蔣思絨，王路雅，賈雯靖，伍 立，梅麗娟，邵 赟，陶燕鐸*，岳會(huì)蘭*

唐古特白刺果實(shí)酚酸類化學(xué)成分及α葡萄糖苷酶抑制活性研究

蔣思絨1, 2，王路雅1, 2，賈雯靖1, 2，伍 立1, 2，梅麗娟1，邵 赟1，陶燕鐸1*，岳會(huì)蘭1*

1. 中國(guó)科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青海省藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

對(duì)蒺藜科白刺屬植物唐古特白刺果實(shí)中酚酸類成分及α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行研究。采用硅膠柱色譜、MCI色譜及半制備高效液相色譜法等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分離純化，結(jié)合NMR和MS等波譜學(xué)數(shù)據(jù)鑒定單體化合物結(jié)構(gòu)，對(duì)化合物的蔗糖酶和麥芽糖酶抑制活性進(jìn)行篩選，并對(duì)活性較好的化合物進(jìn)行蔗糖酶和麥芽糖酶分子對(duì)接分析。從唐古特白刺果實(shí)中分離得到11個(gè)化合物，分別鑒定為6-對(duì)香豆?；?α-槐糖（1）、6--對(duì)香豆?；?β-吡喃葡萄糖基-(1-2)-α-甘露糖（2）、4-羥基苯甲酸（3）、香草酸（4）、原兒茶酸甲酯（5）、對(duì)香豆酸（6）、咖啡酸（7）、6--對(duì)香豆酰基半乳糖（8）、反式-4--β吡喃喃葡糖基阿魏酸（9）、cynarin（10）、芍藥苷（11）?；衔?對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶的半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值分別為809.1和768.5 μmol/L，化合物10的IC50值分別為473.3和114.3 μmol/L；分子對(duì)接顯示化合物7對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶結(jié)合自由能分別為?27.6和?25.5 kJ/mol，化合物10的結(jié)合自由能分別為?36.8、?36.4 kJ/mol?；衔?和2是新化合物，并分別命名為香豆酰苷A和香豆酰苷B；化合物5、8～10首次從該屬植物中分離得到，并且化合物7和10對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶都具有較好的抑制活性。

唐古特白刺；酚酸；蔗糖酶；麥芽糖酶；香豆酰苷A；香豆酰苷B；原兒茶酸甲酯；6--對(duì)香豆?；肴樘?/p>

唐古特白刺Bobr. 是蒺藜科（Zygophyllceae）白刺屬L.的一種落葉灌木，為藥食同源的野生植物，有著很高的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和藥用價(jià)值。唐古特白刺在我國(guó)陜西北部、內(nèi)蒙古西部、寧夏、甘肅河西、青海、新疆及西藏東北部等地區(qū)廣泛分布[1]，主要生于荒漠和半荒漠的湖盆沙地、河流階地、山前平原積沙地、有風(fēng)積沙的黏土地[1]?！侗静菔斑z》記載“東廧（白刺古名），味甘平、無(wú)毒，益氣輕身（減肥），久服不饑，堅(jiān)筋骨”。在民間唐古特白刺的果實(shí)常用于治療脾胃虛弱、消化不良、神經(jīng)衰弱、高血糖、頭暈、感冒和乳汁不下等癥[2]。現(xiàn)代藥理研究表明唐古特白刺具有抗氧化、降低血糖和增強(qiáng)免疫力的作用[3-5]?；瘜W(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)，其主要含有生物堿、黃酮以及酚酸類化合物[6-8]。前期本小組發(fā)現(xiàn)唐古特白刺可以通過(guò)抑制動(dòng)物來(lái)源α-葡萄糖苷酶（蔗糖酶和麥芽糖酶）的活性來(lái)控制糖尿病小鼠的餐后血糖[9-10]，但是其有效成分研究報(bào)道較少。酚酸類化合物廣泛分布于果實(shí)中，并且研究發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸[11-12]、鞣質(zhì)酸[13-14]、鞣花酸[15]、咖啡酸及其衍生物[16-17]等酚酸類化合物能有效地抑制α-葡萄糖苷酶的活性。為了探究唐古特白刺糖苷酶抑制有效成分，本實(shí)驗(yàn)對(duì)唐古特白刺的酚酸類化學(xué)成分和α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行了研究。

