趙韋欣，王 晴，王夢齊，季安璇，鄭晶瑩，趙淑華

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討鴉膽子治療結(jié)直腸癌的作用機制

趙韋欣，王 晴，王夢齊，季安璇，鄭晶瑩*，趙淑華*

吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長春 130022

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接及體內(nèi)驗證，探究鴉膽子治療結(jié)直腸癌的活性成分、關(guān)鍵作用靶點及潛在的分子機制。從公共數(shù)據(jù)庫中檢索并收集鴉膽子的活性成分和對應(yīng)的靶點以及結(jié)直腸癌相關(guān)的靶點，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析出鴉膽子治療結(jié)直腸癌的活性成分、成分-疾病的交集靶點以及可能的信號通路。通過分子對接預(yù)測活性成分與靶點蛋白的結(jié)合能力。通過體內(nèi)實驗進一步驗證鴉膽子活性成分治療結(jié)直腸癌的作用和作用機制。在滿足篩選條件的15個成分中共篩出鴉膽子苦醇、木犀草素、鴉膽子苷B、β-谷甾醇4個鴉膽子生物活性成分及32個鴉膽子治療結(jié)直腸癌的作用靶點，表皮因子生長受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）及細胞周期蛋白D1（cyclin D1）是鴉膽子治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵靶點，EGFR/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路可能在鴉膽子治療結(jié)直腸癌中發(fā)揮重要作用。分子對接結(jié)果表示4個生物活性成分均可較好結(jié)合，其中鴉膽子苦醇與3個關(guān)鍵靶點的平均結(jié)合能負值最大，結(jié)合最穩(wěn)定，可能是鴉膽子抗結(jié)直腸癌最有效的活性成分。動物實驗結(jié)果表明，與對照組比較，鴉膽子苦醇明顯抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的體積和質(zhì)量（＜0.01），下調(diào)腫瘤組織中EGFR、PI3K和Akt的蛋白表達水平（＜0.01），下調(diào)與G1/G0期細胞阻滯相關(guān)的cyclin D1和細胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）的表達（＜0.01），上調(diào)與腫瘤細胞凋亡相關(guān)的cleaved Caspase-3表達及B淋巴細胞瘤-2相關(guān)X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）/B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）值（＜0.01），下調(diào)與遷移和侵襲相關(guān)的蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、MMP7表達（＜0.01）；鴉膽子苦醇組裸鼠肝功能、腎功能及血液指標(biāo)均未見顯著性差異。鴉膽子能夠通過多靶點、多通路治療結(jié)直腸癌，其主要活性成分為鴉膽子苦醇，其機制可能與抑制EGFR/PI3K/Akt信號通路從而引起G1/G0期阻滯，抑制增殖、侵襲和遷移，促進細胞凋亡有關(guān)。

鴉膽子；鴉膽子苦醇；結(jié)直腸癌；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；木犀草素；鴉膽子苷B；β-谷甾醇；表皮因子生長受體；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；細胞周期蛋白D1

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥死亡率的第2大原因[1]。大多數(shù)CRC是散發(fā)的，遺傳及環(huán)境因素是其重要的致病因素[2]?；熓荂RC的關(guān)鍵治療方案之一[3]。傳統(tǒng)中藥制劑作為癌癥化療的輔助治療已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)被廣泛接受[4]。大量研究及臨床實踐向腫瘤的綜合治療不斷拓展，已經(jīng)證明傳統(tǒng)中藥作為輔助療法，與化療或者放療相結(jié)合，可以提高療效、減少不良反應(yīng)[5-7]。

