高 嘉，黃冀娜，李 珍(保定市第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北 保定 073000)

慢性心力衰竭(chronic heart failur，CHF)是由于心肌梗死、心肌病、血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷過(guò)重及炎癥等原因引起的心肌損傷，患者臨床表現(xiàn)主要為活動(dòng)或生氣時(shí)出現(xiàn)呼吸困難，還會(huì)出現(xiàn)消化不良、腹脹等癥狀[1-2]。川芎提取物是傘形科植物川芎根莖的提取物，可以抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞凋亡、改善血管收縮功能，治療心力衰竭[3-4]。Wnt信號(hào)通路可促進(jìn)核內(nèi)惡性腫瘤相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子，其功能最常見于胚胎發(fā)育和惡性腫瘤，決定細(xì)胞的分化命運(yùn)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路也參與心臟重要的生物學(xué)進(jìn)程，心臟受損后，Wnt/β-catenin信號(hào)促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的纖維化、瘢痕形成和有害心肌擴(kuò)張[5-6]。本研究將通過(guò)誘導(dǎo)大鼠CHF模型，探討川芎提取物對(duì)CHF大鼠的干預(yù)作用，并探究Wnt/β-catenin信號(hào)通路的變化，為臨床使用川芎提取物治療及輔助治療CHF提供分子基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雄性8～10周齡SPF級(jí)SD大鼠，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 儀器

Leica RM2015型切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；-80 ℃超低溫保存箱(美國(guó)Thermo公司)；4 ℃冰箱(合肥美菱股份有限公司)；SC-3610型低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；Western blot電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.3 藥品與試劑

川芎提取物購(gòu)自廣州朋遠(yuǎn)化工有限公司(批號(hào)：20150412，-20 ℃避光保存，使用時(shí)用2%吐溫80先溶解，再用0.9%氯化鈉溶液稀釋，終濃度為5 mg/mL；戊巴比妥鈉(批號(hào)：020919)購(gòu)自天津市申泰化學(xué)試劑有限公司；蘇木精(批號(hào)：H9627)、伊紅(批號(hào)：861006)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；去水平段極性蛋白3(Dvl3)抗體 (ab76081)、糖原合成酶激酶-3(GSKβ)抗體 (ab185141)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體(ab32572)和二抗(ab150113)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

2 方法

2.1 大鼠分組及飼養(yǎng)條件

8～10周齡雄性SD大鼠于SPF級(jí)鼠房飼養(yǎng)，室溫調(diào)節(jié)在(25±2)℃，相對(duì)濕度40%～65%，12 h/12 h晝夜交替照明，自由攝取食物和飲用水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后造模。

2.2 大鼠CHF模型的建立

大鼠稱重后按10%水合氯醛0.4 mL/100 g行腹腔注射麻醉，將大鼠以背位固定于鼠板上，氣管插管后將針形心電圖導(dǎo)聯(lián)電極刺入大鼠四肢，觀察并記錄心電圖，暴露左側(cè)胸腔，于左側(cè)第3—4肋間開胸，逐層分離筋膜、肌肉，打開大鼠胸膜，擠壓大鼠右側(cè)胸腔，托舉心臟，鈍性撕開心包膜，于距離左冠狀動(dòng)脈前降支起點(diǎn)2 mm處用縫線結(jié)扎前降支，并予以利多卡因注射液0.1 mL防止發(fā)生室性心律失常。結(jié)扎結(jié)束后縫合，觀測(cè)心電圖可見ST段明顯抬高，說(shuō)明結(jié)扎成功。造模后半量飼料饑餓喂養(yǎng)，并對(duì)大鼠進(jìn)行每日力竭式游泳1次[7]。

2.3 大鼠分組及給藥

隨機(jī)選擇CHF大鼠20只，分為模型組和實(shí)驗(yàn)組。取10只未造模大鼠作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組大鼠使用川芎提取物(100 mg/kg)干預(yù)，1日1次，連續(xù)干預(yù)4周。對(duì)照組和模型組大鼠分別給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。

2.4 大鼠心臟蘇木精-伊紅(HE)染色

取出各組大鼠心臟后，對(duì)組織進(jìn)行包埋后切片，進(jìn)行脫蠟覆水，以蘇木精染色5 min，5%乙酸1 min，伊紅染色1 min，脫水：70%、80%、90%和100%酒精各10 s，二甲苯1 min，通風(fēng)櫥自然晾干再封片，于顯微鏡下進(jìn)行檢查[8]。

2.5 大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察

取各組大鼠左室心尖心臟組織，置于4%戊二醛固定液中，固定后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，1%鋨酸固定，PBS清洗2次，脫水，包埋后制備心肌超薄切片，厚度50 nm，采用枸櫞酸鉛-醋酸鈾雙重染色后，經(jīng)透射電鏡觀察大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)[9]。

