陳樂樂 徐迪靜 吳雋愷 王乙伊

(1. 寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波 315800；2. 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315800)

發(fā)酵酸菜營(yíng)養(yǎng)成分的動(dòng)態(tài)變化高度依賴于發(fā)酵過程中的微生物菌群[1]。乳酸菌能夠代謝蔬菜的化學(xué)成分，而這些微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的組合形成了最終產(chǎn)品的獨(dú)特風(fēng)味[2]。

發(fā)酵過程中，對(duì)腐敗和致病微生物的抑制主要取決于初始微生物群的存在、環(huán)境溫度、鹽和酸濃度以及pH值。食鹽的添加是酸菜生產(chǎn)中的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)[3-4]，其影響了發(fā)酵過程中微生物的結(jié)構(gòu)、代謝物的動(dòng)態(tài)變化和產(chǎn)品的感官品質(zhì)[5]。高濃度的鹽雖然可以抑菌防腐，但也會(huì)一定程度限制益生菌的活性和功能。Xiong等[6]研究表明，鹽在發(fā)酵初期也會(huì)對(duì)乳酸菌造成一定抑制作用。同時(shí)，高鹽攝入量也會(huì)增加健康風(fēng)險(xiǎn)[7]。Yang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，0.5%低鹽條件下腸膜明串珠菌ORC2和植物乳桿菌HBUAS51041還原糖利用更加充分，有機(jī)酸顯著積累，對(duì)酸菜的成熟有正面影響。He等[9]發(fā)現(xiàn)低鹽條件(0%～1%)有利于接種菌株LC-20的生長(zhǎng)和酸菜pH的降低。

植物乳桿菌是發(fā)酵益生菌菌屬中最常見的一種，在乳桿菌屬中因其高度靈活的基因組而具有非常好的生態(tài)位適應(yīng)能力，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味和質(zhì)地有顯著影響，是酸菜同型發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌群。Miriam等[10]利用植物乳桿菌降解了橄欖苦苷，消除了其所造成的特征苦味，改善了食用橄欖的風(fēng)味。嗜酸乳桿菌是發(fā)酵食品中具有高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的益生菌菌株，屬于同型發(fā)酵乳酸菌，可以在較強(qiáng)酸性條件下生長(zhǎng)，主要用于乳制品的開發(fā)。Kwaw等[11]發(fā)現(xiàn)接種植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵桑葚汁后，產(chǎn)品顏色更鮮艷。接種嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵桃汁后顯著增加了其超氧陰離子自由基清除活性和鐵還原能力等，提高了果汁的生物活性潛力和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[12]。

目前，有關(guān)無鹽發(fā)酵制品的研究較少，而在厭氧條件下利用功能菌強(qiáng)化發(fā)酵，使益生菌快速增殖成為優(yōu)勢(shì)菌[13]，通過產(chǎn)生有機(jī)酸所造成的低酸環(huán)境或其他代謝物來抑制有害菌的生長(zhǎng)是可實(shí)現(xiàn)的[14]。因此，研究擬采用無鹽并接種乳酸菌發(fā)酵酸菜，分析其發(fā)酵過程及低溫貯藏過程中的品質(zhì)變化規(guī)律，旨在為酸菜工藝的改進(jìn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硫酸錳、硫酸鎂、檸檬酸氫二鉀、2,6-二氯靛酚、抗壞血酸：分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；

牛肉膏、草酸：分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

氫氧化鈉：分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品：天津市津科精細(xì)化工研究所；

生化培養(yǎng)箱：SPX-150B型，上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

立式壓力高壓滅菌鍋：HVE-50型，上海申安醫(yī)療器械廠；

數(shù)顯攪拌水浴鍋：HH-4型，常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：HPG-9245型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；

電子天平：PL2002型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

高效液相色譜儀；1260型，美國(guó)安捷倫公司；

電子鼻：DM6型，日本INSENT公司；

電子舌：SA402B型，日本INSENT公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵工藝 250 g白菜切絲，接種450 μL乳酸菌(m植物乳桿菌∶m嗜酸乳桿菌為2∶1)，添加7.5 g玉米汁，發(fā)酵5 d，發(fā)酵成品于4 ℃保存60 d，每5 d對(duì)酸菜的pH值、總酸含量和亞硝酸鹽含量進(jìn)行檢測(cè)，并綜合感官評(píng)價(jià)，評(píng)估無鹽酸菜在常規(guī)冷藏條件下的穩(wěn)定性。

1.2.2 pH值測(cè)定 5.00 g酸菜與等量水混合勻漿，采用pH計(jì)測(cè)定。

1.2.3 總酸含量測(cè)定 按GB 12456—2021執(zhí)行。

1.2.4 亞硝酸鹽含量測(cè)定 按GB 5009.33—2016執(zhí)行。

1.2.5 還原糖含量測(cè)定 按GB 5009.7—2016執(zhí)行。

1.2.6 維生素C含量測(cè)定 按GB 5009.86—2016執(zhí)行。

1.2.7 有機(jī)酸含量測(cè)定 按GB 5009.157—2016執(zhí)行。

1.2.8 電子鼻分析 根據(jù)文獻(xiàn)[15]。

1.2.9 電子舌分析 根據(jù)文獻(xiàn)[16]。

1.2.10 感官評(píng)價(jià) 選取10名人員按表1對(duì)酸菜成品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

