徐旗隅 董惠

(洪湖市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 荊州 433200)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。近年來，由于肥胖癥和代謝性疾病的增加，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率逐年增加，且發(fā)病年齡更趨于年輕化〔1〕。子宮切除術(shù)聯(lián)合放射治療和淋巴結(jié)切除術(shù)的應(yīng)用顯著降低了子宮內(nèi)膜癌的死亡率，但晚期和轉(zhuǎn)移性子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后和生存率仍較差〔2〕。因此，闡明子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、進(jìn)展的分子機(jī)制、開發(fā)有效的治療策略對(duì)提高子宮內(nèi)膜癌患者生存率、改善預(yù)后意義重大。微小RNA(miRNA)是進(jìn)化保守的非編碼小RNA，其通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合調(diào)節(jié)表達(dá)在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮功能作用〔3，4〕。研究顯示，miR-424-5p在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)降低，并對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移轉(zhuǎn)移具有抑制作用〔5，6〕，然而miR-424-5p在子宮內(nèi)膜癌中的作用機(jī)制并未完全闡明。序列分析發(fā)現(xiàn)，miR-424-5p與核酪蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物(NUCKS)1之間可能存在相互作用。已有研究證實(shí)，宮頸鱗狀細(xì)胞癌NUCKS1高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展和復(fù)發(fā)有關(guān)〔7〕。干擾NUCKS1表達(dá)顯著降低胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲性能，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔8〕。然而，NUCKS1在子宮內(nèi)膜癌中的功能及miR-424-5p是否通過調(diào)控NUCKS1發(fā)揮功能仍未可知。本研究探討miR-424-5p和NUCKS1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中表達(dá)情況及對(duì)宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa、HEC-1A、AN3CA及人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(hEEC)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；miR-424-5p模擬物(miR-424-5p mimics)及其對(duì)照物(miR-NC)、miR-424-5p抑制物(anti-RNA)及其對(duì)照、NUCKS1敲低質(zhì)粒(si-NUCKS1)及其對(duì)照(si-NC)、NUCKS1過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-NUCKS)及其對(duì)照物(pcDNA-NC)購(gòu)自上海吉瑪制藥公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翌圣生物公司；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA第一鏈合成試劑盒、SYBR-Green Premix購(gòu)于大連寶生物工程公司；凋亡試劑盒購(gòu)于上海貝博生物；抗體NUCKS1、細(xì)胞周期素(Cyclin)D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9和裂解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)-3、β-actin抗體等一抗及山羊抗兔IgG二抗購(gòu)于上海賽信通公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) Ishikawa、HEC-1A、AN3CA細(xì)胞均使用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到85%時(shí)進(jìn)行消化傳代，每周更換2次培養(yǎng)液。取2×105個(gè)對(duì)數(shù)期Ishikawa細(xì)胞接種6孔板培養(yǎng)24 h后，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將miR-NC、miR-424-5p mimics、si-NC、si-NUCKS1、pcDNA-NC、pcDNA-NUCKS1、miR-424-5p+pcDNA-NC、miR-424-5p+pcDNA-NUCKS1分別轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞，分為miR-NC組、miR-424-5p mimics組、si-NC組、si-NUCKS1組、pcDNA-NC組、pcDNA-NUCKS1組、miR-424-5p+pcDNA-NC組、miR-424-5p+pcDNA-NUCKS1組。同時(shí)未轉(zhuǎn)染為對(duì)照(NC)組。轉(zhuǎn)染48 h時(shí)收集細(xì)胞實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)和Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，隨后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3RT-qPCR檢測(cè)miR-424-5p和NUCKS1 mRNA表達(dá) 通過Trizol試劑提取細(xì)胞中的總RNA，并檢測(cè)RNA的濃度和純度。利用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA第一鏈合成試劑盒分別合成mRNA和miRNA的cDNA。利用SYBR-Green Premix和特定的PCR引物進(jìn)行RT-qPCR。以β-actin或U6作為內(nèi)參基因，通過使用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。PCR引物序列：miR-424-5p：上游5′-GGCTAGTCAGCAGCAATTCATGT-3′，下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內(nèi)參U6：上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；NUCKS1：上游5′-TGCCCAAACCCAGACTAAAG-3′，下游5′-GACCCTTCATCCC-CAGATTT-3′；內(nèi)參β-actin：上游5′-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3′，下游5′-CGTCATCCATGGCGAACTGG-3′。

1.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將各組細(xì)胞接種到96孔板中，孵育細(xì)胞24 h后加入10 μl的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h后通過酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度值(A)檢測(cè)其細(xì)胞活力。

