王 藝，劉思思，張彤赫，黃儒強(qiáng)

（華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510631）

高良姜生長于熱帶、亞熱帶地區(qū)，為姜科植物，別名風(fēng)姜、小良姜、良姜等，在我國的廣東、廣西、海南等地都有分布[1]，其干燥根莖可以入藥，為藥食同源植物之一[2]，并且營養(yǎng)成分豐富?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明高良姜具有抗菌、抗氧化、散寒止痛等功效[3]。

近年來，多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，許多植物多糖具有多種生物活性[4]，如免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、降血脂和護(hù)肝等作用[5]。植物多糖可通過激活超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等抗氧化酶來有效地清除自由基[6]。研究發(fā)現(xiàn)，羅平小黃姜多糖清除DPPH 自由基的IC50為0.96 mg/mL[7]；生姜多糖清除DPPH 自由基的IC50值可達(dá)0.42 mg/mL[8]；大高良姜多糖質(zhì)量濃度與抗氧化能力呈相關(guān)性，其IC50分別為2.21 mg/mL 和2.15 g/mL[9]；高良姜多糖清除DPPH自由基有效質(zhì)量濃度（EC50） 為0.59±0.01 mg/mL，清除羥自由基EC50為0.05±0.003 g/L，螯合鐵離子能力的EC50為2.75±0.20 g/L[10]。

選取熱水提取法浸提高良姜多糖，以響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，以清除DPPH自由基及ABTS 自由基的能力和還原力為指標(biāo)評(píng)價(jià)高良姜多糖的抗氧化活性。旨在充分開發(fā)利用這一寶貴的藥食兩用保健植物，為豐富發(fā)掘應(yīng)用高良姜資源提供更多的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥高良姜根莖，購自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司提供；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SFG-02B600 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；5804 R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，艾本德中國有限公司產(chǎn)品；VIS-723N 型可見分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司產(chǎn)品；RE-52AAA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高良姜粗多糖的提取與純化

（1） 粗多糖的提取。熱水提取法[11]：粉碎干燥的高良姜，60 目過篩，得干粉。稱取一定量的干粉，根據(jù)液料比加入定量的蒸餾水，恒溫振蕩器中提取一定時(shí)間，抽濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到一定濃度，然后進(jìn)行醇沉，得粗多糖。

（2） 粗多糖除蛋白。采用Sevage 法[12]。

（3） 脫色。采用H2O2氧化法[13]。

1.3.2 多糖含量的測(cè)定

參考李承浩等人[14]的方法用苯酚- 硫酸法測(cè)定多糖含量。

1.3.3 高良姜粗多糖提取條件的優(yōu)化

（1） 單因素試驗(yàn)。稱取5.0 g 高良姜粉末，考查料液比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)高良姜多糖提取率的影響，重復(fù)試驗(yàn)3 次。

（2） 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。以單因素試驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，明確3 個(gè)因素變量的范圍，運(yùn)用Desing Expert 10.0 軟件進(jìn)行三因素三水平Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。每組做3 次平行試驗(yàn)，取平均值。

響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

根據(jù)公式擬合回歸方程，并對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析。

1.3.4 抗氧化活性測(cè)定

（1） DPPH 自由基清除活性的測(cè)定。參考Huang X Q 等人[15]的方法。

（2） ABTS 自由基清除活性的測(cè)定。參考張乃珣等人[16]的方法。

（3） 還原力的測(cè)定。參考Oyaizu M[17]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 高良姜多糖提取條件的優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

（1） 料液比對(duì)多糖提取率的影響。

料液比對(duì)多糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對(duì)多糖提取率的影響

由圖1 可知，高良姜多糖提取率在一定范圍內(nèi)與料液比呈正相關(guān)，可能是料液比的增大促進(jìn)了多糖的溶出。但當(dāng)料液比增至1∶40（W/V） 后，多糖的提取率增長趨于平緩，說明多糖大部分已溶出，此時(shí)提取過程已基本達(dá)到飽和。

（2） 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響。

提取溫度對(duì)多糖提取率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

由圖2 可知，當(dāng)提取溫度為50~90 ℃時(shí)，隨著提取溫度的升高，高良姜多糖提取率隨之明顯增大；而當(dāng)提取溫度為90~100 ℃時(shí)，多糖提取率沒有明顯變化。

（3） 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響見圖3。

由圖3 可知，當(dāng)提取時(shí)間為1.0~3.0 h 時(shí)，高良姜多糖提取率隨時(shí)間增長顯著增高；提取時(shí)長超過3.0 h 后，多糖提取率增加不再明顯，此時(shí)多糖已基本完全提取。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)因素水平表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

使用多元回歸擬合表2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到料液比、提取溫度、提取時(shí)間及多糖提取率（Y）的回歸方程如下：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析

該模型p＜0.000 1**達(dá)到極顯著水平，表明回歸方程模型具有高度顯著性；失擬項(xiàng)不顯著p=0.831 0（p＞0.05），表明該模型穩(wěn)定性較好；決定系數(shù)R2=0.989 4，表明高良姜多糖提取率約98.94%是由獨(dú)立變量決定的；校正決定系數(shù)R2Adj=0.975 8，變異系數(shù)CV=0.17%，表明該模型擬合度很高，能很好地模擬高良姜多糖真實(shí)提取率與各變量之間的關(guān)系。根據(jù)表3 回歸模型的系數(shù)進(jìn)行顯著性分析可知，在一次項(xiàng)中X1達(dá)到顯著水平（p＜0.05），X2、X3達(dá)到極顯著水平；在平方項(xiàng)中，各回歸系數(shù)均達(dá)到極顯著水平，表明高良姜多糖的提取率與3 個(gè)因素之間存在明顯的二次關(guān)系；交互項(xiàng)中X1X2、X1X3均未達(dá)到顯著水平，而X2X3的回歸系數(shù)則達(dá)到了極顯著水平，說明提取時(shí)間與提取溫度的交互作用對(duì)多糖的提取率有較大影響。