表1 無鹽酸菜成品感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)平行3次，采用Excel、SPSS statistics 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Origin 9.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化

2.1.1 pH值、總酸含量 由圖1可知，發(fā)酵初始pH值為6.11±0.04，發(fā)酵第1天，pH值迅速下降至3.55±0.02，并在發(fā)酵第2～5天內(nèi)逐漸下降至3.24±0.01。總酸含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，并在第5天達(dá)到(0.64±0.01) g/100 g。該無鹽酸菜表現(xiàn)出比傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜更高的酸化速度，大大縮短了生產(chǎn)時(shí)間。

圖1 發(fā)酵過程中pH值、總酸含量的變化Figure 1 Changes of pH value, total acid content during fermentation

2.1.2 亞硝酸鹽含量 由圖2可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳酸菌迅速增殖，產(chǎn)酸迅速，硝酸鹽還原菌被抑制，亞硝酸鹽被乳酸菌分解，因此，亞硝酸鹽含量明顯降低，最終達(dá)到(0.23±0.10) mg/kg。與傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜相比，無鹽酸菜中亞硝酸鹽含量較低，在整個(gè)發(fā)酵過程中未觀察到亞硝酸鹽峰。這是因?yàn)榛旌先樗峋诙虝r(shí)間內(nèi)相互作用快速產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，加快酸菜的發(fā)酵，但貯藏時(shí)間越長(zhǎng)，代謝產(chǎn)物會(huì)越多，則會(huì)導(dǎo)致其滋味刺鼻，色澤暗黃，質(zhì)地過軟等現(xiàn)象。綜上，無鹽條件下應(yīng)用混合乳酸菌(植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌)發(fā)酵可以有效提高酸菜的安全性[17]。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.3 還原糖、維生素C含量 由圖3可知，發(fā)酵過程中，還原糖含量顯著下降(P<0.05)，新鮮白菜中還原糖含量為(5.01±0.17) g/100 g，發(fā)酵第5天降至(0.57±0.01) g/100 g，消耗率達(dá)88.62%。發(fā)酵0～1 d，還原糖含量下降速率顯著高于發(fā)酵第1～5天的(P<0.05)，此過程中，pH值下降速率最快，總酸積累速率最快，表明乳酸菌在發(fā)酵0～1 d時(shí)對(duì)還原糖的利用更高效，同時(shí)，酸物質(zhì)的積累更迅速。隨著酸水平的不斷加深，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)限制逐漸加大，因此，發(fā)酵第1～5天，還原糖的利用速率有所下降。

無鹽酸菜發(fā)酵過程中，維生素C含量先急劇下降后緩慢下降，并在發(fā)酵成熟時(shí)達(dá)到(1.34±0.01) mg/100 g，與pH值的變化趨勢(shì)一致。與發(fā)酵第0天相比，發(fā)酵成熟時(shí)的維生素C含量下降了90%以上。維生素C屬于烯醇化合物，在無氧和CO2的作用下形成糠醛物質(zhì)，而羥基糠醛可聚合成褐色物質(zhì)影響產(chǎn)品色澤[19]。

圖3 發(fā)酵過程中還原糖、維生素C含量的變化Figure 3 Changes in reducing sugars and vitamin C content during fermentation

2.1.4 有機(jī)酸含量 由表2可知，乳酸和醋酸在發(fā)酵第0天未檢測(cè)到，說明這兩種有機(jī)酸在白菜基質(zhì)中不存在，而琥珀酸、草酸和檸檬酸在白菜基質(zhì)中少量存在。5種有機(jī)酸中，乳酸和草酸是無鹽酸菜發(fā)酵過程中的主要酸產(chǎn)物，與新鮮白菜相比，成熟無鹽酸菜中的乳酸和草酸含量分別增加了26.5，12.3倍。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，有機(jī)酸不斷積累，乳酸作為酸菜發(fā)酵過程中最主要的代謝產(chǎn)物，在整個(gè)發(fā)酵過程中含量增加得最為顯著，在第5天發(fā)酵成熟時(shí)達(dá)到最大值(26.523±0.170) mg/mL，是其他4種有機(jī)酸總量的2.4倍。草酸、醋酸和檸檬酸在發(fā)酵1 d后顯著增加(P<0.05)，并在后續(xù)發(fā)酵期間緩慢增加。相比之下，琥珀酸含量在發(fā)酵1 d后增加了0.434 mg/mL，隨后在1～5 d內(nèi)略有降低。

表2 發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量變化?