鴉膽子(L.) Merr.是原生于我國東南部及其他熱帶、亞熱帶地區(qū)的苦木科灌木。以鴉膽子果實為原料生產(chǎn)的中藥抗腫瘤注射液，已廣泛在臨床被用于肺癌、肺癌腦轉(zhuǎn)移和胃腸道腫瘤的輔助治療。臨床研究證明鴉膽子可以增強臨床上晚期非小細胞肺癌的療效并降低化療的不良反應(yīng)[8-9]。鴉膽子苦醇是鴉膽子的重要活性成分[10]。研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇對乳腺癌、鼻咽癌、肺癌和其他惡性腫瘤均有抑制作用[11-14]。鴉膽子果實的乙醇提取物可能通過上調(diào)p53和抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抗人結(jié)腸癌HCT116細胞生長[15]。然而，其潛在機制尚不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種結(jié)合計算機科學(xué)與醫(yī)學(xué)來闡述藥物對疾病作用機制的新興方法，能系統(tǒng)地研究、鑒定中藥配方的生物活性化合物并可視化其多靶點、多途徑的作用機制，已被廣泛應(yīng)用于預(yù)測、分析中藥的藥理作用及潛在機制[4,16-17]。因此，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度篩選鴉膽子的活性成分及針對CRC的靶點和信號通路。分子對接是研究小分子藥物與靶點蛋白受體之間的相互作用及親和力的模擬計算方法。分子對接可以作為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的進一步驗證，二者互補地用于中藥研究[18]。本研究通過分子對接模擬鴉膽子已鑒定組分與其可能靶標(biāo)蛋白的分子相互作用并計算結(jié)合力。鴉膽子苦醇作為被驗證的鴉膽子抗腫瘤活性成分[10]，本研究進一步在裸鼠荷瘤模型中驗證其抗CRC的潛力及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的效應(yīng)機制。

1 材料

1.1 動物

12只SPF級雌性BALB/c-Nu小鼠，6周齡，體質(zhì)量16～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，質(zhì)量合格證編號No.110322220103372262，質(zhì)量許可證號SCXK（京）2019-0008，動物使用許可證號SYXK（吉）2018-0001。動物于相對濕度45%～55%、溫度（22±1）℃、12 h光暗循環(huán)的環(huán)境下，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)吉林大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號202073）。

1.2 細胞

HCT116細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 藥品與試劑

鴉膽子苦醇（批號B26016，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、β-環(huán)糊精（批號T66291）購自上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號D8418）購自美國Sigma公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號P0006C）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；4%～15%連續(xù)梯度聚丙烯酰胺預(yù)制膠（批號DG101-01）購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；表皮因子生長受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體（批號AF6043）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抗體（批號AF6241）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（批號AF6261）、細胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）抗體（批號DF6102）、細胞周期蛋白B1（cyclin B1）抗體（批號AF6168）、cyclin D1抗體（批號AF0931）、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）抗體（批號AF7022）、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號AF6139）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號AF0120）、蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP7）抗體（批號AF0218）、MMP2抗體（批號AF5330）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號AF7021）、電化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號KF001）均購自江蘇親科生物研究中心有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（批號SA00001-2）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

ChemiScope 6000 Touch型凝膠成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；SC-412型4 ℃立式冷藏柜（青島市海爾股份有限公司）；PowerPac3000型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；MOV-112F型細胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；V18R型高速冷凍離心機（瑞士Dynamica公司）；BETS-100型搖床振蕩器（海門市其林貝爾公司）；Hemo 3600V型Shinova血液學(xué)分析儀（上海麥本醫(yī)療科技有限公司）。

2 方法

2.1 鴉膽子的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及分子對接

2.1.1 鴉膽子的活性成分及靶點 利用中醫(yī)系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp. php）、中醫(yī)藥資料庫（http://tcm.cmu.edu.tw/）以及文獻檢索的方法收集鴉膽子的主要活性成分，將能在PubChem中檢索對應(yīng)的CAS號和SMILES號的成分進行收集。同時，對收集的成分進行藥動學(xué)信息檢索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為篩選條件。

2.1.2 CRC的靶點及交集靶點的獲取 在GeneCards（https://www.genecards.org）中，以“CRC”為檢索詞，物種限定為“Homo sapiens”，對其進行注釋和預(yù)測。收集相關(guān)性值大于1的靶點作為疾病靶點。在Venn 2.1.0制圖平臺（https://bioinfogp.cnb. csic.es/tools/venny/index.html）繪制CRC與鴉膽子的交集靶點。

