馮靜 李莉

(1海口市人民醫(yī)院，海南 ?？?570208，2海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

不同程度腎功能損害是慢性腎衰竭的主要病因，炎癥細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，炎癥介質(zhì)又可趨化、激活炎癥細(xì)胞〔1〕。炎癥介質(zhì)可通過(guò)收縮或舒張血管影響腎臟局部的血流動(dòng)力學(xué)，通過(guò)影響細(xì)胞的增殖、自分泌和旁分泌，從而介導(dǎo)炎癥損傷及其硬化病變〔2〕。持續(xù)炎癥狀態(tài)會(huì)參與慢性腎部疾病的足細(xì)胞損傷，隨著病情的加重，炎癥狀態(tài)就嚴(yán)重，并且能夠增加心血管疾病和感染等并發(fā)癥的發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。β微球蛋白(β2M)是由100個(gè)氨基酸殘基組成，是構(gòu)成細(xì)胞膜上組織相容性抗原的一部分〔3〕。相關(guān)研究表明炎癥、風(fēng)濕性疾病、腫瘤和肝臟類(lèi)疾病可能促使β2M合成增加〔4〕?；ㄉ南┧?AA)是人體分布比較廣泛的脂肪酸，生物活性較強(qiáng)，是人體炎癥和氧化應(yīng)激活性物質(zhì)代謝的主要組成部分。相關(guān)研究顯示，AA與早期胰島素抵抗的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切〔5〕。白三烯(LT)B4與血栓素(TX)A2是較為常見(jiàn)的AA代謝物，目前關(guān)于β2M和AA代謝物在腎功能衰竭炎癥反應(yīng)中的相關(guān)報(bào)道較少，所以本研究深入探討β2M、LTB4與TXA2對(duì)老年大鼠慢性腎臟疾病炎癥反應(yīng)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康的老齡SD大鼠20只，月齡18 w，體重500～650 g，SPF 級(jí)，購(gòu)自南京君科生物工程有限公司〔SCXK(蘇)2019-0001〕，飼養(yǎng)在海南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔SCXK(瓊)2019-0007〕，在消過(guò)毒的獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)籠具(IVC)籠內(nèi)中飼養(yǎng)，光照和黑暗交替12 h，溫度40%～55%，濕度21～25℃,每個(gè)籠中5只，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物管理使用委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC-2019-013-09)，在飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中嚴(yán)格貫徹3R原則。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組5只，分別為對(duì)照組〔注射1 mg/kg脂多糖(LPS)〕、β2M抑制劑組〔注射1 mg/kg LPS+二肽基肽酶(DPP)-4抑制劑5 mg/kg〕、AA抑制劑組(注射1 mg/kg LPS + HET0016 20 mg/kg)和β2M+AA抑制劑組(注射1 mg/kg LPS+DPP-4抑制劑 5 mg/kg + HET0016 20 mg/kg)。

1.2主要試劑和儀器 β2M抑制劑購(gòu)自北京百奧博科技有限公司；CYP4A 抑制劑(HET0016)購(gòu)自上海工碩生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海語(yǔ)純生物科技有限公司；谷胱甘肽過(guò)氧化物(GSH-PX)酶檢測(cè)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、活性氧(ROS)初級(jí)熒光測(cè)定試劑盒檢測(cè)購(gòu)自南京建成生物工程研究所；髓過(guò)氧化物酶(MPO)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；鼠抗β2M抗體 、鼠抗LTB4抗體、鼠抗TXA2抗體、兔抗單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1抗體、兔抗P-P65抗體、磷酸化核因子κB抑制蛋白(P-IKB)α抗體、鼠抗P65抗體和鼠抗磷酸化IκB激酶(P-IKK)β抗體購(gòu)自美國(guó) Promega 公司；鼠抗白細(xì)胞介素(IL)-1β抗體、鼠抗IL-6抗體和鼠抗腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自美國(guó)Coming Costar公司；蛋白電泳儀美國(guó)ABI公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物模型建立 大鼠腹腔注射LPS，按照體重每天1 mg/kg，連續(xù)注射8 w，在第一次注射LPS前2 d，通過(guò)腹腔給藥DPP-4抑制劑和HET0016，β2M抑制劑組大鼠注射DPP-4抑制劑，按照體重每天5 mg/kg，AA抑制劑組大鼠注射HET0016，按照體重每天20 mg/kg，β2M+AA抑制劑組大鼠注射DPP-4抑制劑5 mg/kg 和HET0016 20 mg/kg，直到第8周處死大鼠，在第8周收集腎皮質(zhì)組織，進(jìn)行下一步分析。