2.6 大鼠實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)心率及呼吸頻率檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)采用大/小鼠脈搏血氧呼吸監(jiān)護(hù)儀對(duì)各組大鼠心率及呼吸頻率進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)量時(shí)，保持室溫在22～26 ℃，每次測(cè)量前，打開大鼠固定裝置的電源開關(guān)，預(yù)熱15～20 min，達(dá)到設(shè)定溫度時(shí)加熱燈泡自動(dòng)熄滅，溫度下降時(shí)燈泡自動(dòng)開啟，維持加熱板在39～40 ℃；將待測(cè)大鼠放入預(yù)熱箱中固定，露出尾部，安裝袖帶及光電容積搏動(dòng)傳感器，檢測(cè)心率。呼吸頻率采用注射麻醉，仰臥固定，記錄呼吸頻率。

2.7 大鼠實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左心室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)檢測(cè)

大鼠麻醉采用5%戊巴比妥鈉(以0.9%氯化鈉溶液溶解過(guò)濾)麻醉 4 min后立即檢測(cè)；檢測(cè)：通過(guò)M型超聲心功能的測(cè)定儀檢測(cè)大鼠LVIDd、LVIDs、LVEF和LVFS。

2.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠心臟組織Dvl3、GSKβ和β-catenin蛋白的表達(dá)

對(duì)各組大鼠心臟進(jìn)行研磨，采用RIPA蛋白裂解液心臟細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，80 V、15 min，120 V、2 h，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)模120 V、2.5 h，TBST漂洗3次(每次10 min)，使用5%脫脂奶粉封閉，TBST漂洗3次(每次10 min)，加入一抗，二抗溫孵育后，TBST漂洗3次(每次10 min)，超敏化學(xué)發(fā)光液顯色，發(fā)光儀曝光、拍照[10-11]。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 CHF大鼠造模前后心電圖變化情況

大鼠CHF造模前心電圖表現(xiàn)為P波及PR間期明顯，R波降支與T波相交；大鼠CHF大鼠造模后心電圖顯示T波低平或倒置明顯，ST段較術(shù)前明顯抬高或下降(絕對(duì)值≥0.1 mV)，見圖1。

圖1 CHF大鼠造模前后心電圖比較Fig 1 Comparison of ECG in rats with chronic heart failure before and after modeling

3.2 CHF大鼠心臟HE染色比較

對(duì)照組大鼠心臟組織切片排列有序、細(xì)胞規(guī)則，心臟結(jié)構(gòu)完整，未見明顯細(xì)胞損傷；模型組大鼠細(xì)胞腫脹，心臟細(xì)胞邊界不清晰，模糊，心肌細(xì)胞受損傷嚴(yán)重；實(shí)驗(yàn)組大鼠心臟損傷相對(duì)于模型組有明顯改善，見圖2。

圖2 各組大鼠心臟HE染色情況比較(×200)Fig 2 Comparison of HE staining in heart of rats in each group (×200)

3.3 CHF大鼠心臟超微結(jié)構(gòu)比較

對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，胞核及胞膜清晰，明暗帶界限清，線粒體膜結(jié)構(gòu)清晰，數(shù)量豐富，基質(zhì)排列緊密，線粒體內(nèi)脊形態(tài)清晰可見，同時(shí)糖原顆粒完整，整體上細(xì)胞間質(zhì)也無(wú)水腫；模型組大鼠心肌排列紊亂，纖維斷裂、消失，細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)水腫，線粒體數(shù)量減少且腫脹，線粒體內(nèi)脊紊亂甚至消失；實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)較模型組均有改善，水腫有所減輕，糖原數(shù)量有所增加，線粒體空泡化相比與模型組有所改善，見圖3。

圖3 各組大鼠心臟超微結(jié)構(gòu)比較(×10 000)Fig 3 Comparison of cardiac ultrastructure of rats in each group(×10 000)

3.4 各組大鼠實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)心率及呼吸頻率比較

模型組大鼠的心率和呼吸頻率顯著高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠的心率和呼吸頻率顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)心率及呼吸頻率比較次/min)Tab 1 Comparison of heart rate and respiratory rate of rats in each group at the end of experiment

3.5 各組大鼠實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)LVIDd、LVIDs、LVEF和LVFS水平比較

模型組大鼠的LVIDd、LVIDs顯著高于對(duì)照組，LVEF、LVFS顯著低于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組大鼠的LVIDd、LVIDs顯著低于模型組，LVEF、LVFS顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)LVIDd、LVIDs、LVEF和LVFS水平比較Tab 2 Comparison of LVIDd、LVIDs、LVEF、LVFS in each group at the end of experiment