2.1.3 “活性成分-CRC”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Cytoscape 3.7.2（https://cytoscape.org）可視化“活性成分-CRC”網(wǎng)絡(luò)，連接的節(jié)點越密集，受該成分調(diào)控的靶點越多，表明該成分是鴉膽子抗CRC的重要活性成分。

2.1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選 將CRC靶點導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org）進行分析，模式設(shè)置為“多種蛋白”，物種限定為“Homo sapiens”。預(yù)讀數(shù)據(jù)后，其余蛋白的置信度≥0.99，與其余蛋白無聯(lián)系的蛋白被隱藏。然后構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.4，剔除不符合得分的靶標(biāo)。利用Barplot繪圖函數(shù)，對蛋白質(zhì)連接節(jié)點的個數(shù)進行技術(shù)并繪制直方圖，尋找核心靶點。

2.1.5 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 利用R 3.6.0軟件進行GO功能富集分析，從靶細胞的分子功能、細胞成分和生物過程確定基因富集的功能，值與富集程度呈正相關(guān)。用R將結(jié)果繪制成相應(yīng)的直方圖和氣泡圖，選取篩選校正后＜0.05的富集結(jié)果。利用KEGG途徑富集分析獲得樞紐靶點作用的途徑。

2.1.6 分子對接 將小分子藥物的mol2格式的文件導(dǎo)入AutoDockTools（Version 1.5.7），對小分子藥物進行平衡電荷、將非極性氫原子與相對應(yīng)的碳原子合并等修飾獲得3D結(jié)構(gòu)，然后轉(zhuǎn)化為PDBQT格式的文件。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/，Protein Data Bank，PDB）獲取EGFR（ID：1M17）、Caspase-3（ID：4QUB）、Cyclin D1（ID：5VZU）的晶體結(jié)構(gòu)。通過AutoDockTools對受體蛋白進行去水、加氫、平衡電荷等預(yù)處理后轉(zhuǎn)化為PDBQT格式的文件。利用AutoDockTools對小分子藥物和配體蛋白進行分子對接，將受體和配體的PDBQT文件導(dǎo)入AutoDockTools，構(gòu)建對接口袋。在大分子上設(shè)置中心，并設(shè)置、和的參數(shù)以保證蛋白質(zhì)完全被覆蓋。將輸出的最大結(jié)合模式數(shù)設(shè)置為20。分子對接后生成活性位點位置，并計算結(jié)合能和氫鍵數(shù)。結(jié)合能為負值說明小分子藥物配體可以與受體靶點蛋白自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能越小說明結(jié)合越穩(wěn)定，結(jié)合能＜?17.782 kJ/mol即為能較好結(jié)合。用OpenBabel將對接好的文件轉(zhuǎn)換為PDB格式，通過PyMOL（3D，Version 2.2.0）和LigPlot（2D）對偶聯(lián)模型進行可視化，并展示氫鍵，這2種模型都被廣泛應(yīng)用于可視化對接結(jié)果，包括配體與蛋白質(zhì)主鏈或側(cè)鏈元件之間的對接位點和氫鍵相互作用模式。

2.2 鴉膽子苦醇治療CRC的作用研究

2.2.1 細胞培養(yǎng) HCT116細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.2 動物模型的制備 BALB/c-Nu小鼠右背側(cè)sc 100 μL HCT116細胞（2×106個），待腫瘤生長體積為80～100 mm3，小鼠隨機分為對照組和鴉膽子苦醇（2 mg/kg）組，每組6只。鴉膽子苦醇溶于1% DMSO和20% β-環(huán)糊精中，給藥組ip藥物，對照組ip等體積的DMSO和β-環(huán)糊精，每隔1 d給藥1次。每隔1 d記錄腫瘤大小和小鼠體質(zhì)量，當(dāng)腫瘤大小達到2000 mm3時，采用頸椎脫位法處死小鼠，收集腫瘤，測量腫瘤體積和質(zhì)量，采集小鼠眶后靜脈竇全血。