本實(shí)驗(yàn)從唐古特白刺果汁中分離得到11個(gè)酚酸類化合物，分別鑒定為6-對(duì)香豆?；?α-槐糖（6---coumaroyl-α-sophorose，1）、6--對(duì)香豆?；?β-吡喃葡萄糖基-(1-2)-α-甘露糖[6--- coumaroyl-β-glucopyranosyl-(1-2)-α-mannopyranose，2]、4-羥基苯甲酸（4-hydroybenzoic acid，3）、香草酸（vanillic acid，4）、原兒茶酸甲酯（protocatechuic acid methyl ester，5）、對(duì)香豆酸（-coumarinic acid，6）、咖啡酸（caffeic acid，7）、6--對(duì)香豆?；肴樘牵?---coumaroyl--galactopyranose，8）、反式-4--β吡喃喃葡糖基阿魏酸（-4--βglupyransylferlic acid，9）、cynarin（10）、芍藥苷（paeoniflorin，11）。其中，化合物1和2是新化合物，分別命名為香豆酰苷A和香豆酰苷B，化合物5、8、9和10首次從該屬植物中分離得到。體外酶活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，化合物7和10對(duì)蔗糖酶和麥芽糖都具有較好的抑制活性，化合物7對(duì)于蔗糖酶和麥芽糖酶的半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值分別為809.1、768.5 μmol/L，化合10的IC50值分別為473.3、114.3 μmol/L。采用分子對(duì)接技術(shù)模擬化合物7和10與靶標(biāo)蛋白蔗糖酶和麥芽糖酶活性位點(diǎn)的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)它們可以通過(guò)疏水作用、氫鍵作用和π-π共軛與蛋白活性口袋結(jié)合。

1 材料

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀（Agilent公司）；NP7005C RPC18型半制備液相色譜（江蘇漢邦科技有限公司）；N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA公司）；UPT-I-5207型純水儀（成都超純水科技有限公司）；Agilent MSD-Trap-XCT型質(zhì)譜儀（Agilent公司）；Bruker Avance 600型核磁共振儀（Bruker公司）；Epoch2酶標(biāo)儀（Bio Tek公司）；AB-8大孔樹脂（天津南開大學(xué)化工廠）；HP20SS MCI（三菱化學(xué)株式會(huì)社）；Sephadex LH-20（Cytiva公司）；色譜柱硅膠（100～200目），薄層用硅膠（青島海洋化工廠）；AB-8大孔樹脂（天津南開大學(xué)化工廠）；XCharge C18（250 mm×20 mm，5 μm），Megres C18（250 mm×20 mm，10 μm），XAmide（250 mm×20 mm，10 μm），北京華譜新創(chuàng)科技有限公司；Fisher色譜級(jí)乙腈，制備乙腈（云南新藍(lán)景化學(xué)工業(yè)有限公司）；其他試劑均為分析級(jí)（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；蔗糖和麥芽糖（Solaibo公司）；阿卡波糖（成都德思特生物技術(shù)有限公司）；葡萄糖測(cè)定試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司）。

1.2 材料

唐古特白刺成熟果實(shí)于2020年9月在青海省海西州采集，由中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所梅麗娟研究員鑒定，標(biāo)本（MK347423）保存于中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，雄性，6周齡，體質(zhì)量190～210 g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理均符合3R原則。

2 方法

2.1 提取分離

唐古特白刺新鮮果實(shí)（110 kg）榨汁后濃縮為約25 L，采用醇沉法（75%乙醇）除去蛋白質(zhì)、果膠和部分糖，濃縮后的樣品經(jīng)AB-8大孔樹脂色譜柱，分別用反滲透水（RO水）、40%乙醇和95%乙醇洗脫得到3個(gè)組分。40%乙醇部位（490 g）RO水溶解后上MCI色譜柱，經(jīng)RO水及20%、40%、80%、100%甲醇洗脫得到4個(gè)組分Fr 40-1～40-4。

