江愛民 吳強(qiáng) 陳剛 馬梟 張金武

(1赤壁市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 赤壁 437300；2咸寧市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中溶栓等治療后的主要并發(fā)癥，神經(jīng)細(xì)胞凋亡與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)，當(dāng)腦組織缺血時炎癥、氧化應(yīng)激等可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而造成腦組織損傷，目前腦缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，長鏈非編碼RNA(LncRNA)在腦缺血再灌注損傷中表達(dá)異常并可發(fā)揮重要調(diào)控作用〔1～4〕。LncRNA MCM3AP-AS1在脂多糖誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中表達(dá)水平升高，并可通過調(diào)節(jié)miR-142-3p/HMGB1促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡〔5〕。但MCM3AP-AS1在腦缺血再灌注損傷中的表達(dá)及其作用機(jī)制尚未可知。靶基因預(yù)測顯示MCM3AP-AS1與miR-19b-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，研究表明miR-19b-3p在阿爾茨海默病大鼠中表達(dá)水平降低，并可能參與阿爾茨海默病的發(fā)生及發(fā)展〔6〕。但MCM3AP-AS1與miR-19b-3p在腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制尚未可知。本研究采用氧糖剝奪再復(fù)氧(OGD/R)誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT22建立細(xì)胞損傷模型，探討MCM3AP-AS1/miR-19b-3p分子軸在OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT22購自上海弘順生物；Lipofectamine2000、Trizol試劑購自美國Invitrogen；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自北京天根生化；si-NC、si-MCM3AP-AS1、miR-NC、miR-19b-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-19b-3p購自廣州銳博生物；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物；腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物；凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma。

1.2實驗分組 用含94%N2、5%CO2、1%O2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)HT22細(xì)胞6 h，然后更換為37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h〔7〕，記為OGD/R組。同時將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為Con組。si-NC、si-MCM3AP-AS1、miR-NC、miR-19b-3p mimics、si-MCM3AP-AS1與anti-miR-NC、si-MCM3AP-AS1與anti-miR-19b-3p分別轉(zhuǎn)染入HT22細(xì)胞后再進(jìn)行OGD/R處理，分別記為OGD/R+si-NC組、OGD/R+si-MCM3AP-AS1組、OGD/R+miR-NC組、OGD/R+miR-19b-3p組、OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC組、OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-19b-3p組。

1.3qRT-PCR檢測細(xì)胞中MCM3AP-AS1、miR-19b-3p的表達(dá)水平 用Trizol試劑提取各組HT22細(xì)胞RNA后將其置于-80℃冰箱內(nèi)保存。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR，按照熒光定量PCR試劑盒說明書操作并計算目的基因相對表達(dá)量。

1.4檢測MDA、SOD水平 采用反復(fù)凍融法裂解各組HT22細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明書分別檢測MDA、SOD水平。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測TNF-α、IL-6水平 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用ELISA檢測TNF-α、IL-6水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 收集各組HT22細(xì)胞加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后將500 μl結(jié)合緩沖液加入細(xì)胞沉淀，按照試劑盒說明書檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7雙熒光素酶報告基因檢測MCM3AP-AS1與miR-19b-3p的靶向關(guān)系 WT-MCM3AP-AS1、MUT-MCM3AP-AS1分別與miR-NC、miR-19b-3p mimics共轉(zhuǎn)染入HT22細(xì)胞，將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞并檢測熒光素酶活性。

1.8Western印跡檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 收集各組HT22細(xì)胞后加入500 μl RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉2 h，分別加入一抗(美國CST)稀釋液(1∶1 000)與二抗(北京博爾西科技有限公司)稀釋液(1∶2 000)，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞中MCM3AP-AS1與miR-19b-3p的表達(dá)量比較 OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞中MCM3AP-AS1表達(dá)明顯上調(diào)，miR-19b-3p表達(dá)明顯下調(diào)(均P<0.001)，見表1。

表1 OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞中MCM3AP-AS1與 miR-19b-3p表達(dá)量比較

2.2干擾MCM3AP-AS1對OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞炎癥及氧化應(yīng)激的影響 與Con組比較，OGD/R組MDA、TNF-α、IL-6水平明顯升高，SOD水平明顯降低(P<0.05)；與OGD/R+si-NC組比較，OGD/R+si-MCM3AP-AS1組MDA、TNF-α、IL-6水平明顯降低，SOD水平明顯升高(均P<0.05)，見表2。