2.2.3 Western blotting檢測腫瘤組織細胞周期、侵襲、遷移、增殖及EGFR/PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達 取各組小鼠腫瘤組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的預(yù)冷RIPA裂解液提取蛋白，12 000 r/min離心10 min，取上清，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉30 min，分別加入EGFR（1∶1000）、PI3K（1∶1000）、Akt（1∶1000）、CDK4（1∶1000）、cyclin B1（1∶1000）、cyclin D1（1∶1000）、cleaved Caspase-3（1∶1000）、Bax（1∶2000）、Bcl-2（1∶1000）、MMP7（1∶1500）、MMP2（1∶1000）、GAPDH（1∶20 000）抗體，4 ℃孵育過夜；加入二抗（1∶20 000），室溫孵育1 h。使用電化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，采用成像儀及Image J 2.1軟件分析條帶灰度值。

2.2.4 肝腎功及血常規(guī)指標(biāo)檢測 采用Shinova血液學(xué)分析儀分析小鼠的肝功能指數(shù)、腎功能指數(shù)和血常規(guī)指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）、總膽汁酸（total bile acid，T-BIL）、白蛋白（albumin，ALB）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，CREA）、尿酸（uric acid，UA）、白細胞（white blood cell，WBC）、紅細胞（red blood cell，RBC）、血小板（platelet，PLT）和血紅蛋白（haemoglobin，HGB）。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及分子對接

3.1.1 鴉膽子活性成分及對應(yīng)靶點的獲取 通過TCMSP檢索共獲得67個活性成分，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18作為補充條件篩選，共獲得15個鴉膽子主要活性成分（表1）。收集活性成分對應(yīng)的靶點，去除重復(fù)值后共獲得34個靶點。

表1 鴉膽子活性成分

3.1.2 CRC相關(guān)的靶點及與藥物交集靶點的獲取 Genecard數(shù)據(jù)庫中檢索到人類CRC相關(guān)的靶點共9410個，經(jīng)過用Venn 2.1.0得到32個鴉膽子與CRC的交集靶點（圖1），包括EGFR、Caspase-3、cyclin D1、CDK4、MMP-9和血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）等。

3.1.3 “活性成分-CRC”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Cytoscape 3.7.2可視化“活性成分-CRC”網(wǎng)絡(luò)（圖2），包含37個節(jié)點和97個連接。橢圓節(jié)點表示靶點，方框節(jié)點表示活性成分，灰色線表示節(jié)點間相互作用。

圖1 鴉膽子活性成分-CRC靶點Venn圖

橢圓節(jié)點表示靶點，方框節(jié)點表示活性成分，灰色線表示節(jié)點間相互作用

3.1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將32個鴉膽子與CRC交集靶點輸入STRING，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3），共獲得32個節(jié)點和152條節(jié)點之間的連線。節(jié)點是鴉膽子與CRC交集靶點編碼的蛋白，節(jié)點的連線越多，表示相互作用越多，靶點的作用越重要。根據(jù)節(jié)點的連線數(shù)量，通過Barplot計算并統(tǒng)計前30個靶點（圖4），前3名為EGFR、Caspase-3和cyclin D1。

3.1.5 GO功能和KEGG通路富集分析 如圖5所示，鴉膽子治療CRC主要涉及細胞凋亡、自噬、基因表達負調(diào)控、蛋白磷酸化以及蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等，主要作用于PI3K/Akt信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路和p53信號通路等。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)靶點分析

