倪香艷 孫念霞 于寒冰 方 芳 孫志文

(1. 北京市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,北京 102629；2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué),安徽 合肥 230012)

烯丙孕素是一種人工合成的甾類促孕孕酮[1-2]。臨床上歐盟和美國(guó)已批準(zhǔn)將烯丙孕素用于對(duì)豬和馬的同期發(fā)情的調(diào)控[3]，其作用機(jī)理是通過與黃體酮的受體結(jié)合，抑制機(jī)體內(nèi)促性腺相關(guān)激素的生成[4]，降低其在血漿中的濃度，進(jìn)而調(diào)控母畜發(fā)情周期[5]。非洲豬瘟背景下，種豬的繁殖性能是育種成功的關(guān)鍵所在，作為人工合成的甾類促孕孕酮的烯丙孕素在中國(guó)母豬批次化生產(chǎn)過程中，也成為應(yīng)用最為廣泛的外源性孕激素之一[5-6]。但動(dòng)物試驗(yàn)表明孕激素會(huì)增加死胎率，且有致畸作用[7]，人體長(zhǎng)期攝入烯丙孕素藥物超標(biāo)的動(dòng)物產(chǎn)品會(huì)破壞機(jī)體內(nèi)激素平衡，引起癌變，還會(huì)導(dǎo)致嬰幼兒身體發(fā)育異常[8-9]。為避免烯丙孕素在動(dòng)物可食性組織中的殘留，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定烯丙孕素在豬肌肉、肝臟、脂肪中的最高殘留限量(試行)分別為1，2，4 μg/kg。

目前有關(guān)孕激素等激素類藥物殘留的檢測(cè)方法有液相色譜法[9-10]、氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[11]、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]等。液相色譜法的抗干擾能力較差、靈敏度低[10]；氣相色譜法樣品需衍生化，不適用于激素類等揮發(fā)性較低的藥物檢測(cè)[11]；高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[13]，已成為獸藥殘留痕量藥物檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)烯丙孕素藥物的研究主要集中于其對(duì)母豬發(fā)情性能的影響機(jī)理等方面[3]，對(duì)其在動(dòng)物體內(nèi)的殘留檢測(cè)關(guān)注度較少且僅限于肌肉、飼料、肝臟等單一組織[3,14]，未見有肌肉、肝臟、脂肪等多個(gè)靶組織同時(shí)檢測(cè)的多殘留分析方法；部分檢測(cè)方法存在前處理過程中未進(jìn)行酶解導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確、提取液未凈化[14]導(dǎo)致儀器污染等問題。研究擬建立一種豬肌肉、肝臟、脂肪中烯丙孕素藥物殘留檢測(cè)的高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜方法，采用多種水解酶進(jìn)行酶解、乙腈提取豬組織中殘留的烯丙孕素，旨在為豬可食性組織中烯丙孕素殘留分析檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98.0%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司；

β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶：>10 000 U/mL，美國(guó)Sigma公司；

乙腈、甲酸：質(zhì)譜級(jí)，德國(guó)Merck公司；

PRiME HLB固相萃取柱：200 mg，6 mL，美國(guó)Waters公司；

乙酸鈉、氯化鈉：分析純，北京化工廠。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：Waters Xevo TQ-S型，配備MassLynx V4.1軟件處理系統(tǒng)，美國(guó)Waters公司；

電子天平：BSA6202S型，上海諾萱科學(xué)儀器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：CR30NX型，德國(guó)Eppendorf公司；

氮吹儀：TTL-DCII型，上海標(biāo)卓科技儀器有限公司；

旋渦振蕩器：Vortex 3000 Elite型，維根技術(shù)北京有限公司。

波紋管作為一種新型強(qiáng)化換熱技術(shù)，在各個(gè)領(lǐng)域中有廣泛的應(yīng)用。采用Fluent模擬了3種不同波形度的波紋管流動(dòng)，從速度分布、壓力分布、渦結(jié)構(gòu)3個(gè)方面研究波紋管的流動(dòng)特性，并與光滑管模擬結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，得出如下結(jié)論：

