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        秀珍菇上一種黏菌的鑒定及其防治初探

        2023-03-22 04:21:00胡積祥蔣穎潔張俊喜
        食用菌 2023年1期
        關鍵詞:黏菌珍菇燕麥片

        胡積祥 徐 明 高 波 王 凡 蔣穎潔 張俊喜*

        (1江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所,江蘇鹽城 224002;2鹽城市雨露農(nóng)業(yè)科技有限公司,江蘇鹽城 224002)

        秀珍菇即肺形側耳Pleurotus pulmonarius[1],是一種深受消費者喜食的高蛋白低脂肪的食用菌,具有極高的營養(yǎng)價值及得天獨厚的抗病養(yǎng)生功效。秀珍菇的多糖具有抗炎[2]、鎮(zhèn)痛[3]、降血壓[4]和控制糖尿病[5]的療效,對肝癌具有預防和化療增效作用[6],可以改善因飲食高脂肪而造成的腦海馬區(qū)域的損害和失憶現(xiàn)象[7];其漆酶可用于紡織工業(yè)中染料的脫色[8]、食品和飼料中真菌毒素的解毒[9]、土壤修復中清除二噁英、呋喃等有毒化學物質(zhì)[10]。

        近幾年,江蘇省秀珍菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展較快,年栽培量至少2 000 萬袋,主要分布在常州、淮安、連云港、泰州和鹽城等市,其中鹽城市達100萬袋以上,年產(chǎn)值1 億元以上。栽培秀珍菇往往是在全年氣溫較高時6-9 月出菇,因此除極易受木霉、菇蠅和菇蚊[11]等為害外,還時常遭受黏菌的侵害。出菇棚一旦出現(xiàn)黏菌,如不采取有效防治措施,產(chǎn)量將遭受毀滅性的損失。

        2018 年,江蘇省鹽城市秀珍菇菇棚內(nèi)出現(xiàn)一種黏菌,該菌吞噬秀珍菇的菌絲和子實體,且生長和擴展迅速,水解膠化菇體能力強,一旦子實體被感染,72 h 內(nèi)將變?yōu)橐粩傸S色的膠狀水。據(jù)2022 年的調(diào)查,鹽城市秀珍菇菇棚的產(chǎn)量因其損失近三分之一,給當?shù)氐纳a(chǎn)者造成了巨大的經(jīng)濟損失。為此,筆者對該黏菌進行純化分離和鑒定,初步探討了一種防治方法,以期為防控秀珍菇黏菌提供一定參考。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        (1)培養(yǎng)基

        燕麥瓊脂培養(yǎng)基:1 L 蒸餾水中加30 g 燕麥片,煮沸1 h 后用三層紗布過濾,取濾液加入20 g 瓊脂粉,加熱溶解后定容1 L,121 ℃滅菌20 min。

        (2)供試菌株

        黏菌YCTH 于2022年6月采自鹽城市亭湖區(qū)南洋鎮(zhèn)月青村,雨露農(nóng)業(yè)科技有限公司的菇棚。

        (3)主要試劑和藥劑

        2× 超 光 速PCR mix(MF848)、M5 HiClear DL2000 plus DNA marker(MF026)、M5 HiPure Agarose 瓊脂糖(MF103)和M5 HiPure Gelred 核酸染料(MF079)均購自北京聚合美生物科技有限公司;十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、氯仿、異丙醇和乙醇均為國產(chǎn)分析純;二氧化氯消毒片(規(guī)格為100 g:12.0 g),由南京水立美生物科技有限公司生產(chǎn)。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 菌株分離和培養(yǎng)

        利用黏菌的移動性,挑取受害菌蓋上的黃色原生質(zhì)體至燕麥瓊脂培養(yǎng)基平板中心,于24 ℃黑暗培養(yǎng)24 h 后,切取最前段純凈的菌絲體至新的燕麥瓊脂培養(yǎng)基平板上,如此重復移切,直到菌株純化。此后每兩天向平板中撒約0.5 g 無菌燕麥片覆蓋部分培養(yǎng)基,并加無菌水濕潤燕麥片。

