曹寧寧，李市榮，王清果，王 偉，孫成宏，姚景春，張貴民，肖學(xué)鳳

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究脈絡(luò)舒通丸抗血栓性淺靜脈炎的作用機(jī)制

曹寧寧1，李市榮2，王清果1，王 偉3，孫成宏2，姚景春2，張貴民2*，肖學(xué)鳳1*

1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617 2. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司 新藥藥理中心，山東 臨沂 276000 3. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司 中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276000

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法探究脈絡(luò)舒通丸抗血栓性淺靜脈炎（superficial thrombophlebitis，STP）的作用機(jī)制。借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從藥物及疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選脈絡(luò)舒通丸的成分作用靶點(diǎn)及STP疾病相關(guān)靶點(diǎn)，根據(jù)拓?fù)涮卣髦岛Y選關(guān)鍵靶點(diǎn)后，進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。將日本大耳白兔隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、地奧司明（0.168 g/kg）組和脈絡(luò)舒通丸低、中、高劑量（0.56、1.68、5.04 g/kg）組。除對(duì)照組外，其余各組均采用耳緣iv 20%甘露醇建立STP兔模型。造模同時(shí)各給藥組連續(xù)ig給藥14 d。采用蘇木素-伊紅（HE）染色法檢測(cè)各組兔耳組織病理變化；ELISA檢測(cè)各組血清中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-6水平；Western blotting檢測(cè)耳組織蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K）、Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）和信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）蛋白表達(dá)及磷酸化水平。共篩選得到脈絡(luò)舒通丸活性成分作用靶點(diǎn)1112個(gè)，STP疾病相關(guān)靶點(diǎn)837個(gè)，二者共同靶點(diǎn)84個(gè)，根據(jù)拓?fù)涮卣髦岛Y選出核心靶點(diǎn)31個(gè)，富集分析發(fā)現(xiàn)核心靶點(diǎn)主要與平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)的正調(diào)控、凋亡過(guò)程的調(diào)控等生物過(guò)程，以及JAK/STAT信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脈絡(luò)舒通丸組兔耳組織病理?yè)p傷顯著改善，血清中IL-1β、TNF-α和IL-6水平顯著降低（＜0.05、0.01），耳組織Akt、PI3K、JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平均顯著下調(diào)（＜0.05、0.01）。脈絡(luò)舒通丸可能通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制炎癥和血栓的形成，從而發(fā)揮抗STP的作用。

脈絡(luò)舒通丸；血栓性淺靜脈炎；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路；Janus激酶2/信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子信號(hào)3通路

血栓性淺靜脈炎（superficial thrombophlebitis，STP）是臨床常見(jiàn)的一種血栓性、炎癥病變的血管性疾病，主要表現(xiàn)為病變淺靜脈出現(xiàn)條索狀硬塊，形如蚯蚓，色赤，可出現(xiàn)局部紅腫疼痛[1]。由于其早期臨床癥狀相對(duì)較輕，患者未進(jìn)行及時(shí)有效的治療，出現(xiàn)血栓脫落，可誘發(fā)深靜脈血栓、心、肺、腦血管栓塞等并發(fā)癥，對(duì)生命健康造成嚴(yán)重威脅。臨床上常用的治療藥物多為抗感染、抗凝、溶栓類藥物、非甾體抗炎藥、免疫抑制劑等，雖然能在一定程度上緩解患者的臨床癥狀，但其治愈率低，治療效果欠佳，治療成本較高且常導(dǎo)致多種不良反應(yīng)[2]。中醫(yī)認(rèn)為STP屬于“赤脈、青蛇毒、惡脈、脈痹”等范疇，濕熱濁瘀阻絡(luò)是基本病機(jī)，應(yīng)采用清熱利濕、化瘀通絡(luò)、祛濕消腫的方式治療。

