王麗 王少微 賈彤 孫曉佳 邢珍 劉輝 姚杰 陳艷林

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院麻醉科，河北 張家口 075000)

心肌缺血是一種病理生理狀態(tài)，是由于心臟的血液灌注量減少，從而導(dǎo)致心臟供氧不足，心肌能量代謝異常的現(xiàn)象〔1,2〕。有研究表示，冠心病、變異性心絞痛、心肌橋等是主要病因〔3〕。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，中老年人為易發(fā)人群，男性發(fā)病人數(shù)高于女性，發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率較高，近年來(lái)該病發(fā)病率呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著患者的健康〔4,5〕。右美托咪定是一種注射劑，具有鎮(zhèn)定安神的作用〔6〕。本研究建立心肌缺血再灌注大鼠模型，分析右美托咪定對(duì)心肌缺血再灌注模型大鼠線粒體凋亡通路的影響，旨在探討右美托咪定是否經(jīng)線粒體凋亡通路參與該病的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只SPF級(jí)雄性大鼠(山東軒竹醫(yī)藥科技有限公司，使用許可證號(hào)：SYXK(魯)20200001)，2～4月齡，平均(3.1±0.8)月齡；體重265～312 g，平均體重(288.5±18.8)g。在相對(duì)濕度40%～65%、溫度(24.1±2.6)℃的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。本試驗(yàn)嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求進(jìn)行操作，且通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意。主要試劑：小鼠抗大鼠白細(xì)胞介素(IL)-6、超氧化物歧化酶(SOD)抗體(BD公司)、小鼠抗兔C反應(yīng)蛋白(CRP)抗體(Dako公司)、兔抗小鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(Gibco公司)、大鼠抗兔丙二醛(MDA)抗體(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、大鼠抗小鼠谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)抗體(Sigma公司)、兔抗大鼠細(xì)胞色素(Cyto)C、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體(Hyclone公司)。主要儀器：多道生理記錄儀(河南華南醫(yī)電科技有限公司)、光學(xué)顯微鏡(上海炳宇光學(xué)儀器有限公司)、流式細(xì)胞儀(天津眾立生物科技有限公司)、小動(dòng)物呼吸機(jī)(天津儀數(shù)科技有限公司)、彩色多普勒超聲診斷儀(徐州貝爾斯電子科技有限公司)、PE50動(dòng)脈導(dǎo)管(上海瑾瑜科學(xué)儀器有限公司)。

1.2分組及建模 隨機(jī)選取10只大鼠作為正常組，剩余30只大鼠參照羅敏等〔7〕研究建立心肌缺血再灌注模型，30只雄性大鼠分別禁食12 h，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位進(jìn)行固定，小動(dòng)物呼吸機(jī)機(jī)械通氣，四肢皮下插入電極，連接心電圖。在大鼠胸骨左緣第4肋間逐層打開(kāi)胸腔，充分暴露心臟和血管，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，誘發(fā)心肌缺血30 min，然后松開(kāi)結(jié)扎線再灌注60 min。心肌缺血再灌注造模成功的標(biāo)志，心電圖ST段明顯抬高、T波高聳。建模過(guò)程中大鼠死亡2只，將剩余的28只大鼠，隨機(jī)分為再灌注組、右美托咪定組各14只，在灌注組建模前2 h靜脈注射氯化鈉溶液，右美托咪定組建模前2 h靜脈注射右美托咪定，正常組未做處理。

1.3樣本采集 各組大鼠注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，2 000 r/min離心10 min,離心半徑10 cm，分離血清-40℃保存。處死大鼠取其心臟組織，將大鼠心臟組織置于丙酮-干冰飽和溶液中，石蠟包埋保存，以便后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4多道生理記錄儀檢測(cè)心臟血流動(dòng)力學(xué)水平 將大鼠注射戊巴比妥鈉麻醉后，分離右頸總動(dòng)脈，將PE50動(dòng)脈導(dǎo)管經(jīng)右頸總動(dòng)脈插入左心室，固定后用多道生理記錄儀，檢測(cè)并記錄左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓下降最大速率(-dp/dt)、左室內(nèi)壓上升最大速率(+dp/dt)水平。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色和梗死面積檢測(cè) 取出包埋后標(biāo)本，垂直連續(xù)切片，將標(biāo)本脫蠟處理，用蘇木素浸泡、染色，2%鹽酸酒精分化，使用自來(lái)水充分清洗，1%濃度伊紅染色，酒精浸泡、脫水，中性樹(shù)膠封片，放置顯微鏡下觀察。染色完畢后，用多聚甲醛固定，稱(chēng)重，ImageJ圖像分析軟件計(jì)算大鼠的心肌梗死面積。