3.1.6 分子對接 選取PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前3名的靶點EGFR、Caspase-3及cyclin D1，分別與鴉膽子治療CRC的4個關(guān)鍵活性成分進行分子對接（圖6），LigPlot將結(jié)果二維可視化，標(biāo)明氫鍵的個數(shù)、長度及小分子藥物配體連接的氨基酸殘基（圖7）。一般認(rèn)為，小于?17.782、?20.92或?29.288 kJ/mol的結(jié)合能分別表明配體與受體之間有一定的、好的或較強的結(jié)合活性。結(jié)合能反映了受體和配體之間結(jié)合的可能性。結(jié)合能越低，受體與配體的親和力越高，構(gòu)象越穩(wěn)定。其中，鴉膽子苦醇與EGFR的結(jié)合能最低（?37.530 5 kJ/mol）。與鴉膽子苦醇和木犀草素相比，鴉膽子苷B和β-谷甾醇與3個靶點蛋白的結(jié)合能均較高，親和力較低。鴉膽子苦醇與EGFR、Caspase-3及cyclin D1的結(jié)合能分別為?37.530 5、?33.137 3、?30.710 6 kJ/mol，平均結(jié)合能為?33.792 8 kJ/mol。木犀草素與EGFR、Caspase-3及cyclin D1的結(jié)合能為?26.652 1、?30.585 0、?25.689 8 kJ/mol，平均結(jié)合能為?27.642 3 kJ/mol。

圖5 GO功能(A) 和KEGG通路(B) 富集分析(前20)

圖6 鴉膽子苦醇、木犀草素與靶點蛋白EGFR、Caspase-3和cyclin D1的3D分子對接結(jié)果

圖7 鴉膽子苦醇、木犀草素與靶點蛋白EGFR、Caspase-3和cyclin D1的2D分子對接結(jié)果

3.2 鴉膽子苦醇抗CRC的作用驗證

3.2.1 鴉膽子苦醇對荷瘤裸鼠模型腫瘤生長的影響 如圖8所示，與對照組比較，鴉膽子苦醇組裸鼠腫瘤生長速度被明顯抑制（＜0.01），證明了鴉膽子苦醇對CRC具有明顯的抑制作用。

3.2.2 鴉膽子苦醇對荷瘤裸鼠模型腫瘤組織細胞周期、侵襲、遷移、增殖及EGFR/PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達的影響 如圖9所示，與對照組比較，鴉膽子苦醇組腫瘤組織中EGFR、PI3K、Akt、CDK4、cyclin D1、MMP9、MMP7和Bcl-2蛋白表達水平均顯著降低（＜0.01），cyclin B1、cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達水平均明顯升高（＜0.01），Bax/Bcl-2值顯著升高（＜0.01）。

與對照組比較：**P＜0.01，下圖同

圖9 鴉膽子苦醇對荷瘤裸鼠模型腫瘤組織EGFR、PI3K、Akt、CDK4、cyclin D1、cyclin B1、MMP9、MMP7、cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響(, n = 3)

3.2.3 鴉膽子苦醇對荷瘤裸鼠生物安全性評價 為研究鴉膽子苦醇對荷瘤裸鼠代謝器官的影響，檢測對照組和鴉膽子苦醇組荷瘤裸鼠的肝功能指標(biāo)（ALT、AST、ALB、γ-GT、T-BIL）及腎功能指標(biāo)（BUN、CREA、UA）和血常規(guī)指標(biāo)（WBC、RBC、PLT、HGB），如圖10所示，與對照組比較，鴉膽子苦醇組荷瘤裸鼠肝、腎功能和血常規(guī)指標(biāo)均無顯著差異。

圖10 鴉膽子苦醇的生物安全性評估(, n = 3)

4 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析鴉膽子的主要活性成分及其抗CRC的潛在機制，共獲得鴉膽子苦醇、木犀草素、鴉膽子苷B、β-谷甾醇4個小分子藥物活性成分和EGFR、Caspase-3、cyclin D1等32個核心靶點。KEGG通路富集分析表明鴉膽子抑制CRC可能與PI3K/Akt通路、TNF信號通路和p53信號通路等相關(guān)。在4個活性成分中，鴉膽子苦醇和木犀草素對應(yīng)的靶點明顯多于鴉膽子苷B和β-谷甾醇。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的核心成分鴉膽子苦醇及木犀草素與關(guān)鍵靶點蛋白進行分子對接，2個核心成分與EGFR、Caspase-3和cyclin D1蛋白的活性結(jié)合位點的結(jié)合能均小于?16.736 kJ/mol，表明核心成分與關(guān)鍵的靶點蛋白之間可以自發(fā)結(jié)合且具有較強的結(jié)合活性。在篩選的4種鴉膽子活性成分中，鴉膽子苦醇和木犀草素均可與EGFR相互作用，EGFR是多種靶向藥物的治療靶點，如吉非替尼和厄洛替尼用于治療非小細胞肺癌，拉帕替尼用于治療晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素與EGFR的Lys721、Glu738、Ala731形成3個氫鍵，鴉膽子苦醇與EGFR的Ile917形成1個氫鍵。木犀草素和鴉膽子苦醇對EGFR的親和力表明木犀草素-EGFR、鴉膽子苦醇-EGFR相互作用的有效性。