根據(jù)擬合回歸方程，固定料液比、提取溫度和提取時(shí)間中的任意一個(gè)因素為零水平，做出2 組交互項(xiàng)的響應(yīng)面圖，測(cè)驗(yàn)其對(duì)高良姜多糖提取率的效用。

料液比與提取溫度的交互效應(yīng)對(duì)高良姜多糖提取率影響的響應(yīng)面見圖4，液料比與提取時(shí)間的交互效應(yīng)對(duì)高良姜多糖提取率影響的響應(yīng)面見圖5，提取溫度與提取時(shí)間的交互效應(yīng)對(duì)高良姜多糖提取率影響的響應(yīng)面見圖6。

圖4 液料比與提取溫度的交互效應(yīng)對(duì)高良姜多糖提取率影響的響應(yīng)面

圖5 料液比與提取時(shí)間的交互效應(yīng)對(duì)高良姜多糖提取率影響的響應(yīng)面

圖6 提取溫度與提取時(shí)間的交互效應(yīng)對(duì)高良姜多糖提取率影響的響應(yīng)面

由圖4 ~圖5 可知，提取溫度、提取時(shí)間與料液比交互作用的響應(yīng)面曲面坡度較緩和，說明響應(yīng)值受各變量變化的影響較??；提取時(shí)間與提取溫度交互作用的響應(yīng)面曲面坡度較陡峭，隨著提取溫度的升高及提取時(shí)間的延長，多糖提取率呈現(xiàn)出先急劇增加后緩慢下降的趨勢(shì)，說明響應(yīng)值受變量變化的影響較大。當(dāng)提取溫度為90~100 ℃，提取時(shí)間為2.9~3.3 h 時(shí)，多糖提取率較高。這與表3 回歸模型系數(shù)所示含義相符合。

通過所得回歸模型對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件為料液比1∶40.71（W/V），提取溫度97.11 ℃，提取時(shí)間3.43 h，理論提取率為10.23%?？紤]實(shí)際操作情況，將最佳提取工藝修正為料液比1∶41（W/V），提取溫度97 ℃，提取時(shí)間3.5 h。在此修正條件下，實(shí)測(cè)提取率為10.28%，表明該回歸模型具有較可靠的預(yù)測(cè)性能，對(duì)于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的借鑒意義。

2.2 高良姜粗多糖純化結(jié)果（脫蛋白、脫色）

高良姜多糖經(jīng)Sevage 法脫蛋白后，按公式計(jì)算：

其脫色率為98.59%。

2.3 高良姜多糖抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH 自由基活性的檢測(cè)

自由基調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，并抑制病毒和細(xì)菌，但體內(nèi)自由基增多（包括超氧陰離子、過氧化氫和NO） 會(huì)導(dǎo)致T 細(xì)胞損傷、免疫功能下降和衰老[18]。抗氧化劑有助于人體對(duì)抗由自由基損傷引起的氧化應(yīng)激[19]。

高良姜多糖清除DPPH 自由基的能力見圖7。

圖7 高良姜多糖清除DPPH 自由基的能力

由圖7 可知，在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，高良姜多糖對(duì)DPPH 自由基的清除能力呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，且當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)到了90.0%。經(jīng)計(jì)算得高良姜多糖清除DPPH 自由基的EC50為1.412 mg/mL，由此可見高良姜多糖具有明顯清除DPPH 自由基的能力。

2.3.2 清除ABTS 自由基活性的檢測(cè)

高良姜多糖清除ABTS 自由基的能力見圖8。

圖8 高良姜多糖清除ABTS 自由基的能力

由圖8 可知，高良姜多糖對(duì)ABTS 自由基的清除能力具有劑量依賴性。在質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時(shí)，清除率最高為61.9%。計(jì)算得出高良姜多糖清除ABTS 自由基的EC50為4.33mg/mL。由此可知，高良姜多糖清除對(duì)ABTS 自由基清除能力較弱。多糖關(guān)于自由基的清除率可能與多糖的硫酸根含量、單糖組成和糖苷鍵類型有關(guān)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，影響生物活性多糖抗氧化活性的各種因素包括多糖偶聯(lián)物，粗多糖提取物中的多糖混合物、多糖螯合離子，富含金屬離子的多糖、多糖的化學(xué)修飾和多糖的結(jié)構(gòu)特征等。

2.3.3 還原力的檢測(cè)

高良姜多糖還原力見圖9。

圖9 高良姜多糖還原力

由圖9 可知，在質(zhì)量濃度為0.05~1.50 mg/mL時(shí)，高良姜多糖的還原力與質(zhì)量濃度表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL 時(shí)，還原力最強(qiáng)，吸光度達(dá)到0.976。

3 結(jié)論

初步研究了高良姜多糖提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化作用。結(jié)果表明，采用響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ湍茌^好的優(yōu)化熱水提取法提取高良姜多糖工藝，得到的較優(yōu)工藝條件為料液比1∶41（W/V），提取溫度97 ℃，提取時(shí)間3.5 h，在該工藝下實(shí)測(cè)得多糖提取率為10.28%。高良姜多糖清除DPPH 自由基和ABTS 自由基的EC50分別為1.412 mg/mL 和4.33 mg/mL，在一定程度上均表現(xiàn)出濃度依賴性。而有關(guān)高良姜多糖的結(jié)構(gòu)鑒定及抗氧化活性機(jī)理有待進(jìn)一步研究。