組分Fr 40-1（290.3 g）再次經(jīng)MCI色譜柱，用RO水及10%、20%、30%、40%、50%、100%甲醇洗脫，得到了7個(gè)組分Fr 40-1-1～40-1-7。組分Fr 40-1-2（34.7 g）重結(jié)晶后的濾液經(jīng)凝膠色譜柱洗脫得到6個(gè)組分Fr 40-1-2-1～40-1-2-6。組分Fr 40-1-2-1（1.3 g）經(jīng)制備色譜柱Megres C18分離，用乙腈-0.2%甲酸水洗脫（0～50 min，5%～20%乙腈，體積流量19 mL/min）得到12個(gè)組分Fr 40-1-2-1-1～40-1-2-1-12；組分Fr 40-1-2-1-8再經(jīng)XCharge C18色譜柱（5%乙腈，體積流量19 mL/min）純化得到化合物4（R＝26 min，8.5 mg）。組分Fr 40-1-2-3（1.8 g）經(jīng)XCharge C18色譜柱分離（0～60 min，5%～25%乙腈）得到13個(gè)組分Fr 40-1-2-3-1～40-1-2-3-13；組分Fr 40-1-2-3-3、Fr 40-1-2-3-5和Fr 40-1-2-3-6用色譜柱Megres（10%乙腈）純化后分別得到化合物9（R＝18 min，4.9 mg）、2（R＝20 min，4.9 mg）和1（R＝24 min，8.7 mg）。組分Fr 40-1-2-4（537.6 mg）2次經(jīng)XCharge C18（10%乙腈）純化后得化合物3（R＝17 min，23.9 mg）。組分Fr 40-1-2-5（877.5 mg）經(jīng)色譜柱XCharge C18（0～50 min，10%～30%乙腈）后被分為7個(gè)組分Fr 40-1-2-5-1～Fr 40-1-2-5-7, 組分Fr 40-1-2-5-7再用Megres C18制備柱（20%乙腈）純化得到化合物11（R＝32 min，7.8 mg）。Fr 40-1-3（53.07 g）經(jīng)硅膠色譜柱（二氯甲烷-甲醇1∶0～1∶1）分離為12個(gè)組分Fr 40-1-3-1～40-1-3-12，組分Fr 40-1-3-2和Fr 40-1-3-4經(jīng)Xcharge C18（分別用10%和13%乙腈）純化后得到化合物8（R＝29 min，2.9 mg）和10（R＝23 min，2.4 mg）。組分Fr 40-1-4（2.7 g）用XCharge色譜柱（0～60 min，10%～35%乙腈）分離為8個(gè)組分Fr 40-1-4-1～40-1-4-8；Fr 40-1-4-1（10%乙腈）和Fr 40-1-4-2（13%乙腈）用Megres C18純化后得到化合物6（R＝21 min，26.4 mg）、5（R＝31 min，20.4 mg）和7（R＝24 min，11.1 mg）。

2.2 蔗糖酶和麥芽糖酶的提取及活力測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法[10,18]，SD大鼠飼養(yǎng)3周，禁食12 h后處死并取出小腸于冰臺(tái)上，剖開小腸并暴露出腸黏膜，用4℃預(yù)冷的PBS沖洗拭干后，用玻片刮取腸壁黏膜。按質(zhì)量與體積比1∶5加入PBS，勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清分裝后保存在?20 ℃冰箱備用。

將葡萄糖配成7個(gè)不同濃度的溶液（1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 mmol/L)，分別與葡萄糖測(cè)定工作液反應(yīng)后在505 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（）值，以濃度為橫坐標(biāo)（），值為縱坐標(biāo)（），繪制濃度與值標(biāo)準(zhǔn)曲線。50 μL的酶提取液和50 μL 0.25 mol/L的蔗糖（麥芽糖）溶液加入到48孔板中，在37 ℃、600 r/min孵育20 min后100 ℃蒸煮15 min使蛋白變性，再加葡萄糖測(cè)定工作液，反應(yīng)后檢測(cè)。計(jì)算葡萄糖濃度、蔗糖酶和麥芽糖酶的活力（1 L溶液中每分鐘產(chǎn)生1 μmol的葡萄糖為1 U酶活力）。標(biāo)準(zhǔn)曲線為＝1.926 7＋0.056 4，2＝0.999 6。提取液中蔗糖酶和麥芽糖的活力分別為65.05和81.2 U/mL。