        1.2.2 菌株分子鑒定

        刮取培養(yǎng)基平板中燕麥片上的原生質(zhì)體,以CTAB 法提取其基因組總DNA;利用引物ITS-F(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS-R(TCCTCC GCTTATTGATATGC)PCR 擴增黏菌ITS 序列[12],其中PCR 擴增體系和程序參照試劑說明書,退火溫度為45 ℃。PCR 產(chǎn)物委托北京六合華大基因科技有限公司進行測序,測序結果在NCBI 上進行Blast 檢索,下載同源性較好的序列后利用MEGA 11中最大似然法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,重復1 000 次,其他參數(shù)默認。其中序列比對采用內(nèi)嵌程序ClustalW,外群菌株選擇為鱗鈣皮菌,GenBank 中登錄號為HQ450508.1。

        1.2.3 二氧化氯防治試驗

        參照盧成苗等[13]采用室內(nèi)層架式栽培‘臺秀57’,棚中鐵架長3.5 m,寬0.6 m,高3 m,分三層,每層80 袋。聚丙烯塑料袋的規(guī)格為17 cm × 33 cm ×0.005 cm;培養(yǎng)料為雜木屑72%,麩皮20%,玉米粉5%,石膏粉1.5%,石灰1.5%。

        將10 g 二氧化氯消毒片投入1 kg 水中,稀釋成0.12%(質(zhì)量比)的工作液。當秀珍菇的菌蓋長至約3 cm,菌柄2 cm 時,選取鐵架中層最上面的20 個菌袋;將帶菌的燕麥片貼在菌蓋上近菌柄處的一側,每個菌袋處理2~3 個菌蓋;6 h 后將這些菌袋縱向割開,一半噴清水作為對照,另一半與同一菇架上的其他菌袋一起噴(霧狀)二氧化氯工作液,此時對照組用塑料袋短暫遮蓋;12 h 后測量菌蓋上黏菌原生質(zhì)體前端離燕麥片的距離,即遷移距離。

        2 結果與分析

        2.1 為害特征

        堆料被黏菌侵染后,料面會出現(xiàn)鮮黃色的扇面形膠狀體,其多分枝而脈絡狀。菇棚內(nèi)的菌袋黏菌侵染后,開口處培養(yǎng)料和秀珍菇菌絲表現(xiàn)為濕腐;子實體受害時,菌柄、菌褶和菌蓋逐漸被黏菌全覆蓋,導致整個子實體腐爛,散發(fā)一股酸臭味(圖1a和圖1b)。隨之,腐爛膠體掉落到下層的菌袋上,直接引起新一輪的侵害,而掉落到地面上的黃色原生質(zhì)團也會主動遷移至距離地面最近的菌袋(圖1d)。因此,菇架底部的菌袋一般受害最嚴重。受害菌袋若不及時消毒處理,會縮水變褐,不再出菇,但光禿禿的菌袋上也不產(chǎn)生黏菌的繁殖體(圖1c)。

        圖1 黏菌為害秀珍菇癥狀

        筆者5 年的調(diào)查發(fā)現(xiàn),該黏菌畏光。將受害菌棒置于陽光下暴曬,菌棒上的黏菌原生質(zhì)體由黃色變?yōu)楹稚?,其侵害速度變緩,甚至死亡。秀珍菇出首潮菇時,一般不會出現(xiàn)該黏菌,2018 年第4~第5潮發(fā)病,2019—2021 年第3~4 潮菇發(fā)病,2022 年第2潮菇發(fā)病。

        2.2 菌株培養(yǎng)特征

        在燕麥瓊脂培養(yǎng)基上,該黏菌形成黃色扇形結構的原生質(zhì)團,前緣加厚,具有遷移、融合和吞噬等特征,有特殊的芳香氣味,后期黃色更亮,氣味更濃。原生質(zhì)團在遷移過程中形態(tài)不斷發(fā)生變化,可以形成管狀形態(tài)和網(wǎng)狀結構(圖2)。這些特征與史立平等[14],谷碩等[15]報道的多頭絨泡菌Physarum polycephalum較吻合,因此初步判定該黏菌為絨泡菌屬Physarum中的一個成員。

        圖2 黏菌在燕麥瓊脂培養(yǎng)基中生長1 d(a)、4 d(b)和6 d(c)的形態(tài)特征

        2.3 菌株分子鑒定

        2.3.1 ITS序列PCR擴增

        1%瓊脂糖凝膠電泳顯示,樣品的PCR 產(chǎn)物在500~750 bp 處有一條較亮的特異性條帶(圖3),大小符合預期,表明ITS 序列片段被成功擴增,盡管CK(以水為模板)在500 bp 以下有一條非特異性條帶。