1.3.2Western印跡檢測(cè)β2M 、LTB4、TXA2、MCP-1、P-P65和P-IKBα、P65和P-IKKβ蛋白 取大鼠腎組織，加入蛋白裂解液制成勻漿，然后進(jìn)行離心處理，提取組織中總蛋白測(cè)定濃度,在100 V對(duì)總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白樣品采用Bradford法定量,將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用10%的山羊血清，封閉0.5 h，分別加入一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌，二抗孵育2 h，GAPDH作內(nèi)參，用 Image J 分析軟件檢測(cè)條帶灰度值，檢測(cè)β2M LTB4 與TXA2、MCP-1、P-P65和P-IKBα、P65和P-IKKβ蛋白表達(dá)。

1.3.3PAS染色觀察大鼠腎組織病理學(xué)變化 取大鼠腎組織，切片、脫蠟，在使用1%高碘酸鈉水溶液氧化20 min，PBS沖洗3次后，在使用Shiff 液染色30 min，染色后，經(jīng)過(guò)蒸餾水分化5 min，蘇木素染色20 s，以濃度為1%的鹽酸乙醇分化10 s，PBS沖洗后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，采用中性樹(shù)膠進(jìn)行封固，鏡下觀察。

1.3.4免疫氧化相關(guān)指標(biāo)SOD、CAT、GSH-PX、ROS、MPO和MDA檢測(cè) 將大鼠腎組織制備成10%的組織勻漿，采用SOD檢測(cè)試劑盒檢測(cè)SOD活性，采用GSH-PX酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)GSH-PX活性，采用CAT檢測(cè)試劑盒檢測(cè)CAT和MDA活性，采用初級(jí)熒光測(cè)定試劑盒檢測(cè)ROS活性,使用MPO檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MPO含量，所有操作均按照試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行嚴(yán)格操作。

1.3.5免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平 將腎組織脫蠟，進(jìn)行烤片處理，將熱玻片放入二甲苯中處理2次，每次10 min，無(wú)水乙醇2次，每次5 min，H2O2阻斷20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，將玻片置于0.01 mol/L枸椽酸中修復(fù)液,微波修復(fù)2次,冷卻后，PBS沖洗3次，將非免疫血清滴加于玻片上置37℃恒溫箱孵育30 min,抹干切片后,滴加特異性抗體，恒溫箱孵育20 min,過(guò)夜，滴加標(biāo)記的二抗,恒溫箱孵育，再將二氨基聯(lián)苯胺(DAB)液體滴加到切片上，直到染色滿意后為止，染色后用自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染,脫水烘干后用中性樹(shù)膠封片,光鏡下觀察切片染色情況并攝影。觀察IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。

2 結(jié) 果

2.1大鼠腎組織中β2M和AA代謝物水平對(duì)比 模型組β2M 、LTB4與TXA2蛋白水平明顯高于對(duì)照組(均P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

2.2β2M和AA代謝物抑制劑對(duì)大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)的影響 PAS染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組明顯的腎小球硬化，而經(jīng)過(guò)β2M和AA抑制劑處理過(guò)的β2M抑制劑組和AA抑制劑組腎小球硬化改善明顯，經(jīng)過(guò)β2M和AA抑制劑共同處理后β2M+AA抑制劑組腎小球硬化改善更為顯著，見(jiàn)圖2。

