馬銀鵬 姜 威 張丕奇 戴肖東 周舒揚(yáng) 馬慶芳 劉佳寧 田 爽 朱加楠 張介馳 王天亮

（1黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱 150010；2黑龍江省科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150001）

黑木耳Auricularia heimuer是一種重要的食藥用真菌[1]，不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，還含有多糖、黑色素、腺苷等活性成分[2-4]，具有止咳化痰、抗氧化、降血脂、抗輻射等功效[5-6]。據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，黑木耳2021 年總產(chǎn)量712.3 萬(wàn)t，已成為我國(guó)第二大栽培食用菌。液體菌種的研究和使用促進(jìn)黑木耳產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展。傳統(tǒng)的固體菌種存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、菌齡不整齊、成本高、污染率高等問(wèn)題[7]。而液體菌種具有生產(chǎn)周期短、菌齡一致、成本低、發(fā)菌快且不易污染等優(yōu)點(diǎn)，是解決固體菌種不足的有效途徑之一[8]。因此，食用菌液體菌種的研究逐漸受到重視。

由于菌種特性、培養(yǎng)條件及其優(yōu)化方法等因素的差異，不同菌株的液體發(fā)酵條件差別較大[9]。范秀芝等[10]從22 個(gè)國(guó)審黑木耳品種中篩選出一株較優(yōu)的液體發(fā)酵高產(chǎn)菌株。王謙等[11]研究發(fā)現(xiàn)黑木耳液體發(fā)酵的最佳條件為接種量8%，培養(yǎng)基初始pH 5.0，培養(yǎng)溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min。錢雪晴等[12]優(yōu)化得到黑木耳液體菌種培養(yǎng)基配方：葡萄糖2.16%，牛肉粉0.48%，馬鈴薯15%，磷酸二氫鉀0.33%，硫酸鎂0.1%。因此，不同黑木耳菌株需要分別開(kāi)展液體發(fā)酵條件的優(yōu)化研究，從而獲得特定菌株的最佳液體發(fā)酵條件。

筆者以黑木耳1703為試驗(yàn)菌株，以菌絲體生物量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化液體發(fā)酵條件，為黑木耳液體菌種的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）供試菌株：黑木耳1703菌株，由黑龍江省科學(xué)院微生物研究所保藏和提供。

（2）供試培養(yǎng)基：黑木耳菌種活化采用PDA 培養(yǎng)基（土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，瓊脂粉18 g/L，pH 自然）。液體菌種培養(yǎng)采用PD 培養(yǎng)基（土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，維生素B10.001 g/L，pH自然）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化

將黑木耳1703菌株轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫避光培養(yǎng)10 d活化菌株。

1.2.2 液體菌種培養(yǎng)

用直徑1.0 cm的打孔器取相同菌齡活化菌株，接種（5塊菌種）于含有100 mL PD培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25 ℃、160 r/min培養(yǎng)7 d，用于液體發(fā)酵接種。

1.2.3 菌絲體生物量測(cè)定

液體發(fā)酵結(jié)束后過(guò)濾收集菌絲體，無(wú)菌水沖洗3次，80 ℃烘干至恒重，稱量菌絲體干重即為菌絲體生物量。

1.2.4 液體發(fā)酵條件單因素篩選試驗(yàn)

1.2.4.1 供試碳源的篩選試驗(yàn)

以PD 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入20 g/L 供試碳源果糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖，以碳源零添加為空白對(duì)照。接種5%液體菌種于含有100 mL 培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，置于25 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)7 d。以1.2.3 方法收集、烘干、稱量菌絲體。

1.2.4.2 供試氮源的篩選試驗(yàn)

以PD 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入5 g/L 供試碳源麩皮、（NH4）2SO4、豆粉、蛋白胨、酵母浸粉，以氮源零添加為空白對(duì)照，置于25 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)7 d。菌絲體收集、烘干、稱量同1.2.3。

1.2.4.3 接種量的篩選試驗(yàn)

液體菌種接種量分別為3%、5%、8%、10%、13%，置于25 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)7 d。菌絲體收集、烘干、稱量同1.2.3。

1.2.4.4 培養(yǎng)基初始pH的篩選試驗(yàn)

PD培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)整為5、6、7、8、9，置于25 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)7 d。菌絲體收集、烘干、稱量同1.2.3。

1.2.4.5 搖床轉(zhuǎn)速的篩選試驗(yàn)

搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為130 r/min、140 r/min、150 r/min、160 r/min、170 r/min，置于25 ℃、搖床培養(yǎng)7 d。菌絲體收集、烘干、稱量同1.2.3。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取葡萄糖（A）、蛋白胨（B）、培養(yǎng)基初始pH（C）三個(gè)因素，設(shè)3 因素3 水平L9（33）正交試驗(yàn)（表1）。以菌絲生物量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)極差分析法分析最佳液體發(fā)酵條件。進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的有效性。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均三次重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式呈現(xiàn)。采用SPSS 17 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析方法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 供試碳源的篩選結(jié)果

由圖1可知，當(dāng)碳源為葡萄糖或可溶性淀粉時(shí)，黑木耳（1703）菌絲體生物量最高，分別為0.537 g/100 mL、0.509 g/100 mL。單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、可溶性淀粉為碳源時(shí)與其他碳源的菌絲體生物量差異顯著（P＜0.05）。綜合考慮成本的因素，黑木耳液體發(fā)酵培養(yǎng)基以葡萄糖為最佳碳源。