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 稱取勻漿后豬肌肉、肝臟、脂肪樣品(2.00±0.01) g，依次加入8 mL乙酸鈉緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 5.2)、20 μLβ-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混勻2 min，55 ℃振蕩酶解2 h。分別加入3 g 氯化鈉、10 mL乙腈溶液，渦旋混勻10 min，8 000 r/min離心5 min。上清液于-20 ℃冷凍除脂20 min，冷凍后提取液于-4 ℃、8 000 r/min離心5 min，棄去脂肪層。取5 mL提取液直接過PRiME HLB固相萃取柱，洗脫液直接收集于離心管中，45 ℃氮吹至干，加入0.5 mL 20%乙腈水溶液溶解，上清液過0.22 μm濾膜，凈化后復(fù)溶液供儀器檢測(cè)分析。

1.2.2 液相色譜條件 色譜柱為Waters UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm)，填料粒徑1.7 μm；流動(dòng)相A為乙腈溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速0.3 mL/min；上樣體積10 μL；柱溫30 ℃。

表1 烯丙孕素高效液相色譜梯度洗脫條件

1.2.3 質(zhì)譜條件 參照李建等[14]的方法。電噴霧正離子源；MRM質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)信號(hào)采集方式；毛細(xì)管電離電壓3.00 kV；源溫度150 ℃；脫溶劑溫度400 ℃；錐孔氣流速150 L/h；脫溶劑氣流速700 L/h。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 空白陰性樣品按1.2.1處理得空白樣品提取液，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，得到系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，以待測(cè)藥物濃度作為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的藥物峰面積作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 檢測(cè)限和定量限 在空白陰性試驗(yàn)樣品中添加待測(cè)藥物，按1.2.1處理后進(jìn)行分析。按照待測(cè)藥物色譜峰信號(hào)響應(yīng)的信噪比S/N>3確定檢測(cè)限；S/N>10確定定量限。

1.2.6 準(zhǔn)確度和精密度 在空白陰性試驗(yàn)樣品中添加待測(cè)藥物，對(duì)試驗(yàn)方法開展方法學(xué)考察?？瞻讟悠分刑砑铀綖?.0，2.0，10.0 μg/kg藥物，每個(gè)藥物水平設(shè)5個(gè)重復(fù)，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算待測(cè)藥物的回收率、日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 提取條件 烯丙孕素藥物多以與硫酸和葡萄糖醛酸結(jié)合形成結(jié)合型的軛合物形態(tài)存在[15]。試驗(yàn)采用β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶進(jìn)行酶解，藥物檢測(cè)過程中將其結(jié)合態(tài)水解成游離形式的化合物進(jìn)行測(cè)定?？紤]到提取效率和安全等因素，選用乙腈作為前處理提取試劑。由圖1可知，10，15 mL 乙腈對(duì)烯丙孕素提取的回收率接近且高于5 mL乙腈的，因此采用10 mL乙腈提取液對(duì)藥物進(jìn)行提取。

圖1 乙腈提取體積對(duì)藥物回收率的影響Figure 1 Effects on sample recovery of acetonitrile extraction volume

2.1.2 凈化方式 待測(cè)樣品中的雜質(zhì)主要有蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)和一些小分子的極性物質(zhì)[16]。蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)、小分子極性物質(zhì)等在有機(jī)溶劑提取藥物過程中可以有效去除，脂類等大分子物質(zhì)可以通過正己烷去除或者在低溫冷凍下除脂。而烯丙孕素藥物的極性較小，在正己烷中會(huì)有一定的溶解性[17]，因此采用低溫冷凍去除脂類，使提取液的凈化效果能夠滿足要求[18]。

由圖2可知，HLB、C18固相萃取柱需活化，過程較繁瑣且對(duì)待測(cè)物質(zhì)吸附強(qiáng)，藥物損失較大；PRiME HLB固相萃取柱處理樣品方便、簡(jiǎn)單，不需要活化固相萃取柱，提取液直接流經(jīng)固相萃取柱后進(jìn)行濃縮、復(fù)溶即可檢測(cè)，極大提升了樣品前處理效率。