1.5Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 將Transwell室放置在24孔板中。每組取1×105個(gè)細(xì)胞(200 μl不含血清DMEM培養(yǎng)基稀釋)接種在Transwell小室上腔，下腔加入600 μl含10% FBS的培養(yǎng)基。孵育24 h后，取出小室，除去Transwell膜上非遷移細(xì)胞后用甲醇固定、結(jié)晶紫染色，通過計(jì)數(shù)顯微鏡下隨機(jī)5個(gè)視野遷移細(xì)胞數(shù)的平均值來檢測(cè)其遷移能力。侵襲實(shí)驗(yàn)中除Transwell小室預(yù)先被基質(zhì)膠包被外，剩余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞使用500 μl的結(jié)合緩沖液重懸，使密度達(dá)到1×105個(gè)/ml。分別加入5 μl的膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和5 μl的碘化丙啶(PI)染液，在室溫下避光孵育25 min，冰上孵育，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)凋亡水平。

1.7Western印跡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)目的蛋白表達(dá) 向收集的細(xì)胞中加入含蛋白酶抑制劑和蛋白酶磷酸化抑制劑的裂解緩沖液，于冰上孵育裂解細(xì)胞收集含總蛋白的上清液，并通過二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量測(cè)定其濃度。將蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后，用兔抗NUCKS1、CyclinD1、MMP2、MMP9和Cleaved-caspase-3抗體于室溫條件下孵育膜1 h進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)，再加入山羊抗兔IgG二抗，將膜在室溫孵育1 h后進(jìn)行顯影，之后分析目的條帶灰度值，通過計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參β-actin的相對(duì)表達(dá)量來檢測(cè)其表達(dá)水平。

1.8雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) Starbase預(yù)測(cè)顯示NUCKS1 mRNA的3′-UTR區(qū)域含有的互補(bǔ)序列，將含有miR-424-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生(WT)NUCKS1 mRNA-3′-UTR序列或突變(MUT)系列插入到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒獲得熒光素酶報(bào)告載體。將上述兩個(gè)插入后的報(bào)告載體(WT-NUCKS1、MUT-NUCKS1)與miR-424-5p mimics、miR-NC分別共轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞48 h后檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。同時(shí)將miR-424-5p mimics、miR-NC、anti-miR-424-5p、anti-miR-NC分別轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞48 h后檢測(cè)NUCKS1蛋白表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系miR-424-5p和NUCKS1的表達(dá)情況 與hEEC細(xì)胞相比，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(Ishikawa、HEC-1A、AN3CA)中的miR-424-5p表達(dá)水平明顯降低，而NUCKS1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見表1、圖1。選取miR-424-5p表達(dá)較低、NUCKS1表達(dá)較高的Ishikawa細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2過表達(dá)miR-424-5p對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 與NC組和miR-NC組比較，過表達(dá)miR-424-5p后可顯著抑制Ishikawa細(xì)胞的A值、遷移和侵襲水平，并明顯降低CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)，明顯增加細(xì)胞凋亡水平及相關(guān)蛋白(Cleaved-caspase-3)表達(dá)(均P<0.05)。見圖2、圖3、表2。

表1 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中miR-424-5p和 NUCKS1的表達(dá)

圖1 Western印跡檢測(cè)NUCKS1蛋白表達(dá)

2.3抑制NUCKS1表達(dá)對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 與si-NC組比較，沉默NUCKS1后可顯著抑制Ishikawa細(xì)胞的A值、遷移和侵襲水平，并明顯降低NUCKS1、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)，明顯增加細(xì)胞凋亡水平及相關(guān)蛋白(Cleaved-caspase-3)表達(dá)(P<0.05)。見表3、圖4。

圖2 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

1～3：NC組、miR-NC組、miR-424-5p組 A：各組細(xì)胞凋亡水平；B：Western印跡檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞內(nèi)CyclinD1、MMP2、MMP9和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)圖3 過表達(dá)miR-424-5p對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡的影響

表2 過表達(dá)miR-424-5p對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡水平的影響

表3 抑制NUCKS1表達(dá)對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

圖4 Western印跡檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞中NUCKS1、 CyclinD1、MMP2、MMP9、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

2.4miR-424-5p靶向調(diào)控NUCKS1表達(dá) 從Starbase分析結(jié)果(圖5A)可知，NUCKS1的3′端和miR-424-5p的5′端存在部分的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。將miR-424-5p mimics和WT-NUCKS1共轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞后，其相對(duì)熒光素酶活性(0.48±0.04)與miR-NC和WT-NUCKS1共轉(zhuǎn)染(1.00±0.11)比較顯著降低(P<0.05)；將miR-424-5p mimics和MUT-NUCKS1共轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞后，其相對(duì)熒光素酶活性(1.02±0.09)與miR-NC和MUT-NUCKS1共轉(zhuǎn)染(1.04±0.10)比較無顯著變化(P>0.05)。miR-424-5p組Ishikawa細(xì)胞中NUCKS1蛋白表達(dá)水平(0.42±0.04)與miR-NC組(0.82±0.08)比較顯著降低(P<0.05)；anti-miR-424-5p組Ishikawa細(xì)胞中NUCKS1蛋白表達(dá)水平(1.11±0.10)與anti-miR-NC組(0.84±0.07)比較顯著升高(P<0.05)。見圖5B。

