孫守江，唐藝涵，馬馼，李曼莉，毛培勝

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，草業(yè)科學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

種子萌發(fā)是植物發(fā)育的重要階段，也是決定植物生產(chǎn)力的重要因素［1］。種子萌發(fā)中溫度是一個(gè)關(guān)鍵的因子，會(huì)對(duì)大部分生理生化反應(yīng)造成影響［2］，適宜的溫度可以使種子中各種酶的活性維持在較高的水平，進(jìn)而保證萌發(fā)的正常進(jìn)行［3］。低溫會(huì)使種子萌發(fā)受到抑制，破壞種子體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的平衡，使ROS不正常累積，加劇膜脂過氧化程度［4］。在遭受低溫脅迫時(shí)，種子也會(huì)通過自身的防御機(jī)制來響應(yīng)這些脅迫的傷害。低溫脅迫會(huì)引起種子發(fā)芽率降低，出苗不整齊等情況。有學(xué)者在對(duì)低溫脅迫下蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）［5］、羊草（Leymus chinensis）［6］和玉米（Zea mays）［7］種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及幼苗生長(zhǎng)等方面進(jìn)行探究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均有降低，并出現(xiàn)幼苗主根變短，側(cè)根數(shù)量減少等現(xiàn)象。植物抗氧化系統(tǒng)清除ROS 的能力與其對(duì)低溫脅迫的耐受性密切相關(guān)。在對(duì)水稻（Oryza sativa）［8］和玉米［9］等植物種子的研究中，抗氧化酶活性和抗氧化物的含量都隨著低溫脅迫呈先升高后下降的趨勢(shì)，在品種比較試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，冷敏感的品種在低溫脅迫下抗氧化酶活性低于耐冷性強(qiáng)的品種。纈草（Valeriana officinalis）種子［10］在受到低溫脅迫時(shí)，抗氧化酶與抗氧化物通過共同協(xié)調(diào)作用，可減輕低溫對(duì)纈草造成的不利影響。種子生理代謝正常時(shí)，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性與ROS 含量呈正比，隨著脅迫加重O2·-的衍生物反而會(huì)抑制SOD 活性，SOD的失活程度與H2O2含量成正比［11］。過氧化氫酶（catalase，CAT）也會(huì)因?yàn)镺2·-與CAT 反應(yīng)形成復(fù)合物，導(dǎo)致CAT 鈍化進(jìn)而抑制其活力［12］。研究表明SOD、CAT 和過氧化物酶（peroxidase，POD）這3 種酶的活性隨著低溫脅迫呈先升高后下降的趨勢(shì)，說明低溫脅迫下抗氧化酶活性上升以清除ROS，但隨著脅迫加重，抗氧化系統(tǒng)受到損傷，從而導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生與清除之間的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，加劇了膜脂過氧化作用［13］。SOD 和CAT 對(duì)于低溫脅迫的響應(yīng)比POD 更為敏感，POD 活性在低溫脅迫下變化較小［14］。田宏等［15］在扁穗雀麥（Bromus cartharticus）種子萌發(fā)溫度研究中發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）對(duì)低溫極其敏感，APX 的活性伴隨著H2O2含量的升降而升降，谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活性在低溫脅迫下顯著高于常溫處理，并且隨著低溫脅迫的進(jìn)行會(huì)逐漸升高，但在低溫脅迫24 h 后，GR 活性有輕微下降。張尚雄等［16］研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下老芒麥（Elymus sibiricus）種子抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量均表現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。