2.3 蔗糖酶和麥芽糖酶抑制活性實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)方法[10,18]，50 μL 13.01 U/mL的蔗糖酶（10.15 U/mL的麥芽糖酶）和50 μL 400 μmol/L的樣品加入到48孔板，在37 ℃、600 r/min的條件下孵育10 min，放到冰臺(tái)上等溫度下降后加入50 μL 50 mmol/L的蔗糖溶液（1 mmo/L的麥芽糖），37 ℃、 600 r/min孵育20 min。100 ℃蒸煮15 min使蛋白變性后加入葡萄糖檢測(cè)工作液測(cè)定葡萄糖濃度，并計(jì)算樣品對(duì)蔗糖酶或麥芽糖酶的抑制活性。

抑制率＝1—(實(shí)驗(yàn)—本底)/(對(duì)照—空白)

實(shí)驗(yàn)為含有樣品、酶液和蔗糖或葡萄糖溶液孔的值；本底為只含有樣品和酶液，蔗糖或葡萄糖溶液用等體積PBS代替孔的值；對(duì)照為只含有酶液和蔗糖或葡萄糖溶液，樣品用等體積PBS代替孔的值；空白為只含有PBS孔的值

2.4 分子對(duì)接

將“2.3”項(xiàng)中得到的酶抑制活性較好的化合物與蔗糖酶和麥芽糖酶進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)。蔗糖酶（PDB ID：3LPO）和麥芽糖酶（PDB ID：2QMJ）的晶體結(jié)構(gòu)從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）中獲取，蔗糖酶蛋白選用D鏈進(jìn)行分子對(duì)接；用于分子對(duì)接的化合物從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載；使用PyMOL 2.5軟件除蛋白中水分子和其他不期望的結(jié)構(gòu)；使用AutoDock Vina 1.1.2進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合帶有晶體配體定義包裹口袋的盒子（尺寸為3 nm×3 nm×3nm）。通過(guò)ADFR套件1.0軟件將小分子和蛋白質(zhì)文件轉(zhuǎn)換為PDBQT格式。最后，利用對(duì)接進(jìn)行半柔性對(duì)接，內(nèi)部聚類后輸出最多50個(gè)姿勢(shì)，并基于PyMOL 2.5進(jìn)一步可視化最佳評(píng)分構(gòu)象。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1和2的1H-NMR和13C-NMR (600/150 MHz, DMSO-d6)數(shù)據(jù)

圖1 化合物1和2的結(jié)構(gòu)及主要的HMBC、NOE和1H-1H COSY相關(guān)

化合物3：白色無(wú)定形粉末，1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 7.79 (2H, d,= 8.2 Hz, H-2, 6), 6.82 (2H, d,= 8.2 Hz, H-3, 5)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 167.4 (-COOH), 161.6 (C-4), 131.6 (C-2, 6), 121.3 (C-1), 115.2 (C-3, 5)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]，故鑒定化合物3為4-羥基苯甲酸。

化合物4：白色無(wú)定形粉末，1H-NMR (600 MHz, DMSO-d): 7.44 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2), 7.43 (1H, s, H-6), 6.84 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5), 3.80 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 167.7 (-COOH), 151.5 (C-4), 147.7 (C-3), 123.9 (C-1), 122.2 (C-6), 115.5 (C-2), 113.2 (C-5), 56.0 (-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)一致[23]，故鑒定化合物4為香草酸。

化合物5：黃褐色無(wú)定形粉末，1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 7.37 (1H, d,= 1.8 Hz, H-2), 7.32 (1H, dd,= 8.1, 1.8 Hz, H-6), 6.82 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5), 3.75 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 166.3 (-CO-), 150.7 (C-4), 145.2 (C-3), 121.8 (C-1), 120.4 (C-6), 116.2 (C-2), 115.4 (C-5), 51.6 (-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)一致[24]，故鑒定化合物5為原兒茶酸甲酯。

化合物6：黃色無(wú)定形粉末，1H-NMR (600 MHz, DMSO-d): 7.51 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2, 6), 7.50 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 6.81 (2H, d,= 8.4 Hz, H-3, 5), 6.31 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 168.3 (C-9), 159.6 (C-4), 144.0 (C-7), 130.1 (C-2, 6), 125.4 (C-1), 115.8 (C-3, 5), 115.8 (C-8)。上述數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)一致[25]，故鑒定化合物6為香豆素酸。