A：starbase對(duì)NUCKS1和 miR-424-5p結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)；B：Western印跡檢測(cè)NUCKS1蛋白的表達(dá)；1～4：miR-NC組、miR-424-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-424-5p組圖5 miR-424-5p靶向NUCKS1調(diào)控NUCKS1的表達(dá)

2.5過表達(dá)NUCKS1可以逆轉(zhuǎn)miR-424-5p過表達(dá)對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 與pcDNA-NC組細(xì)胞相比，pcDNA-NUCKS1可顯著增強(qiáng)Ishikawa細(xì)胞中A值、遷移和侵襲能力，顯著升高細(xì)胞中NUCKS1、CyclinD1及遷移和侵襲相關(guān)蛋白MMP2和MMP9表達(dá)，顯著降低細(xì)胞凋亡水平及其相關(guān)蛋白(Cleaved-caspase-3)表達(dá)(P<0.05)；與miR-424-5p+pcDNA-NC組比較，miR-424-5p+pcDNA-NUCKS1組可顯著增強(qiáng)Ishikawa細(xì)胞中A值、遷移和侵襲能力，顯著升高細(xì)胞中NUCKS1、CyclinD1及遷移和侵襲相關(guān)蛋白MMP2和MMP9表達(dá)，顯著降低細(xì)胞凋亡水平及其相關(guān)蛋白(Cleaved-caspase-3)表達(dá)(P<0.05)。見圖6、表4。

1～4：pcDNA-NC組、pcDNA-NUCKS1組、miR-424-5p+pcDNA-NC組、miR-424-5p+pcDNA-NUCKS1組圖6 Western印跡檢測(cè)NUCKS1、CyclinD1、MMP2、 MMP9、MRP1蛋白表達(dá)

表4 過表達(dá)NUCKS1可以逆轉(zhuǎn)miR-424-5p過表達(dá)對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

3 討 論

越來越多研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，在各種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、血管生成及耐藥性〔9，10〕。探討miR-424-5p在子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展中的作用和機(jī)制，有望為子宮內(nèi)膜癌治療提供有效靶點(diǎn)。

本研究通過RT-qPCR檢測(cè)miR-424-5p表達(dá)發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中miR-424-5p表達(dá)水平顯著降低，與Li等〔5〕研究結(jié)果相吻合。CyclinD1是參與細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白，CyclinD1表達(dá)增加促進(jìn)細(xì)胞周期向S期轉(zhuǎn)換具有促增殖作用〔11〕。大量研究證實(shí)，MMP-2和MMP-9與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，其參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑〔12〕。本研究結(jié)果表明，miR-424-5p在子宮內(nèi)膜癌中具有抑癌作用，過表達(dá)miR-424-5p可有效降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。與本研究結(jié)論類似，Piao等〔13〕指出肝癌細(xì)胞中miR-424-5p呈較低的表達(dá)水平，通過轉(zhuǎn)染將miR-424-5p過表達(dá)后可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡并降低其增殖能力。Wu等〔14〕證實(shí)miR-424-5p對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程具有抑制作用。

目前，NUCKS1已被證實(shí)與多種癌癥類型中發(fā)揮作用。結(jié)腸癌中NUCKS1高表達(dá)與總體存活率和無復(fù)發(fā)生存率顯著降低有關(guān)〔15〕。肝癌中敲減NUCKS1可降低肝癌細(xì)胞活力，抑制異種移植小鼠模型腫瘤形成〔16〕。此外，有研究證實(shí)miR-142-3p通過靶向下調(diào)NUCKS1可抑制胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為〔17〕。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞中NUCKS1在mRNA和蛋白水平表達(dá)均顯著升高，抑制NUCKS1表達(dá)與過表達(dá)miR-424-5p對(duì)Ishikawa細(xì)胞的增殖能力、遷移、侵襲和凋亡具有相同的作用，而轉(zhuǎn)染pcDNA-NUCKS1過表達(dá)NUCKS1則具有相反的作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-424-5p直接結(jié)合NUCKS1并負(fù)調(diào)控NUCKS1表達(dá)。此外，過表達(dá)NUCKS1顯著逆轉(zhuǎn)miR-424-5p過表達(dá)對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的抑制作用。提示靶向負(fù)性調(diào)控NUCKS1表達(dá)是miR-424-5p在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮作用的重要機(jī)制。

綜上，miR-424-5p通過靶向NUCKS1可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。