紫花苜蓿（Medicago sativa）是豆科苜蓿屬多年生草本植物，是世界范圍內(nèi)栽培歷史最悠久，種植面積最廣泛的豆科牧草。其在我國(guó)北方地區(qū)集中種植，但冬季和早春溫度很低，容易發(fā)生凍害，嚴(yán)重影響了紫花苜蓿的越冬和早播，進(jìn)而影響其產(chǎn)量。因此，了解紫花苜蓿種子在低溫條件下的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)有效提高其耐寒性意義重大。紫花苜蓿對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)研究主要集中在幼苗和植株，并證明低溫脅迫會(huì)造成ROS 的過量累積。已有報(bào)道指出，線粒體是種子中ROS 產(chǎn)生的主要位點(diǎn)，因此探索低溫條件下紫花苜蓿種子線粒體的相關(guān)生理變化規(guī)律，對(duì)于掌握種子萌發(fā)機(jī)制具有積極意義?；诖耍宰匣ㄜ俎７N子為試驗(yàn)材料，測(cè)定不同溫度下種子的發(fā)芽特性以及種子吸脹過程中胚根線粒體內(nèi)AsA-GSH 循環(huán)中的抗氧化酶活性、抗氧化物含量以及H2O2含量變化，以揭示低溫條件對(duì)紫花苜蓿種子吸脹過程中線粒體抗氧化系統(tǒng)的影響，并為提高種子抗寒能力相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為中苜1 號(hào)紫花苜蓿，種子初始發(fā)芽率為100%，篩選大小均一的種子，保存在4 ℃冰箱備用。本試驗(yàn)于2021年12 月-2022年3 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院以及牧草種子檢測(cè)中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)芽試驗(yàn) 參照國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)（International Seed Testing Association，ISTA）的種子檢驗(yàn)規(guī)程［17］規(guī)定的發(fā)芽條件，分別選取大小均勻一致的100 粒紫花苜蓿種子，放置于培養(yǎng)皿（11.5 cm×11.5 cm）中，放置3 張濾紙用10 mL 蒸餾水潤(rùn)濕，再放于光照培養(yǎng)箱中在20 和10 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)4 次重復(fù)。培養(yǎng)期間每隔24 h 統(tǒng)計(jì)胚根突破種皮2 mm 的種子數(shù)，用于測(cè)定平均發(fā)芽時(shí)間（mean germination time，MGT）和發(fā)芽指數(shù)（germination index，GI）。在第4 天初次計(jì)數(shù)和第10 天末次計(jì)數(shù)時(shí)統(tǒng)計(jì)正常種苗個(gè)數(shù)。

用發(fā)芽終期全部正常種苗數(shù)計(jì)算種子發(fā)芽率（germination percentage，GP），GP=（G10/N）×100%，式中：G10為末次計(jì)數(shù)時(shí)的正常種苗數(shù)，N為試驗(yàn)種子總數(shù)。

用初次計(jì)數(shù)的正常種苗數(shù)計(jì)算種子發(fā)芽勢(shì)（germination energy，GE），GE=（G5/N）×100%，式中：G5為初次計(jì)數(shù)時(shí)的正常種苗數(shù)，N為試驗(yàn)種子總數(shù)。

平均發(fā)芽時(shí)間（MGT）=Σ（nt）/Σn，式中：t是發(fā)芽天數(shù)，n是第t天胚根突破2 mm 的種子數(shù)，Σn是總發(fā)芽數(shù)。

發(fā)芽指數(shù)（GI）=Σn/t，式中：t是發(fā)芽天數(shù)，n是第t天的發(fā)芽數(shù)。

1.2.2 種子吸脹曲線制作 采用紙上發(fā)芽法，挑選飽滿度均勻的紫花苜蓿種子，分別在10 和20 ℃下吸脹不同時(shí)間（0、4、8、12、16、20、24、28、32 和36 h），每個(gè)吸脹時(shí)間點(diǎn)設(shè)4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100 粒種子。分別在天平上準(zhǔn)確稱重后均勻擺置于鋪有3 層濾紙的培養(yǎng)皿（11.5 cm×11.5 cm）中，每個(gè)培養(yǎng)皿中的濾紙用10 mL 蒸餾水浸潤(rùn)，立即置于10 和20 ℃培養(yǎng)箱，吸脹對(duì)應(yīng)時(shí)間后取出，立即用濾紙吸干種子表面的水分，如有發(fā)霉種子立刻取出，情況嚴(yán)重者重?fù)Q培養(yǎng)皿，確保試驗(yàn)順利進(jìn)行，準(zhǔn)確稱重并統(tǒng)計(jì)，最后計(jì)算種子吸水率、吸水速率。