脈絡(luò)舒通丸源于國(guó)醫(yī)大師唐祖宣先生的經(jīng)驗(yàn)方，全方由黃芪、金銀花、黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁、玄參、當(dāng)歸、白芍、水蛭、蜈蚣、全蝎和甘草共12味中藥組成，方中黃芪、金銀花為君藥；黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁、當(dāng)歸、白芍、玄參為臣藥；水蛭、全蝎、蜈蚣為佐藥；甘草為使藥，調(diào)和諸藥；共奏清熱解毒、化瘀通絡(luò)、祛濕消腫的功效，與STP濕熱濁瘀阻絡(luò)的病機(jī)相契合?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，黃芪和當(dāng)歸及其活性成分均具有抗氧化、抑制炎癥介質(zhì)表達(dá)、抗血小板凝集和抗血栓形成的作用[3-4]；金銀花和玄參的提取物可顯著降低白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的產(chǎn)生，達(dá)到良好的抗炎作用[5-6]；水蛭、蜈蚣和全蝎均可抑制血小板聚集，增強(qiáng)纖溶活性，具有明顯的抗血栓形成的功效[7]，表明脈絡(luò)舒通丸可起到防止血栓形成和抑制炎癥作用。目前，脈絡(luò)舒通丸廣泛應(yīng)用于臨床治療STP[8]，療效顯著，不良反應(yīng)少，但關(guān)于脈絡(luò)舒通丸的研究主要集中在臨床療效方面，缺乏其具體作用機(jī)制方面的研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)的基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代的計(jì)算機(jī)技術(shù)構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，揭示藥物與治療疾病之間的分子關(guān)聯(lián)規(guī)律，從多維度探討中醫(yī)藥與疾病的關(guān)系，體現(xiàn)中醫(yī)藥治療疾病的整體性[9-11]。因此，本研究首先基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討脈絡(luò)舒通丸抗STP的潛在作用機(jī)制，篩選出關(guān)鍵信號(hào)通路，然后通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，采用20%甘露醇建立STP兔模型，運(yùn)用Western blotting技術(shù)進(jìn)一步探究脈絡(luò)舒通丸抗STP的作用機(jī)制，為其臨床治療STP奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

36只健康日本大耳白兔，雌雄各半，2.50～2.75 kg，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院［許可證號(hào)SCXK（京）2019-0006］，飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。飼養(yǎng)條件為12 h光照/12 h黑暗，單籠飼養(yǎng)，室溫（25±2）℃，自由飲水和進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)中所有操作均符合相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理原則，并獲得天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)TCM-LAEC2021253）。

1.2 藥品與試劑

脈絡(luò)舒通丸（批號(hào)918200011）由魯南厚普制藥有限公司提供；20%甘露醇（批號(hào)201003A01）購(gòu)自山東華魯制藥有限公司；0.9%氯化鈉注射液（批號(hào)2112221909）購(gòu)自石家莊四藥有限公司；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒（批號(hào)分別為JYM0003Rb、JYM0011Rb、JYM0006Rb）購(gòu)自武漢基因美科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)S7105010）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)20201ES76）購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；RIPA組織/細(xì)胞裂解液（批號(hào)R0010）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）兔單克隆抗體（批號(hào)AB32101）、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）鼠單克隆抗體（批號(hào)AB68153）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K）鼠單克隆抗體（批號(hào)BS4605）購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司；p-PI3K鼠單克隆抗體（批號(hào)4228）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）鼠單克隆抗體（批號(hào)2920）、p-Akt鼠單克隆抗體（批號(hào)5106）、p-JAK2兔單克隆抗體（批號(hào)3771）、p-STAT3兔單克隆抗體（批號(hào)9145）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）鼠單克隆抗體（批號(hào)97166）購(gòu)自美國(guó)CST公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)S0001）、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（批號(hào)S0002）購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences公司。

1.3 儀器

Infinite M200 Pro型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；3K15型冷凍高速離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；ASP200S型自動(dòng)真空組織脫水機(jī)、EG1150H型自動(dòng)生物組織包埋機(jī)、RM2255型切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；DYY-7C型、DYCZ-40D型電泳轉(zhuǎn)膜設(shè)備（北京六一生物科技有限公司）；Chemi Scope6200型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；Nikon Ci-L型顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)脈絡(luò)舒通丸抗STP的作用機(jī)制