鴉膽子苦醇是鴉膽子的主要活性成分。已有研究證實，鴉膽子苦醇可以阻斷PI3K/Akt通路的信號傳導(dǎo)，抑制胃癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[20]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果表明，鴉膽子苦醇可通過EGFR/PI3K/ Akt通路抗CRC。進一步通過Western blotting實驗驗證了鴉膽子苦醇可以使該級聯(lián)通路明顯失活從而達到抑制CRC，驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果。本研究通過構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，研究了鴉膽子苦醇對CRC的治療作用。鴉膽子苦醇明顯抑制荷瘤裸鼠模型體內(nèi)腫瘤的生長，同時與代謝相關(guān)的肝臟功能和腎臟功能未受到明顯的影響，血常規(guī)指標(biāo)也沒有觀察到顯著差異。表明鴉膽子苦醇具有很好的抑制CRC腫瘤細胞生長的作用。細胞周期與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，主要由G1/G0和G2/M期組成，由cyclin/CDK復(fù)合物和CDK抑制劑協(xié)調(diào)。研究表明，鴉膽子苦醇通過作用于CDK4和cyclin D1調(diào)節(jié)非小細胞肺癌的G1/G0期，cyclin D1表達的降低導(dǎo)致G1/G0期細胞的阻滯[21]，與本研究的結(jié)果一致，表明鴉膽子苦醇能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞的G1/G0期阻滯，從而抑制腫瘤細胞增殖。誘導(dǎo)細胞凋亡是抑制腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，受Caspase和Bcl-2家族蛋白的調(diào)控，Bcl-2家族蛋白包括促凋亡效應(yīng)蛋白如Bax和抗凋亡效應(yīng)蛋白如Bcl-2。促凋亡效應(yīng)蛋白在凋亡應(yīng)激源的作用下導(dǎo)致線粒體外膜通透化，釋放細胞色素C來切割Caspase-3，從而導(dǎo)致不可逆的細胞凋亡。鴉膽子苦醇可通過上調(diào)cleaved Caspase-3表達和Bax/Bcl-2值，促進多種腫瘤細胞凋亡[22]，與本研究結(jié)果一致，表明鴉膽子苦醇可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，可能涉及線粒體凋亡途徑。腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的相關(guān)因素。細胞外基質(zhì)被MMP修飾和降解，從而導(dǎo)致腫瘤細胞的分離和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇能夠降低腫瘤組織中MMP7和MMP9的表達，具有抑制腫瘤細胞侵襲和遷移的能力，與鴉膽子苦醇對胃癌SGC-7901細胞的作用一致[19]。

藥物的積累和清除可能損害器官。因此，通過對小鼠的血液生化指標(biāo)來評估鴉膽子苦醇是否具有潛在的毒性作用。結(jié)果顯示，肝、腎功能和血常規(guī)指標(biāo)未見藥物引起的顯著性差異。因此，鴉膽子苦醇是一種安全、有效、有前景的抗腫瘤佐劑。然而，本研究有幾個局限性：①來自在線數(shù)據(jù)庫的信息是基于審查和預(yù)測的數(shù)據(jù)，因此，未經(jīng)證實和未記錄的化合物或靶點可能未被列入本研究中；②目前對鴉膽子15種化合物的定量測定研究尚不完全，因此，未來應(yīng)進行內(nèi)容確定的研究；③鴉膽子苦醇雖然為鴉膽子抗CRC的最重要的生物活性成分，但不能完全代表鴉膽子，因此，需要進一步的研究來探索鴉膽子體內(nèi)外治療CRC的潛在分子機制。