1.6酶標(biāo)分析儀檢測(cè)炎癥因子水平 將待測(cè)血清按比例稀釋?zhuān)笜?biāo)板添加100 μl待測(cè)血清、標(biāo)準(zhǔn)液，震蕩均勻，恒溫箱靜置60 min，每孔加洗滌液浸泡2 min，甩干，反復(fù)洗板3次，每孔加40 μl蒸餾水、一抗，混合均勻，恒溫靜置30 min，重復(fù)洗滌步驟，每孔加酶標(biāo)抗體60 μl，37℃靜置15 min，每孔加底物液60 μl，避光靜置10 min，每孔加終止液60 μl。在酶標(biāo)板450 nm處測(cè)吸光值，計(jì)算IL-6、CRP、TNF-α水平。

1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)氧化應(yīng)激因子水平 取兩個(gè)標(biāo)記為待測(cè)管、對(duì)照管的試管備用，對(duì)照管和待測(cè)管分別加100 μl標(biāo)準(zhǔn)液、待測(cè)血清和40 μl蒸餾水、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝液，兩管均加有熒光標(biāo)記物的單克隆抗體，待測(cè)管再加有熒光標(biāo)記物的免疫球蛋白20 μl，恒溫放置30 min，兩管均加溶血?jiǎng)╈o置15 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，反復(fù)洗滌2次，添加磷酸鹽緩沖液(PBS)100 μl懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MDA、GSH-Px、SOD水平。

1.8Western印跡法檢測(cè)CytoC、Caspase-3通路蛋白相對(duì)表達(dá)量 待測(cè)血清用細(xì)胞裂解液裂解，測(cè)定待測(cè)血清中的蛋白濃度，加入適量的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，沸水水浴加熱5 min，以充分蛋白變性，使用NC膜轉(zhuǎn)模，Western洗滌液漂洗2 min，加Western封閉液，恒溫靜置60 min，加Western一抗稀釋液，恒溫孵育60 min，回收一抗，加洗滌液漂洗5 min，反復(fù)洗滌3次，加入Western二抗稀釋液由辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記，恒溫孵育60 min，回收二抗，充分洗滌后顯色、成像。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0進(jìn)行重讀測(cè)量方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組心房肌組織病理學(xué)觀察 正常組心肌組織結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，肌原纖維分布規(guī)則；再灌注組心肌組織排列稀疏、雜亂，細(xì)胞內(nèi)有明顯水腫，肌原纖維有斷裂現(xiàn)象；右美托咪定組心肌組織排列較緊密，細(xì)胞內(nèi)水腫減輕，肌原纖維斷裂現(xiàn)象明顯改善。見(jiàn)圖1。

圖1 各組心肌組織HE染色觀察(×200)

2.2各組心臟血流動(dòng)力學(xué)水平和梗死面積比較 如表1所示，與正常組比較，再灌注組、右美托咪定組LVSP、-dp/dt、+dp/dt水平較低，LVEDP水平較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與再灌注組比較，右美托咪定組LVSP、-dp/dt、+dp/dt水平較高，LVEDP水平較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與再灌注組比較，右美托咪定組梗死面積較小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.3各組炎癥因子水平比較 如表2所示，與正常組比較，再灌注組、右美托咪定組IL-6、CRP、TNF-α水平較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與再灌注組比較，右美托咪定組IL-6、CRP、TNF-α水平較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.4各組氧化應(yīng)激因水平比較 如表2所示，與正常組比較，再灌注組、右美托咪定組MDA水平較高，GSH-Px、SOD水平較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與再灌注組比較，右美托咪定組MDA水平較低，GSH-Px、SOD水平較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 各組心臟血流動(dòng)力學(xué)水平和梗死面積比較

表2 各組炎癥因子、氧化應(yīng)激水平比較

2.5各組線粒體凋亡通路蛋白相對(duì)表達(dá)量對(duì)比 如表3、圖2所示，與正常組比較，再灌注組、右美托咪定組各蛋白表達(dá)量較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與再灌注組比較，右美托咪定組各蛋白表達(dá)量較低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表3 各組線粒體凋亡通路蛋白相對(duì)表達(dá)量對(duì)比