2.1.1 脈絡(luò)舒通丸活性成分及其作用靶點(diǎn)獲取 運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索脈絡(luò)舒通丸活性成分，并根據(jù)藥物的吸收、分布、代謝、排泄（absorption, distribution, metabolism, excretion，ADME）參數(shù)，設(shè)定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為篩選條件，得到脈絡(luò)舒通丸的潛在活性成分。由于TCMSP中未篩選到水蛭、蜈蚣、全蝎的活性成分，故通過(guò)CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)文獻(xiàn)補(bǔ)充水蛭、蜈蚣、全蝎的活性成分[12-17]，將補(bǔ)充成分整合到TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選結(jié)果中。并應(yīng)用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取活性成分的簡(jiǎn)化分子線性輸入規(guī)范（simplified molecular input line entry system，SMILES）。

將脈絡(luò)舒通丸活性成分的SMILES導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. swisstargetprediction.ch/），限定物種為“Homo sapiens”，選擇“possibility”大于0的靶點(diǎn)作為脈絡(luò)舒通丸活性成分的成分作用靶點(diǎn)。

2.1.2 STP疾病作用靶點(diǎn)獲取 以“superficial thrombophlebitis”和“superficial vein thrombosis”關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，在GeneCards（https://www. genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）和GisGeNET（https://www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，并將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的靶點(diǎn)合并去重復(fù)項(xiàng)后，規(guī)范化后得到STP疾病作用靶點(diǎn)。

2.1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將脈絡(luò)舒通丸的潛在活性成分作用靶點(diǎn)與STP疾病作用靶點(diǎn)導(dǎo)入VENN（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線工具，取其交集，獲得共同靶點(diǎn)。通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn.string-db.org/）對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2平臺(tái)進(jìn)行可視化分析，并使用Network Analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)分析。以“度值＞中位數(shù)、介數(shù)中心性＞中位數(shù)、中心接近度＞中位數(shù)”作為篩選條件，獲取脈絡(luò)舒通丸抗STP的核心靶點(diǎn)。

2.1.4 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 為進(jìn)一步探索脈絡(luò)舒通丸治療STP的作用機(jī)制，將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/），使用“Functional Annotation”功能，將物種設(shè)置為“Homo sapiens”，進(jìn)行GO功能和KEGG信號(hào)通路富集分析。根據(jù)值從小到大，篩選出脈絡(luò)舒通丸抗STP的主要生物過(guò)程及信號(hào)通路。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 分組、造模及給藥 將36只兔隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、地奧司明（0.168 g/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量）組和脈絡(luò)舒通丸低、中、高劑量（0.56、1.68、5.04 g/kg，分別相當(dāng)于臨床劑量的1/3、1、3倍）組，每組6只。除對(duì)照組外，其余各組采用雙側(cè)耳緣iv 20%甘露醇建立STP兔模型，采用兔固定器限制兔子活動(dòng)，距耳尖2 cm處，用生理鹽水進(jìn)行耳緣靜脈預(yù)穿刺，確保頭皮針在靜脈中同時(shí)藥液無(wú)滲漏，以1 mL/min緩慢推注20%甘露醇溶液（4.0 mL/kg），藥物注射結(jié)束后推注1 mL生理鹽水，每日2次注射，共注射14 d。造模期間每日觀察耳緣靜脈及其周圍組織皮膚顏色，若皮膚變紅并有硬結(jié)，表示STP兔模型構(gòu)建成功。造模同時(shí)，對(duì)照組和模型組ig純水，各給藥組ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)14 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，ip戊巴比妥鈉麻醉，靜脈取血，離心獲取血清；以靜脈穿刺點(diǎn)前方1.5 cm為中心，切取1 cm2耳廓組織，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 兔耳組織蘇木素-伊紅（HE）染色 取兔耳組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色步驟，在光學(xué)顯微鏡下觀察耳組織耳緣靜脈及周圍組織的病理學(xué)變化。

