)與結合位點數(shù)計算 假設蛋白質上存在n個獨立結合位點，采用Hill 方程（3）計算結合常數(shù)Ka和結合位點數(shù)n[25]。

式中，Ka——表觀結合常數(shù)；n為結合位點數(shù)。

1.3.3.5 熱力學常數(shù)計算 分子間作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等[26]。由Van's Hoff 方程（4）和熱力學方程（5）可計算出焓變ΔH、吉布斯自由能ΔG和熵變ΔS[27]。

式中，R——摩爾氣體常數(shù)，8.314 J/（mol·K）；T——試驗溫度，K；K1——T1溫度下對應的表觀結合常數(shù)；K2——T2溫度下對應的表觀結合常數(shù)；ΔG——吉布斯自由能，kJ/mol；ΔH——焓變，kJ/mol；ΔS——熵變，J/（mol·K）。1.3.4 莧菜紅和多酚與β-乳球蛋白的競爭結合試驗 試驗樣品分為兩組，分別為pH 7.4 組和pH 3.0 組，其中pH 3.0 組所用PBS 緩沖溶液用0.5 mol/L 鹽酸調節(jié)pH 值（下同），后續(xù)操作一致[22]。

首先在離心管中加入PBS 緩沖溶液，每個離心管中溶液總體積為3 mL，再加入β-Lg 溶液并輕輕搖勻，β-Lg 濃度均為20 μmol/L，最后依次加入Ama 和多酚（多酚和Ama），前者濃度均為14 μmol/L，后者濃度分別為0，2，6，10，14，20，30，40 μmol/L，每次加入配體后在旋渦混合器上充分混勻后反應30 min。

熒光掃描條件同1.3.3.1 節(jié)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 試驗均重復3 次，日立FL Solution 2.1 軟件用于數(shù)據(jù)采集，結果表示為平均值±標準差，利用IBM SPSS Statistics 25.0 軟件進行顯著性差異分析，差異水平P<0.05 為顯著，采用Origin 9.0 軟件繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 配體與β-乳球蛋白的分子對接

在分子對接模擬結果中，綠色鍵代表氫鍵，粉色鍵代表疏水相互作用。由圖1a 可知，Ama 結合于β-Lg的疏水空腔的“入口”處，主要通過氫鍵與Lys69、Asn88、Asn90、Asn109 和Ser116 結合。Cur（圖1b）與Ama 的結合位點接近，同樣結合于β-Lg“桶口”處，被Ile71、Ile84、Asn90、Met07 4 個氨基酸殘基包圍，主要通過疏水相互作用與Ile71、Ile84 結合。Res（圖1c）的結合位點也在“β-桶口”附近，并通過疏水相互作用與Leu39、Pro38、Met107 3 個氨基酸殘基結合。Que（圖1d）和CAPE（圖1e）均通過疏水相互作用結合于β-Lg 的“桶底”，且由于氨基酸殘基偏向一側，可以判斷此時二者結合于疏水空腔的外部。圖1f 顯示了CGA的結合位點位于β-Lg 的外表面，作用力主要是氫鍵。6 種配體與β-Lg 結合的吉布斯自由能分別為-40.32（Ama），-31.54（Cur），-32.15（Res），-35.63（Que），-37.44（CAPE），-36.96 kJ/mol（CGA）。

圖1 Ama 和5 種多酚與β-Lg 的預測結合位點、氨基酸殘基及作用力Fig.1 Predicted binding sites，the binding sites amino acids and interaction forces of Ama with five polyphenols on β-Lg

分子對接的結果表明Cur 和Res 與β-Lg 結合的位點與Ama 的結合位點接近（Cur、Res、Ama均與Asn90 結合，Res、Ama 皆與Leu39 結合），若Cur 或Res 與Ama 同時與β-Lg 相互作用時可能會產(chǎn)生競爭作用彼此影響與β-Lg 的結合，而Que、CAPE 和CGA 因結合位置遠離Ama 的結合位點，將不會對Ama 結合于β-Lg 之上造成影響。

2.2 莧菜紅、多酚對β-乳球蛋白熒光光譜的影響

分子對接結果從5 種多酚類物質中篩選出了與Ama 競爭結合位點的Cur 與Res，為驗證分子對接的結果并進一步選擇與Ama 競爭結合能力強的多酚，進行β-Lg 與Ama、多酚相互作用的熒光光譜檢測。