化合物7：淡黃色無(wú)定形粉末，1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 7.40 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 7.01 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 6.94 (1H, dd,= 8.1, 2.0 Hz, H-6), 6.76 (1H,= 8.1 Hz, H-5), 6.17 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8)；13C NMR (150 MHz, DMSO-6): 168.6 (C-9), 148.2 (C-4), 145.7 (C-3), 144.2 (C-7), 125.8 (C-1), 121.1 (C-6), 115.8 (C-5, 8), 114.6 (C-2)。上述數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)一致[26]，故化合物7鑒定為咖啡酸。

化合物8：灰白色無(wú)定形粉末，1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 7.57 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 7.53 (2H, d,= 8.6 Hz, H-2, 6), 6.79 (2H, d,= 8.6 Hz, H-3, 5), 6.39 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8), 4.92 (1H, d,= 3.4 Hz, H-1), 4.32 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1), 4.40 (1H, dd,= 11.7, 1.7 Hz, H-6), 4.10 (1H, dd,= 11.7, 6.6 Hz, H-6), 3.00～3.50 (5H, m, sugar-H), 2.93 (1H, t,= 8.3 Hz, H-3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 166.7 (C-9), 160.0 (C-4), 145.0 (C-7), 130.4 (C-2, 6), 125.0 (C-1), 115.8 (C-3, 5), 114.0 (C-8), 92.3 (C-1), 76.4 (C-5), 74.7 (C-3), 73.6 (C-2), 72.2 (C-4), 64.0 (C-6)。上述數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)一致[27]，故鑒定化合物8為6--對(duì)香豆素酰基半乳糖。

化合物9：白色針狀結(jié)晶（甲醇），1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 7.53 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 7.33 (1H, s, H-2), 7.17 (1H, d,= 8.1 Hz, H-6), 7.09 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5), 6.47 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8), 4.98 (1H, d,= 6.5 Hz, H-1), 3.82 (3H, s, -OCH3), 3.17～3.70 (7H, m, sugar-H)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 168.5 (C-9), 149.6 (C-3), 148.8 (C-4), 144.4 (C-7), 128.7 (C-1), 122.6 (C-6), 118.1 (C-5), 115.4 (C-8), 115.6 (C-2), 100.1 (C-1), 77.5 (C-2), 77.3 (C-5), 73.6 (C-3), 70.1 (C-4), 61.1 (C-6), 56.2 (-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)一致[28]，故鑒定化合物9為反式-4--β吡喃喃葡糖基阿魏酸。

化合物10：白色無(wú)定形粉末，1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 7.41 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 7.40 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 7.01 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 6.90 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 6.87 (2H, dd,= 8.2, 2.0 Hz, H-6, H-6), 6.66 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5, 5), 6.20 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8), 6.06 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8), 5.28 (1H, dd,= 7.1, 3.5 Hz, H-3), 5.00 (1H, d,= 5.0 Hz, H-5), 3.49 (1H, m, H-4), 2.61 (1H, m, H-2), 2.26 (1H, m, H-2), 2.47 (1H, m, H-6), 1.71 (1H, m, H-6)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 172.9 (C-7), 166.5 (C-9), 165.7 (C-9), 149.0 (C-4), 148.5 (C-4), 146.0 (C-7), 146.0 (C-7), 145.8 (C-3), 145.3 (C-3), 125.8 (C-1), 125.7 (C-1), 121.4 (C-6), 120.4 (C-6), 116.4 (C-5), 116.3 (C-5), 116.2 (C-2), 115.8 (C-2), 114.9 (C-8), 114.5 (C-8), 79.9 (C-1), 73.3 (C-4), 71.5 (C-3), 66.4 (C-5), 32.3 (C-2)。上述數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)一致[29-30]，故鑒定化合物10為cynarin。