2.2.3 血清炎癥因子水平檢測(cè) 取各組兔血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

2.2.4 Western blotting檢測(cè)兔耳組織相關(guān)蛋白表達(dá) 取兔耳組織勻漿，RIPA裂解液進(jìn)行充分裂解，離心提取兔耳總蛋白，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液室溫封閉1 h，分別加入PI3K（1∶1000）、p-PI3K（1∶1000）、Akt（1∶1000）、p-Akt（1∶1000）、JAK2（1∶1000）、p-JAK2（1∶1000）、STAT3（1∶1000）、p-STAT3（1∶1000）和GAPDH（1∶3000）抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；加入相應(yīng)二抗（1∶3000），室溫孵育1 h后洗膜，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行灰度值分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.1.1 脈絡(luò)舒通丸活性成分及其作用靶點(diǎn)獲取 根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索結(jié)果及文獻(xiàn)檢索，收集整理并去除重復(fù)成分后得到脈絡(luò)舒通丸145個(gè)活性成分，其中黃芪活性成分14個(gè)、金銀花活性成分15個(gè)、黃柏活性成分29個(gè)、蒼術(shù)活性成分2個(gè)、薏苡仁活性成分8個(gè)、玄參活性成分4個(gè)、當(dāng)歸活性成分2個(gè)、白芍活性成分6個(gè)、甘草活性成分61個(gè)、水蛭活性成分11個(gè)、蜈蚣活性成分12個(gè)、全蝎活性成分6個(gè)。將各活性成分的SMILES導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行脈絡(luò)舒通丸活性成分的作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，共獲取10 591個(gè)成分作用靶點(diǎn)，去除9479個(gè)重復(fù)靶點(diǎn)，得到脈絡(luò)舒通丸的1112個(gè)活性成分作用靶點(diǎn)。

3.1.2 STP疾病作用靶點(diǎn)獲取 以“superficial thrombophlebitis”和“superficial vein thrombosis”關(guān)鍵詞分別在GeneCards、OMIM和GisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，分別得到272個(gè)、384個(gè)和5個(gè)STP疾病作用靶點(diǎn)，合并整理3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果共獲得856個(gè)疾病作用靶點(diǎn)，刪除19個(gè)重復(fù)項(xiàng)，獲得837個(gè)STP疾病作用靶點(diǎn)。

3.1.3 脈絡(luò)舒通丸活性成分與STP疾病的共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將脈絡(luò)舒通丸的1112個(gè)活性成分作用靶點(diǎn)與837個(gè)STP疾病作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Venn在線工具，取其交集，并繪制Venn圖，得到共同靶點(diǎn)84個(gè)，見(jiàn)圖1。將得到的84個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，隱藏孤立靶點(diǎn)，構(gòu)建得到具有80個(gè)點(diǎn)，825條邊的共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2，其中節(jié)點(diǎn)代表共同靶點(diǎn)；節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺代表度值大小，節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，代表度值越大，靶點(diǎn)越關(guān)鍵；節(jié)點(diǎn)間連接的直線表示2個(gè)共同靶點(diǎn)之間有相互作用。

圖1 脈絡(luò)舒通丸活性成分與STP疾病作用靶點(diǎn)的Venn圖

圖2 脈絡(luò)舒通丸活性成分與STP疾病共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

將脈絡(luò)舒通丸活性成分與STP疾病的共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2平臺(tái)進(jìn)行可視化分析，并使用NetworkAnalyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)分析。以度值＞中位數(shù)（19.00）、介數(shù)中心性＞中位數(shù)（14.99）、中心接近度＞中位數(shù)（0.54）作為篩選條件，得到31個(gè)脈絡(luò)舒通丸抗STP的核心靶點(diǎn)，其關(guān)鍵拓?fù)鋮?shù)，見(jiàn)表1。

3.1.4 脈絡(luò)舒通丸抗STP的關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO功能和KEGG通路富集分析 使用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)31個(gè)脈絡(luò)舒通丸抗STP的核心作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析（＜0.05），共得到150個(gè)條目，包括113個(gè)生物過(guò)程（biological processes，BP）、22種細(xì)胞組分（cellular components，CC）、15種分子功能（molecular functions，MF），根據(jù)值分別選取前10條進(jìn)行可視化處理，見(jiàn)圖3。BP主要涉及平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)的正調(diào)控、凋亡過(guò)程的調(diào)控等，CC主要涉及細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞膜等，MF主要涉及PI3K結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、內(nèi)肽酶活性等，體現(xiàn)脈絡(luò)舒通丸抗STP是多重作用的結(jié)果。