2.3β2M和AA代謝物抑制劑對(duì)大鼠腎臟免受氧化損傷影響 與對(duì)照組相比，β2M抑制劑組和AA抑制劑組SOD、CAT和GSH-PX蛋白水平顯著升高(P<0.05)，與β2M抑制劑組和AA抑制劑組相比，β2M+AA抑制劑組SOD、CAT和GSH-PX蛋白水平升高更為明顯(P<0.05)；與對(duì)照組相比，β2M抑制劑組和AA抑制劑組中的ROS、MPO和MDA蛋白水平顯著降低(P<0.05)，與β2M抑制劑組和AA抑制劑組相比，β2M+AA抑制劑組中的ROS、MPO和MDA蛋白水平降低更為明顯(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 Western印跡檢測(cè)各組β2M 、LTB4與 TXA2蛋白表達(dá)

表1 各組腎組織中β2M、LTB4和TXA2的表達(dá)

圖2 各組腎臟病理形態(tài)學(xué)情況(PAS染色，×200)

表2 各組腎臟免受氧化損傷各指標(biāo)水平表達(dá)

2.4β2M和AA代謝物抑制劑對(duì)大鼠腎臟炎癥的影響 與對(duì)照組相比，β2M抑制劑組和AA抑制劑組中的IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平顯著降低(P<0.05)，與β2M抑制劑組和AA抑制劑組相比，β2M+AA抑制劑組中的IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平降低更為明顯(P<0.05)，β2M抑制劑組和AA抑制劑組中的IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平對(duì)比無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表3、圖3。

表3 各組腎臟炎癥情況對(duì)比

圖3 各腎臟炎癥情況(免疫組化學(xué)染色，×200)

2.5β2M和AA代謝物抑制劑對(duì)大鼠腎臟相關(guān)蛋白表達(dá) β2M抑制劑組和AA抑制劑組中MCP-1、P-P65和P-IKBα蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，β2M+AA抑制劑組中MCP-1、P-P65和P-IKBα蛋白水平明顯低于β2M抑制劑組和AA抑制劑組(P<0.05)，β2M抑制劑組和AA抑制劑組中MCP-1、P-P65和P-IKBα蛋白水平對(duì)比無(wú)顯著差異(P>0.05)；4組P65蛋白水平無(wú)顯著差異(P>0.05)；β2M抑制劑組和AA抑制劑組P-IKKβ蛋白水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，β2M+AA抑制劑組中P-IKKβ蛋白水平明顯高于β2M抑制劑組和AA抑制劑組(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表4。

1～4：對(duì)照組,β2M抑制劑組,AA抑制劑組,β2M+AA抑制劑組圖4 各組腎臟組織的相關(guān)蛋白表達(dá)

表4 各組腎臟組織相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

據(jù)估計(jì)全世界慢性腎臟疾病的患病率為8%～16%〔6〕。目前，沒(méi)有單一的治療方法來(lái)改善慢性腎臟疾病患者的腎功能，腎功能的持續(xù)惡化會(huì)發(fā)展為腎衰竭〔7〕，因此，找到有效的治療方法仍然是當(dāng)務(wù)之急。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是慢性腎臟疾病發(fā)生和發(fā)展的共同特征和主要介質(zhì)，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及炎癥介質(zhì)的釋放是腎臟損傷的發(fā)生和發(fā)展的始動(dòng)因素〔8〕，氧化應(yīng)激的持續(xù)性會(huì)伴有炎癥反應(yīng)的發(fā)生，因此控制相關(guān)發(fā)生因素可能是治療慢性腎臟疾病的藥物靶點(diǎn)。