蛋白質的內源熒光與Trp、Tyr、Phe 殘基的存在密不可分。與配體的結合會誘導蛋白質的熒光猝滅，通過對熒光光譜的分析，可以得到蛋白質與配體結合的有關信息，以及與配體相互作用過程中氨基酸殘基微環(huán)境的變化情況。β-Lg 含有兩個Trp 殘基Trp19 和Trp61 以及4 個Tyr 殘基Tyr20、Tyr42、Tyr99 和Tyr102[28]。激發(fā)波長為295 nm 時，熒光光譜主要由Trp 貢獻[29]。

由圖2 可知，當激發(fā)波長為295 nm 時，β-Lg的最大熒光強度峰位置在334 nm 附近，且β-Lg的固有熒光強度值隨著配體濃度的增加有規(guī)律的降低，而峰形無明顯變化，即幾種配體均對β-Lg的熒光產(chǎn)生了猝滅作用。其中Res（圖2c）、CAPE（圖2e）CGA（圖2f）對β-Lg 的熒光猝滅能力相對其它幾種配體明顯更強。同時由圖可以看出，隨著Res（圖2c）和CGA（圖2f）濃度增加，β-Lg 最大熒光峰發(fā)生明顯紅移（334 nm→356 nm 和333 nm→354 nm），CAPE（圖2e）的加入也導致最大熒光峰位置的輕微紅移（334 nm→346 nm），此現(xiàn)象表明這幾種配體存在時，β-Lg 芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了變化，在分子層面表現(xiàn)為親水性增加，疏水性降低，與Kanakis 等[30]、張婕[23]和郝明皓[31]的研究結果一致。Cur（圖2b）與Que（圖2d）的添加，造成了蛋白最大熒光峰位置一定程度上的藍移（335 nm→331 nm 和335 nm→332 nm），此時芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境變得更加疏水，試驗結果與Kanakis 等[30]和李曉蕾等[11]一致。圖2a 還體現(xiàn)了一個獨特的現(xiàn)象，即在420 nm 附近，出現(xiàn)了一個隨Ama 濃度增加熒光強度升高的峰，即Ama 與β-Lg 的復合物產(chǎn)生了內源熒光。

圖2 不同溫度下Ama 和5 種多酚對β-Lg 的熒光猝滅Fig.2 Fluorescence quenching of β-Lg by Ama and five kinds of polyphenols at different temperatures

對比每種配體的左、右兩圖可以看出溫度升高雖導致β-Lg 的內源熒光強度減弱，但不會對配體猝滅β-Lg 內氨基酸殘基熒光的能力造成明顯影響，這可能與溫度升高程度較低有關。

2.3 配體對β-乳球蛋白的熒光猝滅機理與熱力學性質

動態(tài)和靜態(tài)猝滅作為配體猝滅蛋白質的兩種模式[32]，前者意味著高溫導致分子碰撞劇烈和擴散加快，表現(xiàn)為動態(tài)猝滅常數(shù)與溫度成正比；而靜態(tài)猝滅形成的復合物受熱分解，因此靜態(tài)猝滅常

數(shù)會隨溫度升高而減小[33]。Stern-Volmer 方程【式（2）】和Hill 方程【式（3）】可闡明熒光猝滅機理[25]。同時，利用Van's Hoff 方程【式（4）】和熱力學方程【式（5）】可分析反應的熱力學性質，判斷相互作用力。對于作用力類型的判斷，一般認為，當反應放熱，ΔS<0 時，結合的主要驅動力是氫鍵和范德華力；而ΔS>0 時，靜電相互作用是主要作用力；當ΔH和ΔS均大于0 時，主要是疏水相互作用[34]。

表1 與表2所示為方法中所述數(shù)學方程計算得到的配體與β-Lg 相互作用的一些重要常數(shù)。

由表1 可知配體與β-Lg 結合的生物分子猝滅常數(shù)（Kq）均大于最大擴散碰撞猝滅速率常數(shù)值2×1010L/（mol·s），說明形成了蛋白質-配體復合物，即發(fā)生了靜態(tài)猝滅[35]。研究表明當結合常數(shù)（Ka）在（1～15）×104L/mol 范圍內時，配體以可逆的方式與蛋白質結合[36]，可以看出除Que 在25 ℃結合常數(shù)較低外，配體與β-Lg 均有較強的結合能力，且結合能力與熒光發(fā)射光譜中對β-Lg 的猝滅能力相對應。幾種配體結合位點數(shù)接近于1 說明與β-Lg 均有單個結合位點，結果符合前人的研究結論。

由表2 可知配體與β-Lg 的結合均為自發(fā)進行（ΔG<0）。其中Ama 與CGA 的ΔH<0，說明二者與β-Lg 的結合反應放熱，也與表1 中的Ka隨溫度升高而減小相對應。反之ΔH>0 的蛋白質-配體復合物的Ka值隨溫度升高而增大。由ΔH與ΔS推斷蛋白質與配體結合主要驅動力可知，Ama和CGA 與β-Lg 作用類型為氫鍵與范德華力，Cur、Res、Que 和CAPE 則通過疏水相互作用與β-Lg 結合，與分子對接中所表現(xiàn)的相互作用力基本相符。