3.6 各組大鼠心臟組織Dvl3、GSKβ及β-catenin蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組相比，模型組大鼠Dvl3、GSKβ和β-catenin表達(dá)水平有上升趨勢(shì)；實(shí)驗(yàn)組大鼠Dvl3、β-catenin顯著高于對(duì)照組，而實(shí)驗(yàn)組相比于模型組有顯著下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

*P<0.05，**P<0.01；*P<0.05，**P<0.01圖4 各組大鼠心臟組織Dvl3、GSKβ及β-catenin的蛋白表達(dá)水平Fig 4 Protein expression levels of Dvl3, GSKβ and β-catenin in heart tissues of rats in each group

4 討論

CHF指持續(xù)存在的心力衰竭狀態(tài)，是各種病因所致心臟疾病的終末階段，其主要特點(diǎn)為呼吸困難、水腫和乏力，一般均有代償性心臟擴(kuò)大或肥厚及其他代償機(jī)制參與，常伴有靜脈壓升高導(dǎo)致的器官充血性病理改變，可有心房、心室附壁血栓和靜脈血栓形成，均可造成心肌結(jié)構(gòu)和功能的變化，最后導(dǎo)致心室泵血和充盈功能低下[12-13]。川芎常用于活血行氣、祛風(fēng)止痛，其提取物成分主要為川芎嗪、黑麥草堿、川哚、藁本內(nèi)酯和洋川芎醌等，具有辛散、解郁、通達(dá)及止痛等功能[14]。本研究通過(guò)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支和竭力式游泳建立大鼠CHF模型，并給予大鼠川芎提取物干預(yù)，探究川芎提取物對(duì)大鼠心力衰竭的干預(yù)作用。結(jié)果表明，川芎提取物可以顯著降低大鼠心臟組織的損傷，提高心肌組織線粒體結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。線粒體占心肌細(xì)胞中體積的35%～40%，心肌活動(dòng)所需95%的腺苷三磷酸(ATP)均由線粒體產(chǎn)生。本研究結(jié)果提示，川芎提取物可以逆轉(zhuǎn)線粒體受損，促進(jìn)維持線粒體正常功能，進(jìn)而部分恢復(fù)受損的心臟功能。本研究還發(fā)現(xiàn)，川芎提取物可以降低CHF引發(fā)的呼吸急促，緩解心率增快的病癥，穩(wěn)定大鼠的心肺功能。本研究通過(guò)進(jìn)一步比較LVIDd、LVIDs、LVEF和LVFS水平，證實(shí)了川芎提取物能夠改善大鼠心肌細(xì)胞收縮功能，起到恢復(fù)心臟功能、降低心臟損傷的作用。

Wnt/β-catetin信號(hào)通路是經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。Wnt/β-catetin由Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a和Wnt8激活，并參與轉(zhuǎn)化。Wnt信號(hào)可通過(guò)上調(diào)Caspase抑制劑Survivin等抗凋亡蛋白來(lái)阻止細(xì)胞凋亡，并通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子來(lái)刺激血管生成。一些能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，如供應(yīng)基質(zhì)裂解蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)7和MMP26，以及細(xì)胞黏附分子，如CD44和NrCAM，都是Wnt的靶基因，并且可以促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。心臟受損后，Wnt/β-catenin信號(hào)同時(shí)參與心臟成纖維細(xì)胞的纖維化、瘢痕形成和有害心肌擴(kuò)張，同時(shí)Wnt信號(hào)通路參與心肌梗死后心肌組織愈合過(guò)程的調(diào)控，參與心臟發(fā)育和心肌誘導(dǎo)分化等重要過(guò)程[15-16]。本研究結(jié)果表明，CHF大鼠的Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子Dvl3、GSKβ和β-catenin表達(dá)水平顯著升高，而川芎提取物干預(yù)后，Dvl3、GSKβ和β-catenin表達(dá)水平顯著降低；同時(shí)，川芎提取物干預(yù)后Dvl3、β-catenin水平仍高于對(duì)照組，而GSKβ水平與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示川芎提取物對(duì)Dvl3、β-catenin的調(diào)控作用弱于對(duì)GSKβ的調(diào)控作用。GSKβ是進(jìn)化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可以使磷酸基團(tuán)加到β-catenin氨基端的絲氨酸/蘇氨酸殘基上，磷酸化的β-catenin被蛋白酶體降解，從而導(dǎo)致β-catenin表達(dá)水平降低。總體上，本研究推測(cè)，川芎提取物可以逆轉(zhuǎn)CHF引發(fā)的Wnt/β-catenin激活，從而起到心臟保護(hù)作用。

綜上所述，川芎提取物對(duì)CHF大鼠的心臟有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與Wnt/catanin信號(hào)通路的抑制有關(guān)。