1.2.3 不同吸脹階段苜蓿種胚線粒體提取 參照Lyu 等［18］的方法提取線粒體，將0.8 g 紫花苜蓿種子分別在20 和10 ℃條件下吸脹6、12 和24 h 后取下胚根，加入約50 mL 預(yù)冷的提取緩沖液［0.3 mol·L-1蔗糖，25 mmol·L-1焦磷酸 四 鈉，2 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1KH2PO4，1%（w/v）PVP-40，1%（w/v）牛血清白 蛋 白（bovine serum albumin，BSA），6 mmol·L-1抗壞血酸鈉和5 mmol·L-1L-半胱氨酸，pH 7.5］。在4 ℃條件下充分研磨后，用4 層紗布過濾。濾液在2700 r·min-1離心8 min 后，上清液轉(zhuǎn)至新的離心管，并在19000 r·min-1下離心20 min。離心后的沉淀加入線粒體洗滌緩沖液，成分為：0.3 mol·L-1蔗糖，10 mmol·L-1N-三羥甲基甲基-2-氨基乙磺酸［N-Tris（hydroxymethyl）-methyl-2-aminoethanesulfonic acid，TES］，0.1%（w/v）BSA，pH 7.5，用畫筆輕輕刷起線粒體沉淀并勻漿；將勻漿在2700 r·min-1下離心8 min 后，上清液再次轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，在19000 r·min-1下離心20 min。離心后的沉淀加入少量的線粒體洗滌緩沖液，再次用筆刷輕輕地刷起線粒體沉淀并勻漿。此勻漿液即為線粒體懸浮液。將線粒體懸浮液輕輕鋪在連續(xù)密度梯度液上，在42500 r·min-1下離心40 min，在離心管底部可見不透明淺黃色線粒體。小心收集離心管底部線粒體，加入不含BSA 的線粒體洗滌緩沖液（0.3 mol·L-1蔗糖，10 mmol·L-1TES，pH 7.5），33000 r·min-1離心15 min，洗滌2 次，得到線粒體提取液，立即保存于-80 ℃冰箱用于抗氧化酶活性以及抗氧化劑含量測(cè)定。上述所有步驟均在4 ℃條件下進(jìn)行。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 抗氧化酶活性以及抗氧化劑含量測(cè)定 CAT 活性測(cè)定參照Cakmak 等［19］的方法。單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase, MDHAR)活性測(cè)定參考Pu 等［20］的方法。GR 活性測(cè)定參考Woo 等［21］的方法。GSH 含量的測(cè)定采用Baker 等［22］的方法。AsA 含量測(cè)定采用Turcsanyi［23］的方法。

1.3.2 H2O2含量測(cè)定 采用蘇州科銘公司的H2O2測(cè)定試劑盒測(cè)定H2O2含量。H2O2與硫酸鈦生成黃色的過氧化鈦復(fù)合物，在415 nm 處有特征吸收峰。取0.2 mL 線粒體提取液，參照試劑盒說明書測(cè)定415 nm 處吸光度A?！鰽=A測(cè)定-A對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)條件下的方程為：y=0.7488x+0.0006（x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol·mL-1；y為吸光度值），根據(jù)下式計(jì)算H2O2含量：

式中：V樣為加入樣本體積（mL）；Cpr 為樣本蛋白質(zhì)濃度（mg·mL-1）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

利用Excel 2019 和SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和顯著性統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均為4 個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，用單因素方差分析（ANOVA）和鄧肯檢驗(yàn)（Duncan test）比較不同處理的平均值（P＜0.05），用Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行作圖，指標(biāo)相關(guān)性聚類分析用“corrplot”和“pheatmap”R 包。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下苜蓿種子吸脹曲線