表1 配體與β-Lg 相互作用的猝滅、結合常數(shù)Table 1 Quenching constants and binding constants of β-Lg interacting with ligands

表2 配體與β-Lg 相互作用的熱力學常數(shù)Table 2 Thermodynamic constants of β-Lg interacting with ligands

2.4 和莧菜紅競爭結合β-乳球蛋白的多酚的確定

β-Lg 的疏水空腔，也就是被稱為“花萼”的β-桶由于特殊構造，對結合位點控制具有pH 值響應性?！癊F 環(huán)”類似于開關控制小分子進入疏水空腔內部，當β-Lg 處于中性pH 值時，“EF 環(huán)”打開，小分子可進入疏水空腔并結合，而當外部環(huán)境為酸性時，Glu89 質子化使“EF 環(huán)”閉合擋住空腔入口，阻止小分子結合到疏水腔內，此時小分子只能結合于β-Lg 的外表面[37]。

由熒光猝滅率圖3所示，可以看出在pH 值為7.4 時Ama 與β-Lg 的結合顯著影響了Cur 的結合，具體體現(xiàn)在猝滅率降低。而在pH 值為3 時Ama 與β-Lg 的結合未對Cur 造成影響。同時其它多酚類物質與Ama 無競爭結合β-Lg 的體現(xiàn)或競爭作用較弱。說明在中性條件下，Cur 與Ama 均結合到β-Lg 的相近位點，而在酸性條件下，“EF 環(huán)”關閉，此時Cur 和Ama 結合于β-Lg 外表面的不同位點，二者與β-Lg 的結合互不影響。

圖3 不同pH 值下Ama 對β-Lg-配體復合物的熒光猝滅率影響Fig.3 Effect of Ama on fluorescence quenching rate of β-Lg-ligand complex at different pH value

由熒光猝滅率圖4 可知中性條件下Cur、Res與β-Lg 的結合均影響了Ama 的結合，兩種配體出現(xiàn)競爭關系，此時Ama 與Cur、Res 競爭結合相近位點，猝滅率降低，對應了分子對接的結論，此時Cur、Res 先于Ama 與β-Lg 結合，而由于Ama對此位點的結合能力較強因此與前者產(chǎn)生競爭作用。從圖中可以看出Cur 與Ama 的競爭作用略強于Res。酸性環(huán)境中5 種多酚與β-Lg 的結合不會對Ama 造成影響。二配體競爭試驗的結果表明配體添加順序的改變也可以影響配體與蛋白質的結合。

圖4 不同pH 值下配體對β-Lg-Ama 復合物的熒光猝滅率Fig.4 Effect of ligands on fluorescence quenching rate of β-Lg-Ama complex at different pH value

3 結論

以分子對接模擬了5 種多酚和Ama 與β-Lg的結合位點氨基酸和作用力類型，并采用熒光光譜法驗證多酚和Ama 與β-Lg 結合的熒光猝滅、結合位點數(shù)和相互作用力，最后通過競爭結合試驗結合分子對接確定了與Ama 競爭β-Lg 位點的多酚。結果表明，多酚類活性成分Cur、Res、Que、CAPE 和CGA 與人工合成偶氮類染料Ama 均可對β-Lg 產(chǎn)生靜態(tài)猝滅從而形成蛋白質-配體復合物。Ama、Cur 和Res 的結合位點在β-Lg 空腔入口附近，Que、CAPE、CGA 的結合于β-Lg 空腔外表面。其中Ama 和CGA 與β-Lg 作用力類型為氫鍵和范德華力，Cur、Res、Que 和CAPE 則通過疏水相互作用與β-Lg 結合，結果與分子對接模擬的配體與β-Lg 結合的主要作用力類型一致。酸性條件下Cur、Res、Que、CAPE、CGA 與Ama 均無明顯競爭結合作用，推測此時Ama 和5 種多酚與β-Lg結合于不同位點。在先加Ama 再添加多酚時，中性條件下Ama 與Cur 競爭結合于β-Lg 的結合位點；而在多酚先與β-Lg 結合的情況下，Cur 和Res在中性環(huán)境中均會影響Ama 與β-Lg 位點的結合。綜上結果表明5 種多酚中Cur 和Res 存在與Ama 的位點競爭作用，且競爭作用受配體與β-Lg的結合順序影響，對為控制功能性乳制品中小分子物質的人體吸收提供啟發(fā)具有重要意義。