1～3：正常組、再灌注組、右美托咪定組圖2 各組線粒體凋亡通路蛋白表達(dá)

3 討 論

心肌缺血是由于冠狀動(dòng)脈狹窄、痙攣、栓塞等引起的心肌供血、供氧不足，主要分為心絞痛、心肌梗死、缺血性心肌病、猝死四個(gè)類(lèi)型〔8〕。心肌缺血確診后需長(zhǎng)期治療，患者主要表現(xiàn)為心悸、頭暈、胸悶等常伴隨全身乏力、水腫、發(fā)熱甚至引發(fā)休克，嚴(yán)重威脅患者的生命〔9,10〕。臨床常用藥物對(duì)患者治療，但由于心肌缺血發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚無(wú)特效藥，因此尋找安全有效藥物是治療心肌缺血的關(guān)鍵〔11〕。

梗死面積是判定心肌缺血再灌注損傷的公認(rèn)指標(biāo)，心肌梗死是心肌組織的不可逆損傷，故心肌缺血再灌注大鼠模型梗死面積越大，表明其心肌組織的損傷度越高〔12,13〕。本文研究表明，使用右美托咪定處理大鼠，能有效減少大鼠梗死面積，提升心肌缺血再灌注大鼠的心肌保護(hù)力。

右美托咪定是一種具有強(qiáng)效、高選擇性的α2腎上腺素受體激動(dòng)藥物，有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)、呼吸抑制較輕的特點(diǎn)〔14〕。有學(xué)者研究表示，右美托咪定+咪達(dá)唑侖聯(lián)合用藥有助于緩解體內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而有效減輕心肌組織的損傷〔15〕。右美托咪定可通過(guò)調(diào)控IL-6、IL-3、LVSP、LVEDP水平，減輕心肌缺血再灌注過(guò)程中炎癥反應(yīng)的發(fā)生，提高機(jī)體血流動(dòng)力學(xué)水平，從而起到保護(hù)心肌組織的作用〔7〕。分析其原因可能是由于炎癥反應(yīng)可參與心肌損傷的過(guò)程相關(guān)，當(dāng)炎癥因子水平被抑制后，其心肌組織的損傷可明顯減輕，心室功能得到明顯改善；心臟血流動(dòng)力學(xué)水平的提升，可使心臟供血、供氧能力提升，從而弱化其損傷的過(guò)程〔16〕。本文研究表明，經(jīng)右美托咪定處理后，心肌缺血再灌注大鼠血流動(dòng)力學(xué)水平提升、炎癥因子水平下降，從而使心肌組織損傷明顯降低，進(jìn)而抑制心肌組織進(jìn)一步損傷，促進(jìn)其相關(guān)功能的修復(fù)。

線粒體是調(diào)節(jié)大部分凋亡通路的細(xì)胞器，可通過(guò)多種應(yīng)力刺激激活，導(dǎo)致線粒體外膜的改變〔17〕。CytoC由CYCS基因編碼，是一種高度保守的蛋白質(zhì)，從線粒體泄露出CytoC可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Caspase-3屬于Caspase家族，是細(xì)胞凋亡的效應(yīng)器，與眾多底物作用，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞發(fā)生特有改變〔18,19〕。目前已有研究顯示，促凋亡蛋白CytoC的增加和釋放可激活Caspase-3的活性，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡，最終導(dǎo)致心臟功能損傷〔20〕。本研究結(jié)果表明右美托咪定可能經(jīng)促進(jìn)線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白失活，有效阻止心肌細(xì)胞的程序性死亡，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。

雖然本文結(jié)果顯示，右美托咪定可能通過(guò)促進(jìn)線粒體凋亡通路失活，抑制心肌組織損傷，但目前臨床研究并沒(méi)有顯示右美托咪定、促進(jìn)線粒體凋亡通路與心肌缺血再灌注的關(guān)系，且本研究例數(shù)較少，存在一定的局限性，因此該結(jié)果仍需進(jìn)一步證實(shí)，以期為臨床心肌缺血再灌注的診治提供新的思路。

綜上所述，使用右美托咪定對(duì)心肌缺血再灌注大鼠進(jìn)行治療，能有效改善心臟血流動(dòng)力學(xué)水平，緩解炎癥反應(yīng)的發(fā)生，提高機(jī)體抗氧化能力，減少梗死面積，其作用機(jī)制可能促使線粒體凋亡通路信號(hào)通路失活。