表1 脈絡(luò)舒通丸抗STP核心靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)信息

KEGG通路富集分析中共獲得118條相關(guān)信號(hào)通路（＜0.05），根據(jù)值由小到大順序制作排名前20的信號(hào)通路氣泡圖，見(jiàn)圖4，其中包括JAK/STAT、PI3K/Akt 2條主要炎癥相關(guān)信號(hào)通路，流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）2條與血管性疾病相關(guān)信號(hào)通路，5條癌癥相關(guān)信號(hào)通路，7條病毒相關(guān)信號(hào)通路，4條其他信號(hào)通路。由于STP的發(fā)生發(fā)展與炎癥和血栓密切相關(guān)，因此，本研究對(duì)KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果中2條炎癥相關(guān)信號(hào)通路和2條與血管性疾病相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研。

圖3 脈絡(luò)舒通丸抗STP的核心靶點(diǎn)的GO功能富集分析

圖4 脈絡(luò)舒通丸抗STP的核心靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

經(jīng)文獻(xiàn)檢索，流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、VEGF信號(hào)通路參與機(jī)體血管生成，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生與凋亡[18-19]；JAK/STAT信號(hào)通路可通過(guò)維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)、抑制血管內(nèi)的氧化應(yīng)激及炎癥損傷，PI3K/Akt信號(hào)通路具有抑制炎癥和抗血栓形成的作用[20-21]。由此可知，流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、VEGF信號(hào)通路以影響血栓為主；而PI3K/Ak和JAK/STAT信號(hào)通路主要與炎癥反應(yīng)和血栓形成密切相關(guān)，且這2條信號(hào)通路的相關(guān)研究較多，值排名較小。故本研究預(yù)測(cè)脈絡(luò)舒通丸可能是通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt和JAK/STAT信號(hào)通路發(fā)揮抗STP作用。

3.2 脈絡(luò)舒通丸抗STP的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)作用機(jī)制研究

3.2.1 脈絡(luò)舒通丸對(duì)STP模型兔耳組織病理形態(tài)的影響 如圖5所示，對(duì)照組兔耳組織中靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)完整，呈梭形均勻有序的排列，內(nèi)膜光滑無(wú)脫落現(xiàn)象，且無(wú)任何血栓和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。與對(duì)照組比較，模型組兔耳組織血管管腔被破壞，靜脈內(nèi)膜無(wú)規(guī)則性嚴(yán)重脫落，管腔內(nèi)有明顯血栓產(chǎn)生，管壁及周圍組織可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，表示STP兔模型建立成功。與模型組比較，各給藥組兔耳組織靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)完整性和內(nèi)膜脫落情況均有不同程度的改善，僅可見(jiàn)輕微血栓形成，少量炎性細(xì)胞局部浸潤(rùn)于管腔和周圍組織，以脈絡(luò)舒通丸高劑量組病理改善最為明顯。

圖5 脈絡(luò)舒通丸對(duì)STP模型兔耳組織病理變化的影響(HE)

3.2.2 脈絡(luò)舒通丸對(duì)STP模型兔血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響 如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組兔血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。提示脈絡(luò)舒通丸對(duì)STP模型兔血清炎癥水平具有顯著的抑制作用。

3.2.3 脈絡(luò)舒通丸對(duì)STP模型兔JAK/STAT、PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步研究脈絡(luò)舒通丸抗STP的分子機(jī)制，本研究測(cè)定網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)PI3K/AKT、JAK/STAT信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。如圖7所示，與對(duì)照組比較，模型組兔耳組織中Akt、PI3K、JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平明顯上調(diào)（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組Akt、PI3K、JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平明顯下調(diào)（＜0.05、0.01）。表明脈絡(luò)舒通丸可通過(guò)抑制PI3K/Akt、JAK2/STAT3信號(hào)通路發(fā)揮抗STP作用。

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，圖7同

4 討論

STP為臨床常見(jiàn)的周圍血管疾病，臨床以軀干部或肢體處淺靜脈發(fā)生血栓性、炎癥病變，靜脈循行處出現(xiàn)結(jié)節(jié)或條索狀，伴有明顯觸痛等為主要表現(xiàn)特征。STP歸屬于中醫(yī)學(xué)“脈痹”“赤脈”“青蛇毒”等范疇?！夺t(yī)宗金鑒?外科心法要訣》中闡述：青蛇毒，此證又名青蛇便，生于小腿肚下，形長(zhǎng)二三寸，結(jié)腫，紫塊，僵硬[22]。其主要病機(jī)為熱毒、水濕和血瘀阻于脈絡(luò)。故中醫(yī)治療以清熱利濕、活血化瘀為主。脈絡(luò)舒通丸由黃芪、金銀花、黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁、玄參、當(dāng)歸、白芍、水蛭、蜈蚣、全蝎、甘草組成，具有清熱解毒、化瘀通絡(luò)、祛濕消腫之功效，切中STP濕熱濁瘀阻絡(luò)的基本病機(jī)[23]。然而，脈絡(luò)舒通丸抗STP的作用機(jī)制尚未完全明確。