表2 干擾MCM3AP-AS1對OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激及凋亡的影響

2.3干擾MCM3AP-AS1對OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響 與Con組比較，OGD/R組細(xì)胞凋亡率明顯升高，Bax蛋白水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低(均P<0.05)，而干擾MCM3AP-AS1可抑制細(xì)胞凋亡及Bax表達(dá)，并可促進(jìn)Bcl-2表達(dá)(均P<0.05)，見表2、圖1。

2.4MCM3AP-AS1靶向調(diào)控miR-19b-3p starBase預(yù)測顯示MCM3AP-AS1與miR-19b-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖2。miR-19b-3p過表達(dá)可抑制共轉(zhuǎn)染野生型載體WT-MCM3AP-AS1細(xì)胞的熒光素酶活性(P<0.05)，見表3。

1～4：Con組、OGD/R組、OGD/R+si-NC組、OGD/R+si-MCM3AP-AS1組圖1 干擾MCM3AP-AS1對OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元 細(xì)胞凋亡的影響

圖2 MCM3AP-AS1的序列中含有與miR-19b-3p 互補(bǔ)的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

2.5miR-19b-3p過表達(dá)對OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激及凋亡的影響 miR-19b-3p過表達(dá)可明顯降低OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞中MDA、TNF-α、IL-6水平和細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白水平，而miR-196-3p表達(dá)、SOD水平和Bcl-2蛋白水平明顯升高(均P<0.001)，見圖3、表4。

1，2:OGD/R+miR-NC組、OGD/R+miR-19b-3p組圖3 miR-19b-3p過表達(dá)對OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元 細(xì)胞凋亡的影響

表4 miR-19b-3p過表達(dá)對OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激及凋亡的影響

2.6抑制miR-19b-3p能夠逆轉(zhuǎn)干擾MCM3AP-AS1表達(dá)對OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激及凋亡的作用 與OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC組比較，OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-19b-3p組MDA、TNF-α、IL-6水平和細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白水平明顯升高，SOD水平和Bcl-2蛋白水平明顯降低(均P<0.001)，見表5、圖4。

表5 抑制miR-19b-3p能夠逆轉(zhuǎn)干擾MCM3AP-AS1表達(dá)對OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞炎癥、 氧化應(yīng)激及凋亡的作用

1～2：OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-NC組、OGD/R+si-MCM3AP-AS1+anti-miR-19b-3p組圖4 抑制miR-19b-3p能夠逆轉(zhuǎn)干擾MCM3AP-AS1表達(dá) 對OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用

3 討 論

LncRNA在腦缺血再灌注損傷中可發(fā)揮重要作用，例如，LncRNA MEG3通過靶向miR-485/AIM2軸而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)腦缺血再灌注損傷〔8〕。LncRNA SNHG14通過miR-182-5p/BINP3軸誘導(dǎo)吞噬作用而促進(jìn)OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷〔9〕。LncRNA SNHG12通過抑制miR-199a及上調(diào)SIRT1而激活A(yù)MPK信號通路從而減輕腦缺血/再灌注損傷〔10〕。

MCM3AP-AS1在慢性阻塞性肺疾病中表達(dá)異常并可調(diào)控人支氣管平滑肌細(xì)胞增殖〔11〕。MCM3AP-AS1在急性缺血性腦卒中表達(dá)水平升高，并可能參與急性缺血性腦卒中發(fā)生及發(fā)展過程〔12〕。MCM3AP-AS1通過調(diào)節(jié)miR-204-5p/FOXC1促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔13〕。但MCM3AP-AS1在OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞損傷中的表達(dá)尚未可知。本研究結(jié)果提示MCM3AP-AS1在腦缺血再灌注損傷中可能發(fā)揮調(diào)控作用，干擾MCM3AP-AS1表達(dá)可抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激，而干擾MCM3AP-AS1表達(dá)可抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞炎癥反應(yīng)。炎癥或氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡是造成腦缺血再灌注損傷的重要原因之一，Bcl-2/Bax比值降低可促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔14〕。本研究結(jié)果顯示，干擾MCM3AP-AS1表達(dá)可抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。但MCM3AP-AS1調(diào)控OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞損傷的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

本研究提示，MCM3AP-AS1可能通過負(fù)向調(diào)控miR-19b-3p的表達(dá)從而發(fā)揮作用。研究表明miR-19b-3p通過靶向GRK6降解IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解而減輕細(xì)胞炎性損傷〔15〕。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-19b-3p表達(dá)異常可參與腦膜炎性大腸桿菌誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)〔16〕。