        圖3 菌株的ITS序列擴增結果

        2.3.2 ITS序列分析

        測序結果顯示ITS 擴增片段為840 bp 的rDNA序列(GenBank 登錄號:OQ085095)。將該序列在NCBI GenBank 中進行Blast 檢索,結果顯示其與數(shù)據(jù)庫中的多頭絨泡菌的序列同源性最高,與序列V01159.1、M13612.1 在覆蓋區(qū)域內(nèi)的相似性分別為99.66%、100%,且系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示它與V01159.1 聚為一簇(圖4)。因此,最終將該菌株鑒定為多頭絨泡菌。

        圖4 基于ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

        2.4 二氧化氯防效

        噴施二氧化氯溶液后黏菌在秀珍菇菌蓋上的平均遷移距離為1.62 cm,而清水對照為2.66 cm,相差1 cm 左右,因此噴施二氧化氯溶液可以顯著降低黏菌在菌蓋的遷移距離,即減緩黏菌對菌蓋的吞噬速度(圖5)?;诙趸仁且环N廣譜和高效的滅菌劑,試驗結果最終表明0.12%二氧化氯對該黏菌病具有一定的防效。

        圖5 噴施二氧化氯后黏菌的遷移距離

        3 結論與討論

        通過觀察菇棚內(nèi)黏菌為害秀珍菇癥狀,并對黏菌菌株進行分離與純化培養(yǎng)以及黏菌ITS 序列的分析,最終確定為害鹽城市秀珍菇的黏菌為多頭絨泡菌。該菌常見于林中朽木及落葉,在人工培養(yǎng)基中生長迅速,固體培養(yǎng)基中能順利完成生活史[15],在液體培養(yǎng)基中可形成微原生質(zhì)團[16]。該菌因其智慧的覓食方式、微原生質(zhì)團細胞核分裂的一致性和無細胞壁的特征,常常被當作一種重要的試驗材料,用于研究群體智能和真核細胞周期以及細胞分化與發(fā)育等。但鮮為人知的是,該菌也為害食用菌,且相關文獻報道較少。

        黏菌是一類特殊的真核生物,營養(yǎng)階段的構造、運動和攝食方式與變形蟲相似,具有動物特征,而繁殖體為子實體,此時又具有菌物的特性。若從菌物角度出發(fā),黏菌與宿主之間的侵染關系顯然不符合科赫法則,算不上一種病原物,只是表面上的腐生物,因此不受關注。然而從近些年的文獻報道來看,一些黏菌在活體植物[17-19]和食藥用菌上的為害還是很嚴重。植株表面一旦被黏菌覆蓋,光合作用受阻,輕則導致生長不良,產(chǎn)量和品質(zhì)降低,重則幼苗和植株直接枯死。而食用菌一旦感染黏菌,食用菌子實體腐爛,失去商品價值或變?yōu)橐粩偰z狀水。隨著食用菌栽培模式由原來的季節(jié)性逐漸變?yōu)橹苣晷?,個體農(nóng)戶生產(chǎn)轉變?yōu)槠髽I(yè)規(guī)模生產(chǎn),早期菇棚也成為老菇棚,黏菌病害勢必逐漸加重。因此,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中要重視黏菌病害的預防,尤其是食用菌。

        二氧化氯消毒劑是一種高效低毒低殘留的廣譜消毒劑,在食用菌栽培中除常用來熏蒸消毒接種室、培養(yǎng)室以及出菇房外,還可以用于防治競爭性雜菌和食用菌病害。據(jù)文獻報道,低至0.375 mg/L的二氧化氯可有效地抑制褐斑病病原菌托拉斯假單胞桿菌的生長(抑制率>95%),且此體積質(zhì)量濃度對平菇、金針菇、雙孢蘑菇、香菇和杏鮑菇的菌絲生長不影響[20];采用25 mg/L、50 mg/L、50 mg/L 的二氧化氯分別處理綠色木霉、擬康氏木霉、青霉的孢子,10 min 就可將其徹底滅活[21]。研究結果表明,噴霧0.12%的二氧化氯可以減輕多頭絨泡菌對秀珍菇的為害,并抑制其在菇棚內(nèi)的進一步擴展。但二氧化氯防治該病的最佳用藥濃度和方式、對秀珍菇生長的影響以及滅殺機理尚需進一步研究。

        致謝:吉林農(nóng)業(yè)大學劉淑艷教授在菌株的鑒定方面給予了詳細指導。

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