本研究先通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)闡明了鴉膽子抗CRC最重要的4個生物活性成分（鴉膽子苦醇、木犀草素、鴉膽子苷B、β-谷甾醇）和3個重要靶點（EGFR、Caspase-3、cyclin D1），主要作用于EGFR/ PI3K/Akt信號通路；通過分子對接技術(shù)驗證了活性成分與靶點的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦醇是鴉膽子抗CRC的關(guān)鍵成分；體內(nèi)實驗進一步證明了鴉膽子苦醇抗CRC的作用及分子機制，為鴉膽子治療CRC提供了實驗依據(jù)，并為從中藥中探究活性成分、核心靶點和潛在機制提供了方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism ofin treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and molecular docking

ZHAO Wei-xin, WANG Qing, WANG Meng-qi, JI An-xuan, ZHENG Jing-ying, ZHAO Shu-hua

Department of Obstetrics and Gynecology, Second Hospital of Jilin University, Changchun 130022, China

To explore the active components, key targets and potential mechanisms ofin treatment of colorectal cancer by network pharmacology combined with molecular docking andverification.The active components, corresponding targets and colorectal cancer-related targets ofwere retrieved and collected from the public database. The active components, component-disease intersection targets and possible signal pathways ofin treatment of colorectal cancer were analyzed through network pharmacology. Binding ability of active components to target protein was predicted by molecular docking. The effect and mechanism ofactive components in treatment of colorectal cancer were further verified byexperiments.Among the 15 components that met the screening conditions, four bioactive components (brusatol, luteolin, bruceoside B, β-sitosterol) and 32 therapeutic targets ofwere screened. The epidermal growth factor receptor (EGFR), cystein-asparate protease-3 (Caspase-3) and cyclin D1 were the key targets ofin the treatment of colorectal cancer. EGFR/phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) signaling pathway may played an important role ofin treatment of colorectal cancer. The results of molecular docking showed that all four bioactive components could bind well, and average binding energy of brusatol with three key targets was the most negative and the binding was the most stable, which may be the most effective active component ofagainst colorectal cancer. The results of animal experiments showed that compared with control group, brusatol significantly inhibited the volume and weight of transplanted tumor in nude mice (< 0.01), down-regulated the protein expression levels of EGFR, PI3K and Akt in tumor tissues (< 0.01), down-regulated cyclin D1 and cyclin-dependent kinase 4 (CDK4) expressions (< 0.01), up-regulated the expressions of tumor cell apoptosis related protein such as cleaved Caspase-3 and B-cell lymphoma-2 associated X protein (Bax)/B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) (< 0.01), down-regulated the expressions of migration and invasion related proteins such as matrix metalloproteinase 9 (MMP9) and MMP7 (< 0.01); There was no significant difference in liver function, renal function and blood indexes of nude mice in brusatol group.can treat colorectal cancer through multiple targets and channels, and its main active component is bruceol. Its mechanism may be related to inhibiting EGFR/PI3K/Akt signaling pathway, thus causing G1/G0phase block, inhibiting proliferation, invasion and migration, and promoting cell apoptosis.

(L.) Merr.; brusatol; colorectal cancer; network pharmacology; molecular docking; luteolin; bruceoside B; β-sitosterol; epidermal growth factor receptor; cystein-asparate protease-3; cyclin D1

R285.5

A

0253 - 2670(2023)06 - 1850 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.017

2022-10-29

吉林省發(fā)展和改革委員會項目（2014G073）；吉林省直廳局項目（2019SCZT040）；吉林省科技廳基礎(chǔ)處項目（20200201589JC）

趙韋欣，女，碩士，研究方向為婦產(chǎn)科學(xué)。Tel: 18438611878 E-mail: zhaoweixinxin@163.com

鄭晶瑩，博士。E-mail: zheng_jy@jlu.edu.cn

趙淑華，女，教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail: zhaoshuhua-1966@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]