圖1 碳源試驗(yàn)黑木耳（1703）菌絲體生物量比較

2.1.2 供試氮源的篩選結(jié)果

由圖2可知，當(dāng)?shù)礊榈鞍纂藭r(shí)，黑木耳（1703）菌絲體生物量最高，為0.520 g/100 mL。單因素方差分析結(jié)果，蛋白胨為氮源時(shí)與酵母浸粉、尿素的菌絲體生物量差異顯著（P＜0.05）；與硫酸銨、麩皮、對(duì)照組的菌絲體生物量差異不顯著（P＞0.05）。因此，黑木耳液體培養(yǎng)的最佳氮源為蛋白胨。

圖2 氮源試驗(yàn)黑木耳（1703）菌絲體生物量比較

2.1.3 接種量的篩選結(jié)果

由圖3 可以看出，隨著接種量的增加，黑木耳（1703）菌絲體生物量呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為8% 時(shí)，菌絲體生物量最高，為0.446 g/100 mL。單因素方差分析結(jié)果，接種量為8%與3%的菌絲體生物量差異顯著（P＜0.05）；與其他接種量的菌絲體生物量差異不顯著（P＞0.05）。因此，液體培養(yǎng)黑木耳菌絲體的最佳接種量為8%。

圖3 接種量試驗(yàn)黑木耳（1703）菌絲體生物量比較

2.1.4 培養(yǎng)基初始pH篩選結(jié)果

由圖4 可以看出，隨著培養(yǎng)基初始pH 的上升，黑木耳（1703）菌絲體生物量呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH 為6 時(shí)，菌絲體生物量最高，為0.467 g/100 mL。單因素方差分析結(jié)果，培養(yǎng)基初始pH為6時(shí)與培養(yǎng)基初始pH為8、pH為9的菌絲體生物量差異顯著（P＜0.05）；與培養(yǎng)基初始pH 為5、pH 為7 的菌絲體生物量差異不顯著（P＞0.05）。因此，黑木耳菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基最佳初始pH為6。

圖4 培養(yǎng)基初始pH試驗(yàn)黑木耳（1703）菌絲體生物量比較

2.1.5 搖床轉(zhuǎn)速篩選結(jié)果

由圖5 可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速的加快，黑木耳（1703）菌絲體生物量呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min 時(shí)，菌絲體生物量最高，為0.462 g/100 mL。因此，黑木耳菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)搖床最佳轉(zhuǎn)速為150 r/min。

圖5 搖床轉(zhuǎn)速試驗(yàn)黑木耳（1703）菌絲體生物量比較

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)和極差分析結(jié)果如表2 所示，根據(jù)極差分析結(jié)果可知，對(duì)黑木耳（1703）菌絲體生物量的影響次序?yàn)锳＞C＞B，即葡萄糖＞培養(yǎng)基初始pH＞蛋白胨，其中葡萄糖對(duì)菌絲體生物量影響最大。各因素的最優(yōu)組合為A2B2C2，即葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，培養(yǎng)基初始pH為6，菌絲體生物量最高。

表2 正交試驗(yàn)和極差分析結(jié)果

正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果如表3所示，葡萄糖、蛋白胨、培養(yǎng)基初始pH 均對(duì)黑木耳（1703）菌絲體生物量影響顯著（P＜0.05）。三個(gè)因素對(duì)菌絲體生物量影響次序?yàn)锳＞C＞B，即葡萄糖＞培養(yǎng)基初始pH＞蛋白胨。方差分析結(jié)果與極差分析結(jié)果一致。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

因此，黑木耳（1703）菌株液體發(fā)酵最佳條件為葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，培養(yǎng)基初始pH 為6，接種量8%，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。在此條件下重復(fù)三次，菌絲體生物量（干）為（0.542±0.103）g/100 mL，高于正交試驗(yàn)各組的菌絲體生物量，因此，該試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法可靠有效。

3 小結(jié)與討論

研究結(jié)果表明，黑木耳1703菌株液體發(fā)酵最佳條件為葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，培養(yǎng)基初始pH為6，接種量8%，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。

碳源和氮源是影響液體發(fā)酵菌絲體生物量的主要因素。試驗(yàn)結(jié)果表明黑木耳（1703）液體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源為葡萄糖，與肖彩霞[13]的研究結(jié)果一致，但是荊瑞勇等[14]研究發(fā)現(xiàn)黑木耳液體發(fā)酵最佳碳源為果糖。試驗(yàn)結(jié)果表明黑木耳液體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳氮源為蛋白胨，與馮小飛等[15]的研究結(jié)果一致，但是于海洋等[16]研究發(fā)現(xiàn)黑木耳液體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳氮源為酵母浸膏，謝意珍等[17]研究結(jié)果最佳氮源為麩皮。這可能與選用的黑木耳菌株有關(guān)。因此，對(duì)不同的黑木耳菌株液體發(fā)酵條件進(jìn)行篩選，以優(yōu)化獲得最佳的碳源、氮源。

結(jié)果表明，黑木耳（1703）液體發(fā)酵的最佳接種量為8%，培養(yǎng)基初始pH 為6，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。王晨等[18]研究發(fā)現(xiàn)黑木耳再生株Aa66液體培養(yǎng)適宜接種量為8%，與筆者研究結(jié)果一致。錢雪婷[19]采用響應(yīng)面法優(yōu)化秦巴山區(qū)黑木耳菌株耳261 的液體發(fā)酵pH 為5.85，與筆者研究培養(yǎng)基初始pH基本一致。

黑木耳液體發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，如多糖、多肽、酶、核酸、氨基酸、維生素等，因此利用液體發(fā)酵技術(shù)獲得代謝產(chǎn)物并研究其活性具有較好的發(fā)展前景[20]。試驗(yàn)所得黑木耳（1703）液體發(fā)酵條件僅是搖瓶培養(yǎng)結(jié)果，后續(xù)還需發(fā)酵罐放大試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。