將紫花苜蓿種子在不同溫度下進(jìn)行吸脹處理，20 ℃處理下0～8 h 為快速吸水階段，8～24 h 為遲滯階段，24 h 種子逐漸露白，進(jìn)入發(fā)芽階段。10 ℃吸脹曲線變化趨勢(shì)與20 ℃不同，0～8 h 為快速吸水階段，8～36 h 為遲滯階段，36 h 逐漸露白，進(jìn)入發(fā)芽階段（圖1）。綜合不同溫度處理下種子吸脹變化規(guī)律，確定取樣時(shí)間為吸脹6、12 和24 h。

圖1 不同溫度條件下紫花苜蓿種子吸脹過程Fig.1 Imbibition of alfalfa seeds under different temperature

2.2 低溫脅迫對(duì)紫花苜蓿種子發(fā)芽特性的影響

由圖2 可知，紫花苜蓿種子在10 ℃下發(fā)芽與20 ℃相比，發(fā)芽率無顯著差異。10 ℃下發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)與20 ℃差異顯著（P＜0.05），均顯著降低，平均發(fā)芽時(shí)間顯著（P＜0.05）增加。

圖2 不同溫度下紫花苜蓿種子發(fā)芽特性變化Fig.2 Changes of germination characteristics of alfalfa seeds under different temperature*表示不同溫度處理之間差異顯著（P＜0.05）。* indicate significant differences under different temperature at the 0.05 level.

2.3 低溫脅迫對(duì)紫花苜蓿種子吸脹期間胚根線粒體內(nèi)H2O2含量的影響

不同溫度處理下胚根線粒體H2O2含量在吸脹期間呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，20 ℃處理下胚根線粒體H2O2含量在吸脹24 h 期間總體呈上升趨勢(shì)，但變化幅度較小，吸脹24 h 后含量最高；10 ℃處理下胚根線粒體H2O2含量總體呈先上升后下降的趨勢(shì)，吸脹12 h 后含量最高。10 和20 ℃分別吸脹6 和12 h 后相比，胚根線粒體H2O2含量差異顯著（P＜0.05）。吸脹12 和24 h 后，10 ℃處理的胚根線粒體H2O2含量高于20 ℃處理（圖3）。

圖3 紫花苜蓿種子吸脹期間胚根線粒體內(nèi)H2O2含量的變化Fig. 3 Changes of H2O2 content in radicle mitochondrial of alfalfa seeds during imbibition*表示同一吸脹時(shí)間不同溫度處理之間差異顯著（P＜0.05），下同。* indicate significant differences under different temperature at the 0.05 level.The same below.

2.4 低溫脅迫對(duì)紫花苜蓿種子吸脹期間胚根線粒體內(nèi)抗氧化酶活性的影響

由圖4 可知，吸脹6、12 和24 h 后，10 ℃處理的胚根線粒體GR 活性低于20 ℃處理。不同溫度處理下胚根線粒體GR 活性在吸脹期間呈不同的變化規(guī)律，20和10 ℃處理下胚根線粒體GR 活性在吸脹6、12 和24 h 后均呈先上升后下降的趨勢(shì)，在吸脹12 h 后活性最高。20 和10 ℃吸脹6 h 相比，胚根線粒體GR 活性無顯著性差異；20 和10 ℃吸脹12 h 相比，胚根線粒體GR活性差異顯著（P＜0.05）；20 和10 ℃吸脹24 h 后相比，活性無顯著性差異。

圖4 紫花苜蓿種子吸脹期間胚根線粒體內(nèi)GR 和MDHAR 活性的變化Fig.4 Changes of GR and MDHAR activity in radicle mitochondrial of alfalfa seeds during imbibition

20 ℃處理下胚根線粒體MDHAR 活性在吸脹24 h 期間呈先下降后上升的趨勢(shì)，吸脹24 h 后活性達(dá)到最大值（圖4）。10 ℃處理下胚根線粒體MDHAR 活性在吸脹24 h 期間呈下降趨勢(shì)，吸脹24 h 后，10 ℃處理的胚根線粒體MDHAR 活性低于20 ℃處理。各吸脹時(shí)間不同溫度處理之間MDHAR 活性差異均不顯著。