圖2 凈化方式對(duì)回收率的影響Figure 2 Effect on recovery of purification methods

2.2 色譜條件優(yōu)化

激素類藥物分離多采用C18反相色譜柱[19-20]，研究選用柱長(zhǎng)為50 mm，柱內(nèi)徑為2.1 mm，粒度為1.7 μm的色譜柱時(shí)，色譜柱對(duì)待測(cè)組分與干擾雜質(zhì)間的分離效果能滿足檢測(cè)要求。由圖3可知，流動(dòng)相采用乙腈-0.1%甲酸水進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，色譜峰型好，信號(hào)響應(yīng)高，烯丙孕素能有效分離。

a1、a2為子離子MRM色譜圖；a3為總離子MRM色譜圖

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

試驗(yàn)表明，在負(fù)離子模式下直接進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，采集到的烯丙孕素母離子信號(hào)響應(yīng)值較低；在正離子模式下直接進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，烯丙孕素母離子信號(hào)響應(yīng)良好。故試驗(yàn)在酸性條件下進(jìn)行，采用正離子模式電離檢測(cè)待測(cè)藥物。由表2可知，全掃描得到的準(zhǔn)分子離子峰([M+H]+)為311.2。調(diào)節(jié)毛細(xì)管電壓，使其豐度最大，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，優(yōu)化毛細(xì)管電壓、脫溶劑氣流速及碰撞能量，進(jìn)行子離子掃描，選擇響應(yīng)最高的兩個(gè)離子碎片為待測(cè)藥物定量離子和定性離子，最佳質(zhì)譜參數(shù)條件：定量離子對(duì)311.2>227.2，錐孔電壓22 V，碰撞電壓24 V；定性離子對(duì)311.2>269.2，錐孔電壓22 V，碰撞電壓18 V。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng) 試驗(yàn)表明，烯丙孕素在豬可食用性組織中存在較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，故采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液來消除基質(zhì)效應(yīng)。

2.4.2 線性范圍 由表2可知，烯丙孕素在1～50 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2在0.99以上。

表2 不同基質(zhì)烯丙孕素線性方程

2.4.3 檢測(cè)方法靈敏度 由圖4可知，在對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間內(nèi)，空白試樣中基質(zhì)對(duì)待測(cè)藥物無明顯干擾。

當(dāng)豬可食性組織中烯丙孕素添加量為0.5，1.0 μg/kg時(shí)，信噪比>3，當(dāng)烯丙孕素添加量為1.0 μg/kg時(shí)，信噪比>10。因此，烯丙孕素檢測(cè)限(LOD)為0.5 μg/kg，定量限(LOQ)為1.0 μg/kg。

b1、b2為子離子MRM色譜圖;b3為總離子MRM色譜圖

2.4.4 檢測(cè)方法準(zhǔn)確度和精密度 選取陰性肌肉、肝臟、脂肪樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，以肝臟組織為例，烯丙孕素添加離子色譜圖如圖5所示，方法學(xué)考察該方法的準(zhǔn)確度和精密度。由表3可知，3個(gè)添加水平下，平均回收率為68.9%～87.4%；日內(nèi)變異系數(shù)為0.8%～7.1%，日間變異系數(shù)為2.5%～11.6%，方法回收率及精密度滿足殘留檢測(cè)要求。

表3 烯丙孕素不同添加量豬可食性組織中的回收率和變異系數(shù)

c1、c2、d1、d2、e1、e2為子離子MRM色譜圖;c3、d3、e3為總離子MRM色譜圖

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了一種快速檢測(cè)豬肌肉、肝臟、脂肪多種可食性組織中烯丙孕素藥物殘留檢測(cè)的高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜方法。結(jié)果表明，試驗(yàn)方法的前處理過程快速準(zhǔn)確，凈化效果顯著且對(duì)儀器無污染。該方法線性關(guān)系良好，靈敏度高，重現(xiàn)性好，適用于豬肌肉、肝臟、脂肪多種組織中烯丙孕素殘留批量快速檢測(cè)。但試驗(yàn)未對(duì)更多的樣品中烯丙孕素殘留量進(jìn)行測(cè)定，今后可以進(jìn)一步對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)中樣品進(jìn)行藥物含量測(cè)定和分析，有利于今后開展畜禽產(chǎn)品中孕激素的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估數(shù)據(jù)積累。