化合物11：灰白色無(wú)定形粉末，1H NMR (600 MHz, DMSO-6): 8.00 (2H, d,= 6.8 Hz, H-2, 6), 7.68 (1H, d,= 6.3 Hz, H-4), 7.55 (2H, d,= 6.8 Hz, H-3, 5), 5.33 (1H, s, H-9), 4.65 (1H, d,= 10.7 Hz, H-8), 4.40 (1H, d,= 6.9 Hz, H-4), 3.66 (1H, d,= 10.7 Hz, H-8), 2.45 (1H, s, H-5), 2.39 (1H, d,= 12.0 Hz, H-7), 2.06 (1H, d,= 11.9 Hz, H-3), 1.82 (1H, d,= 11.9 Hz, H-3), 1.66 (1H, d,= 12.0 Hz, H-7), 1.25 (1H, s, H-10)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 166.2 (-CO-), 133.5 (C-4), 130.1 (C-1), 129.8 (C-2, 6), 129.3 (C-3, 5), 105.2 (C-4), 100.5 (C-9), 99.1 (C-1), 88.0 (C-1), 85.4 (C-2), 77.5 (C-2), 77.4 (C-5), 73.9 (C-3), 70.7 (C-6), 70.4 (C-4), 61.7 (C-6), 60.9 (C-8), 44.1 (C-3), 42.8 (C-5), 22.5 (C-7), 19.6 (C-10)。上述數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)一致[31]，故鑒定化合物11為芍藥苷。

3.2 蔗糖酶和麥芽糖酶抑制活性

通過(guò)蔗糖酶和麥芽糖抑制活力實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)化合物5、7和10（400 μmol/L）對(duì)蔗糖酶的抑制率較高，抑制率均在30%以上，其中化合物10的抑制率達(dá)到了65.02%?；衔?和10對(duì)麥芽糖酶的抑制率均在40%以上，化合物10的抑制率達(dá)到了77.91%，結(jié)果見(jiàn)圖2。通過(guò)構(gòu)效關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)化合物7較化合物6在苯環(huán)多了4,5鄰位取代羥基，化合物7對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶抑制率高于化合物6。化合物9的4,5鄰位取代羥基被甲基和葡萄糖取代后酶抑制活性均下降，并且化合物10在結(jié)構(gòu)上有2個(gè)咖啡酸（化合物7）結(jié)構(gòu)，蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制率高于化合物7。由以上結(jié)果推測(cè)，該類化合物的對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶起抑制作用的關(guān)鍵官能團(tuán)可能為苯環(huán)4,5鄰位取代羥基。

對(duì)化合物7、11和阿卡波糖進(jìn)行IC50值的測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。阿卡波糖對(duì)于蔗糖酶和麥芽糖酶的IC50值分別為1.096 μmol/L（95%的置信區(qū)間：0.969 1～1.244 0）和0.384 μmol/L（95%的置信區(qū)間：0.331 8～0.442 7），數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道相近[32]。化合物7蔗糖酶和麥芽糖的IC50值分別為809.1 μmol/L（95%的置信區(qū)間760.4～868.1）和768.5 μmol/L（95%的置信區(qū)間650.8～941.2），化合物10的分別為473.3 μmol/L（95%的置信區(qū)間440.9～509.6）和114.3μmol/L（95%的置信區(qū)間102.5～127.5）。

圖2 化合物1～11對(duì)蔗糖酶(A) 和麥芽糖酶(B) 的抑制率

3.3 分子對(duì)接結(jié)果

對(duì)活性較好的化合物7和10與靶標(biāo)蛋白蔗糖酶和麥芽糖酶進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果如圖4所示。圖中藍(lán)色stick為小分子化合物，淡青色Cartoon為麥芽糖酶蛋白，黃色虛線表示氫鍵作用，灰色虛線表示疏水作用，綠色虛線表示π-π共軛作用。并且蛋白活性口袋中氨基酸殘基與小分子化合物作用區(qū)域放大后展示在右側(cè)。結(jié)果顯示化合物7與蔗糖酶活性口袋中的氨基酸殘基TRP-327，PHE-604和TRP-435形成疏水作用；與ASP-472形成氫鍵作用?；衔?與麥芽糖酶活性口袋中的氨基酸殘基 TRP-406和TYR-299形成疏水作用；與HIS-600、ASP-203和ARG-526形成氫鍵作用；與PHE-575形成π-π共軛作用?；衔?0與蔗糖酶活性口袋中的氨基酸殘基LYS-509、TRP-435、LEU-233、TRP-327和PHE-604形成疏水作用；與GLN-481、ASP-503、HIS-629、GLN-232、LEU-233和ARG-230形成氫鍵作用?；衔?0與麥芽糖酶活性口袋中的氨基酸殘基TRP-406、PHE-575、TYR-299和ASP-542形成疏水作用；與HIS-600、ARG-526、ARG-202、THR-205、GLN-603和ASP-443形成氫鍵作用；與PHE-575形成π-π共軛作用。結(jié)合自由能也是評(píng)價(jià)小分子化合物與靶標(biāo)蛋白結(jié)合強(qiáng)度的重要指標(biāo)，結(jié)合能越低，結(jié)合強(qiáng)度越大[33]?；衔?對(duì)蔗糖酶和麥芽糖酶結(jié)合自由能分別為?27.6和?25.5 kJ/mol，化合物10的結(jié)合自由能分別為?36.8和?36.4 kJ/mol，化合物10表現(xiàn)出較強(qiáng)結(jié)合能力，這與體外酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖3 阿卡波糖(A)、化合物7和10(B)的蔗糖酶(I)和麥芽糖酶 (II) 抑制活性