2.1.5 電子鼻分析

(1) 對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間酸菜的信號(hào)響應(yīng)：由圖4可知，4種樣品中，響應(yīng)強(qiáng)烈的傳感器為W1W和W5S，表明氮氧化合物、萜烯和有機(jī)硫化物可能對(duì)樣品的風(fēng)味作用較大；W3C、W6S和W5C的響應(yīng)值最低。各樣品的雷達(dá)圖形狀相似，表明4種樣品的香氣特征相似，但各種氣體的揮發(fā)強(qiáng)度存在較大差異。此外，發(fā)酵0 d的樣品響應(yīng)值明顯低于發(fā)酵5 d的，說明發(fā)酵對(duì)酸菜的風(fēng)味有較大影響。

圖4 電子鼻傳感器對(duì)樣品的雷達(dá)圖Figure 4 Radar map of sample by electronic nose sensor

(2) 主成分分析(PCA)：由圖5可知，PC1、PC2的貢獻(xiàn)率分別為99.85%，0.11%，總貢獻(xiàn)率>95%，表明4種樣品的氣味差異較大，因此，能夠區(qū)分不同發(fā)酵時(shí)期的酸菜。另外，發(fā)酵5 d的樣品與發(fā)酵3 d的樣品的數(shù)據(jù)點(diǎn)稍有重合，其他樣品數(shù)據(jù)點(diǎn)未有重合，說明風(fēng)味化合物在發(fā)酵初期變化明顯大于發(fā)酵后期，與酸含量變化趨勢(shì)相一致。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)期樣品的PCA分析

(3) 線性判別分析(LDA)：由圖6可知，判別式LD1、LD2的貢獻(xiàn)率分別為92.997%，6.729%，總貢獻(xiàn)率為99.726%。雖然在區(qū)分度上沒有PCA分析大，但是LDA圖在一定程度上也能表現(xiàn)出不同樣品間香氣差異的遠(yuǎn)近程度。發(fā)酵5 d的樣品與發(fā)酵3 d的樣品相距較近，表明二者氣味相近，與PCA分析結(jié)果一致。

圖6 不同發(fā)酵時(shí)期樣品的LDA分析Figure 6 LDA analysis of samples at different fermentation stages by electronic nose

2.1.6 電子舌分析 由圖7可知，通常情況下，酸味和咸味是酸菜的重要感官指標(biāo)，由于試驗(yàn)中未添加鹽分，故咸味在兩種樣品中無顯著差異。此外，酸味、鮮味在兩種樣品中差異顯著(P<0.05)，且這些感官特征在酸菜中表現(xiàn)更強(qiáng)烈，表明發(fā)酵有效提高了產(chǎn)品的感官品質(zhì)。

圖7 電子舌傳感器對(duì)樣品的雷達(dá)圖Figure 7 Electronic tongue sensor radar diagram of samples

2.2 低溫下貯藏穩(wěn)定性評(píng)估

2.2.1 基本理化指標(biāo) 由圖8可知，60 d的貯藏期內(nèi)，pH值整體無顯著變化，相應(yīng)的總酸含量也無明顯變化。貯藏期間，pH值為3.23～3.25，總酸含量為0.60～0.64 g/100 g，說明4 ℃冷藏條件下，酸菜中的腐敗菌未能大量增殖而造成有機(jī)酸的消耗，產(chǎn)品仍有效維持著較為穩(wěn)定的酸性體系。

圖8 低溫條件對(duì)無鹽酸菜pH值、總酸含量和亞硝酸鹽含量的影響

貯藏期間，酸菜中亞硝酸鹽含量整體降低，貯藏第60天，亞硝酸鹽含量顯著下降(P<0.05)，幾乎在樣品中未檢出，遠(yuǎn)低于GB 2762—2017的最高限值(20 mg/kg)。綜上，無鹽酸菜在4 ℃低溫條件下能夠較好地保留其良好的品質(zhì)特性，極大地降低了傳統(tǒng)酸菜中高鹽、高亞硝酸鹽對(duì)人體造成的健康風(fēng)險(xiǎn)。

2.2.2 感官評(píng)價(jià) 由圖9可知，無鹽酸菜在4 ℃下的感官質(zhì)量始終維持在良好的狀態(tài)，感官總評(píng)分為41.0～42.3。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，蔬菜顏色和氣味評(píng)分稍有下降，但也始終保持著良好的色澤和獨(dú)特的酸香氣味。

圖9 低溫貯藏對(duì)無鹽酸菜感官評(píng)分的影響

3 結(jié)論

無鹽酸菜在發(fā)酵第5天達(dá)到成熟；其pH值、還原糖含量、維生素C含量及亞硝酸鹽含量均顯著降低(P<0.05)，總酸含量及總體有機(jī)酸含量顯著升高(P<0.05)；無鹽酸菜的發(fā)酵程度較為徹底，殘?zhí)橇枯^少，有機(jī)酸含量增加顯著(P<0.05)，亞硝酸鹽含量極低為(0.23±0.10) mg/kg，4 ℃下貯藏60 d，無鹽酸菜的pH值、總酸含量較為穩(wěn)定，亞硝酸鹽含量持續(xù)降低，說明無鹽酸菜的品質(zhì)特性穩(wěn)定。后續(xù)可深入討論不同菌種在發(fā)酵過程中對(duì)酸菜風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)及結(jié)構(gòu)的影響。