20 ℃處理下胚根線粒體POD 活性在吸脹24 h 期間總體呈先下降后上升的趨勢(shì)，吸脹6 h 后活性最高，吸脹12 h 后活性最低。與其不同的是，10 ℃處理下胚根線粒體POD 活性呈上升的趨勢(shì)，吸脹6 h 后活性最小，吸脹24 h 后活性最大，10 和20 ℃吸脹6 h 后相比，胚根線粒體POD 活性差異顯著（P＜0.05）；10 和20 ℃分別吸脹12 和24 h 后相比，胚根線粒體POD 活性無顯著差異（圖5）。

20 ℃處理下胚根線粒體CAT 活性在吸脹24 h 期間總體呈先下降后上升的趨勢(shì)，吸脹6 h 后胚根線粒體CAT活性達(dá)到最大值，10 ℃處理下胚根線粒體CAT 活性呈上升的趨勢(shì)，吸脹24 h 后活性最大。20 與10 ℃吸脹6 h 后相比，胚根線粒體CAT 活性差異顯著（P＜0.05）；20 與10 ℃分別吸脹12 和24 h 后相比，胚根線粒體CAT 活性無顯著差異（圖5）。

圖5 紫花苜蓿種子吸脹期間胚根線粒體內(nèi)CAT 和POD 活性的變化Fig.5 Changes of CAT and POD activity in mitochondrial radicle of alfalfa seeds during imbibition

2.5 低溫脅迫對(duì)紫花苜蓿種子吸脹期間胚根線粒體內(nèi)抗氧化劑含量的影響

20 ℃處理下胚根線粒體AsA 的含量總體呈逐漸上升的趨勢(shì)，吸脹24 h 后含量最高。10 ℃處理下胚根線粒體AsA 的含量隨著吸脹時(shí)間的延長(zhǎng)保持不變。20 與10 ℃分別吸脹6 和24 h 后相比，胚根線粒體AsA 含量差異顯著（P＜0.05）；20 與10 ℃吸脹12 h 后相比，胚根線粒體AsA 含量無顯著差異（圖6）。

20 ℃處理下胚根線粒體GSH 的含量在吸脹24 h 期間總體呈先下降后上升的趨勢(shì)，吸脹24 h 后含量最高。10 ℃處理下胚根線粒體GSH 的含量也呈先下降后上升的趨勢(shì)，吸脹12 h 后含量最低。10 與20 ℃分別吸脹6、12和24 h 后相比，胚根線粒體GSH 含量差異均顯著（P＜0.05）（圖6）。

圖6 紫花苜蓿種子吸脹期間胚根線粒體內(nèi)AsA 和GSH 含量的變化Fig.6 Changes of AsA and GSH content in radicle mitochondrial of alfalfa seeds during imbibition

2.6 AsA-GSH 循環(huán)抗氧化指標(biāo)聚類分析

通過聚類分析發(fā)現(xiàn)（圖7），7 個(gè)苜蓿胚根線粒體抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)主要分為3 組：Ⅰ包括AsA 含量和GR 活性；Ⅱ包括GSH 含量和MDHAR 活性；Ⅲ包括POD、CAT 活性和H2O2含量。從熱圖中可以明顯看出，Ⅰ中的AsA 含量和GR 活性在20 ℃處理下較大，在10 ℃處理下較小，說明低溫脅迫影響了AsA 含量和GR 活性；Ⅱ中的GSH 含量和MDHAR 活性在20 ℃吸脹早期較小，后期較大，而在10 ℃條件下吸脹早期較大，后期較小，說明低溫脅迫誘導(dǎo)了MDHAR 和GSH 的生成。但是萌發(fā)后期GSH 含量和MDHAR 活性又下降，降低了線粒體抗氧化能力。

圖7 基于苜蓿種子線粒體抗氧化相關(guān)指標(biāo)的聚類分析Fig.7 Cluster analysis based on mitochondrial antioxidant related indexes of alfalfa seeds