圖4 化合物7和10與蔗糖酶(A：7，B：10) 和麥芽糖酶(C：7，D：10) 蛋白活性位點(diǎn)對(duì)接圖

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)唐古特白刺能夠通過(guò)抑制蔗糖酶和麥芽糖酶的活性控制糖尿病小鼠的餐后血糖[10]，但是其降血糖活性成分研究的文獻(xiàn)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)從唐古特白刺果汁40%乙醇部位中分離鑒定了11個(gè)酚酸類化合物，其中化合物1和2是新化合物，化合物5、8、9和10首次從白刺屬植物中分離得到。并對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行體外酶活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)化合物7和10對(duì)蔗糖酶和麥芽糖都具有較好的抑制活性。本研究一方面進(jìn)一步豐富了唐古特白刺的化學(xué)成分的研究，另一方面對(duì)完善唐古特白刺抗糖尿病作用的物質(zhì)基礎(chǔ)具有一定意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on phenolic acids and α-glucosidase inhibitory activity offruit

JIANG Si-rong1, 2, WANG Lu-ya1, 2, JIA Wen-jing1, 2, WU Li1, 2, MEI Li-juan1, SHAO Yun1, TAO Yan-duo1, YUE Hui-lan1

1. Key Laboratory of Tibetan Medicine Research, Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Science, Xining 810008, China 2. University of Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China

To study the phenolic acids and α-glucosidase inhibitory activity offruit.It was separated and purified by silica gel column chromatography, MCI medium pressure chromatography and semi-preparative high performance liquid chromatography. The compound structure was identified by combining NMR and MS spectroscopy data. The inhibitory activities of the compounds on sucrase and maltase were screened, then the compounds with better activities were analyzed by molecular docking with sucrase and maltase.Eleven compounds were isolated from juice of, which were identified as 6---coumaroyl-α-sophorose (1), 6---coumaroyl-β-glucopyranosyl-(1-2)-α-mannopyranose (2), 4-hydroybenzoic acid (3), vanillic acid (4), protocatechuic acid methyl ester (5),-coumarinic acid (6), caffeic acid (7), 6---coumaroylgalactopyranose (8), trans-4--βglupyransylferlic acid (9), cynarin (10), and paeoniflorin (11). The IC50values of compound 7 on sucrase and maltose were 809.1 and 768.5 μmol/L, respectively, and the IC50values of compound 10 were 473.3 and 114.3 μmol/L, respectively. The molecular docking results showed that the binding free energies of compounds 7 and 10 against sucrase and maltase were ?27.6 and ?25.5 kJ/mol, and ?36.8 and ?36.4 kJ/mol, respectively.Compounds 1 and 2 are new compounds, and named tanguate A and tanguate B, respectively. Compounds 5, 8, 9 and 10 are isolated first time from, and compounds 7 and 10 have good inhibitory activities on sucrase and maltase.

Bobr.; phenolic acids; sucrase; maltase; tanguate A; tanguate B; protocatechuic acid methyl ester; 6---coumaroylgalactopyranose

R284.1

A

0253 - 2670(2023)06 - 1719 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.003

2022-11-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31900298）；青海省自然基金面上項(xiàng)目（2022-ZJ-908）

蔣思絨（1994—），女，博士研究生，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。Tel: 1980120457 E-mail: 15671620550@163.com

陶燕鐸，博士生導(dǎo)師，研究員，主要從事天然藥物化學(xué)研究。E-mail: taoyanduo@163.com

岳會(huì)蘭，碩士導(dǎo)師，副研究員，主要從事天然藥物化學(xué)研究。E-mail: hlyue@nwipb.cas.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]