圖7 脈絡(luò)舒通丸對(duì)STP模型兔耳組織PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 6)

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的方式從多靶點(diǎn)、多角度、多途徑揭示脈絡(luò)舒通丸抗STP的作用機(jī)制，探討脈絡(luò)舒通丸抗STP的潛在靶點(diǎn)和分子機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，共篩選出脈絡(luò)舒通丸145個(gè)活性成分及1112個(gè)成分作用靶點(diǎn)，837個(gè)STP疾病作用靶點(diǎn)，2者共同靶點(diǎn)共84個(gè)；將84個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，隱藏孤立靶點(diǎn)，進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，共篩選得到31個(gè)脈絡(luò)舒通丸抗STP的核心靶點(diǎn)，經(jīng)KEGG通路富集分析脈絡(luò)舒通丸抗STP主要涉及PI3K/Akt、JAK/STAT、VEGF、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化等介導(dǎo)的信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt和JAK/STAT信號(hào)通路是與炎癥反應(yīng)和血栓形成密切相關(guān)的信號(hào)通路，且這2條信號(hào)通路的相關(guān)研究較多，值排名較小。因此，本研究基于PI3K/Akt和JAK/STAT 2條信號(hào)通路深入探討脈絡(luò)舒通抗STP的作用機(jī)制。

PI3K/Akt信號(hào)通路是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，已被報(bào)道在結(jié)腸炎、關(guān)節(jié)炎、腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[24]。PI3K是一種由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基P110構(gòu)成的異源二聚體，調(diào)節(jié)亞基p85可通過(guò)SH2結(jié)構(gòu)與磷酸化的酪氨酸殘基作用，激活PI3K，進(jìn)而增加3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3）的產(chǎn)生，PIP3能夠使PI3K下游關(guān)鍵靶蛋白Akt的Thr308、Ser473殘基磷酸化并使其活化，活化的Akt可調(diào)控下游多種靶蛋白介導(dǎo)的生物過(guò)程，包括炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮損傷等[25-27]。研究發(fā)現(xiàn)，豨薟草水煎液可通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路抑制NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，從而改善腦缺血再灌注損傷模型大鼠的炎癥反應(yīng)[28]。此外，PI3K/Akt信號(hào)通路也可介導(dǎo)依賴凝血酶的血小板信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控蛋白酶活化受體表達(dá)進(jìn)而抑制血小板活化及黏附，延遲血栓的形成[29]。研究表明，水溶性番茄濃縮物通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮抗血小板聚集和血栓形成的作用[30]。因此，本研究應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)各組兔耳組織中PI3K、Akt、p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示脈絡(luò)舒通丸能明顯下調(diào)PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平，表明脈絡(luò)舒通丸可能通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗STP作用。

JAK/STAT信號(hào)通路主要通過(guò)多種細(xì)胞因子介導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)。JAK2/STAT3是在炎性疾病中研究較多的信號(hào)通路，且JAK2特異性激活STAT3[31]。當(dāng)受到外界信號(hào)刺激時(shí)，干擾素等配體與細(xì)胞膜上多種細(xì)胞因子受體結(jié)合，以同源或異源二聚體的形式磷酸化JAK2，磷酸化的JAK2隨即募集細(xì)胞質(zhì)中的STAT3，磷酸化后的STAT3形成二聚體進(jìn)入到細(xì)胞核，最終與目的基因啟動(dòng)子相結(jié)合，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及炎癥反應(yīng)等生物過(guò)程[32]。研究表明，白藜蘆醇可通過(guò)抑制JAK2/STAT3通路，下調(diào)TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，減輕ApoE?/?小鼠動(dòng)脈血管內(nèi)的炎癥損傷[33]。AG490（一種JAK2/STAT3信號(hào)通路的專效抑制劑）可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制是通過(guò)阻斷JAK2/STAT2信號(hào)通路，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[34]。此外，AG490也可通過(guò)阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路，抑制月桂酸鈉溶液誘導(dǎo)的血栓閉塞性脈管炎大鼠的炎癥反應(yīng)和血栓形成[35]。故本研究應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)各組兔耳組織中JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示脈絡(luò)舒通丸可顯著下調(diào)JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平，表明脈絡(luò)舒通丸也可能通過(guò)調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗STP作用。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)了脈絡(luò)舒通丸抗STP的作用機(jī)制，并進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討其潛在的作用機(jī)制。結(jié)果表明，脈絡(luò)舒通丸可抑制STP模型兔血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，并顯著改善STP模型兔的病理?yè)p傷。其作用機(jī)制可能通過(guò)抑制PI3K/Akt和JAK2/STAT3 2條信號(hào)通路的激活，并下調(diào)多種炎癥因子表達(dá)水平來(lái)發(fā)揮抗STP作用，為臨床脈絡(luò)舒通丸治療STP提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Mailuo Shutong Pills in treatment of superficial thrombophlebitis based on network pharmacology and experimental verification

CAO Ning-ning1, LI Shi-rong2, WANG Qing-guo1, WANG Wei3, SUN Cheng-hong2, YAO Jing-chun2, ZHANG Gui-min2, XIAO Xue-feng1

1. School of Chinese Materia Medica, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2. New Drug Pharmacology Center of Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276000, China 3. State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276000, China

To explore the mechanism of Mailuo Shutong Pills (脈絡(luò)舒通丸, MLSTW) in treatment of superficial thrombophlebitis (STP) based on combination of network pharmacology and animal experimental validation.Drug targets of MLSTW and targets related to STP were screened from disease and drug related database, and key targets were screened according to topological eigenvalues. Gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis were performed. The Japanese white rabbits were randomly divided into control group, model group, diosmin (0.168 g/kg) group and MLSTW low-, medium-, high-dose (0.56, 1.68, 5.04 g/kg) groups. Except for control group, the rabbit model of STP was established by injecting 20% mannitol into bilateral auricular vein in other groups. At the same time, the treated groups were ig drugs for 14 d. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of rabbit ear tissues; ELISA was used to detect the levels of interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and IL-6 in serum; Western blotting was used to detect the expressions of protein kinase B (Akt), phosphatidylin-ositol-3-kinase (PI3K), Janus kinase 2 (JAK2), signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) proteins and phosphorylation levels in rabbit ear tissues.A total of 1112 compounds targets of MLSTP, 837 STP disease targets, 84 common targets and 31 key targets were obtained. Enrichment analysis showed that the key targets were mainly involved in biological processes such as positive regulation of smooth muscle cell proliferation, positive regulation of inflammatory response, positive regulation of apoptotic process, as well as PI3K/Akt signaling pathway, JAK/STAT signaling pathway.experiment results showed that pathological damage of rabbit ear tissues in MLSTW group was significantly improved, levels of IL-1β, TNF-α, IL-6 in serum of rabbits were significantly decreased (< 0.05, 0.01), phosphorylation levels of Akt, PI3K, JAK2 and STAT3 in rabbit ear tissues were significantly reduced (< 0.05, 0.01).MLSTP can play an anti-STP role by down-regulating the expressions of PI3K/Akt and JAK2/STAT3 signaling pathway related proteins, inhibiting inflammation and thrombosis.

Mailuo Shutong Pills; superficial thrombophlebitis; network pharmacology; phosphatidylin-ositol-3-kinase/protein kinase B signaling pathway; Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)06 - 1860 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.018

2022-11-22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81973557）；天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（20JCZDJC00010）；釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津藥物研究院）開(kāi)發(fā)課題資助（010162001）

曹寧寧，博士研究生，從事中藥質(zhì)量控制研究。E-mail: cnn01070980@163.com

張貴民，研究員，主要從事創(chuàng)新藥物研發(fā)。E-mail: lunanzhangguimin@yeah.net

肖學(xué)鳳，教授，主要從事新藥研發(fā)。E-mail: kai1219@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]