β2M是人體核細(xì)胞產(chǎn)生的一種大分子蛋白，當(dāng)β2M在體內(nèi)產(chǎn)生量恒定時(shí)，易于腎小球?yàn)V過(guò)〔9〕。LTB4與TXA2是慢性腎臟疾病患者體內(nèi)中間代謝產(chǎn)物，LTB4與TXA2水平的變化極容易導(dǎo)致腎臟局部缺血發(fā)生紊亂〔10〕，相關(guān)研究報(bào)道，LTB4與TXA2在血管平滑肌中促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔11〕。本研究結(jié)果提示慢性腎臟疾病的大鼠中β2M、LTB4與TXA2蛋白水平明顯高于正常大鼠的水平，所以說(shuō)β2M、LTB4與TXA2可能是衡量慢性腎臟疾病比較重要的指標(biāo)。相關(guān)研究表明，當(dāng)體內(nèi)β2M水平顯著升高時(shí)，證明腎功能對(duì)該物質(zhì)的代謝量降低〔12〕。所以說(shuō)明β2M、LTB4與TXA2分泌過(guò)多對(duì)腎臟產(chǎn)生不利的影響。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致腎損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，慢性腎臟疾病中ROS的增加會(huì)伴隨著腎臟內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的損傷〔13〕。以前的藥理學(xué)研究集中在防止ROS的產(chǎn)生，或者增加細(xì)胞的抗氧化劑〔14〕，然而，這些方法受到各種復(fù)雜因素的限制，還有待于進(jìn)一步的研究。腎組織產(chǎn)生過(guò)多的ROS會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，增殖組織水腫和血管的滲透性〔15〕。酶和非酶系統(tǒng)是ROS的內(nèi)源性防御機(jī)制，ROS產(chǎn)生過(guò)量和抗氧化能力的降低引起腎損傷的惡化〔16〕。SOD和CAT是腎臟中的中性粒細(xì)胞活化通過(guò)炎性因子以及ROS釋放，能夠促進(jìn)腎損傷和遠(yuǎn)隔器官的損傷〔17〕。SOD催化超氧化物自由基，保護(hù)細(xì)胞不受ROS侵害。GSH-PX是一個(gè)硒蛋白家族，負(fù)責(zé)將其他有機(jī)過(guò)氧化物轉(zhuǎn)化為水和氧〔18〕。CAT是一種常見(jiàn)的抗氧化酶，大量存在于肝臟、肺和腎臟中，CAT通過(guò)降解過(guò)氧化氫，在保護(hù)生物免受ROS氧化損傷方面發(fā)揮重要作用〔19〕。本研究結(jié)果說(shuō)明有效抑制β2M、LTB4與TXA2水平，能夠降低氧化應(yīng)激的產(chǎn)生和相關(guān)因子的釋放，從而緩解氧化應(yīng)激對(duì)腎損傷的影響。

過(guò)度的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，炎癥反應(yīng)也是腎損傷的重要生理過(guò)程〔20〕。MCP-1是一種趨化因子，趨化和激活巨噬細(xì)胞趨化和激活，促進(jìn)IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥物質(zhì)大量分泌，損傷局部和遠(yuǎn)程組織〔21〕?？紤]到通過(guò)DPP-4和HET0016可以顯著下調(diào)ROS水平，就能夠減少I(mǎi)L-1β、IL-6和TNF-α等炎癥物質(zhì)大量的釋放，它有效地中和活性氧并幫助排毒有毒化學(xué)物質(zhì)，抑制NF-κB核易位的磷酸化，調(diào)節(jié)MCP-1、P-P65、P-IKKβ和P-IKBα水平，阻礙炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

綜上，β2M、LTB4和TXA2有可能成為慢性腎炎的生物標(biāo)志物，抑制β2M、LTB4和TXA2，有助于增加抗氧化物的含量，來(lái)減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低炎癥反應(yīng)，從根本上防止慢性腎臟疾病的進(jìn)一步損傷，同時(shí)為臨床上防治慢性腎臟疾病的進(jìn)一步發(fā)展提供新的藥物作用靶點(diǎn)。