3 討論

3.1 低溫脅迫對(duì)紫花苜蓿種子發(fā)芽特性的影響

種子是植物最重要的繁殖器官，種子萌發(fā)是植物生命史的關(guān)鍵一步。種子在低溫下吸脹萌發(fā)期間容易發(fā)生吸脹冷害，進(jìn)而影響種子的萌發(fā)進(jìn)程和萌發(fā)整齊度［24］。種子的發(fā)芽能力通常用發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和平均發(fā)芽時(shí)間來衡量［25］。種子發(fā)芽指數(shù)在一定程度上反映了種子萌發(fā)的速度。李建設(shè)等［26］研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理茄子（Solanum melongena）種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)均降低。李佳蔭等［27］研究發(fā)現(xiàn)與常溫處理相比，4 ℃低溫處理的12 個(gè)菜豆（Phaseolus vulgaris）品種種子的發(fā)芽率均顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn)，10 與20 ℃條件下發(fā)芽相比，種子的發(fā)芽率無顯著變化，這與趙文靜［28］的研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)中發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)在低溫脅迫下均顯著降低（P＜0.05），平均發(fā)芽時(shí)間顯著增加（P＜0.05），這與高茜等［29］的研究結(jié)果一致。 由此可以看出，本研究中選擇的低溫脅迫溫度是10 ℃，沒有造成發(fā)芽率的顯著降低，僅僅影響了種子的萌發(fā)速度。

種子吸水速率的快慢在一定程度上反映了種子活力的高低，其對(duì)種子發(fā)芽率也有影響，因此，種子吸水速率也是影響種子萌發(fā)快慢的一個(gè)因素。種子萌發(fā)過程中，低溫脅迫影響水解酶性質(zhì)、膜結(jié)合蛋白的活力及膜透性，從而延緩種子的吸水進(jìn)程［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，10 ℃下紫花苜蓿種子的吸水速率較20 ℃變緩，說明低溫延緩了種子的吸水速率，限制了種子的發(fā)芽速度以及萌發(fā)的整齊程度，延長(zhǎng)了種子萌發(fā)時(shí)間，進(jìn)而影響種子萌發(fā)的進(jìn)程。

3.2 低溫脅迫對(duì)紫花苜蓿種子胚根線粒體抗氧化酶活性的影響

溫度影響植物體內(nèi)的生理機(jī)能，進(jìn)而影響生理生化過程。低溫脅迫會(huì)抑制一系列的生理機(jī)能，抑制種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，低溫對(duì)種子的生理生化過程影響十分復(fù)雜，低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致種子內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過氧化，進(jìn)而引起種子內(nèi)代謝紊亂，最終抑制種子的生長(zhǎng)發(fā)育［31］。本試驗(yàn)中10 ℃處理下胚根線粒體H2O2含量顯著高于20 ℃處理下的每個(gè)階段。說明低溫導(dǎo)致紫花苜蓿種子積累了大量ROS，并且隨著低溫脅迫的持續(xù)，ROS 的積累量逐漸升高。但是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化中形成了一套內(nèi)源抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)，形成了種子對(duì)低溫等逆境脅迫的防御機(jī)制，清除體內(nèi)過量的ROS，維持細(xì)胞的正常代謝［32］。種子對(duì)ROS 的抗性與種子內(nèi)部清除ROS的能力息息相關(guān)。SOD、POD、CAT 以及AsA-GSH 循環(huán)中的GR 和MDHAR 是種子內(nèi)主要的ROS 清除劑，共同協(xié)調(diào)ROS 維持在一個(gè)正常水平，從而防止傷害。因此，它們被稱為抗氧化保護(hù)系統(tǒng)。該酶系統(tǒng)與植物種子抗寒性的關(guān)系已有很多報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，10 ℃處理早期，胚根線粒體POD 和CAT 活性顯著下降，說明在低溫脅迫初期紫花苜蓿種子抗氧化系統(tǒng)受到破壞，胚根線粒體CAT 活性又受到低溫抑制無法正常發(fā)揮作用，這與婁慧等［33］的研究結(jié)果類似。但是種子吸脹12 h 后胚根線粒體POD 和CAT 活性逐漸升高，逐漸恢復(fù)了抗氧化能力，說明種子萌發(fā)后期胚根線粒體POD 活性維持在一個(gè)較高的水平，以清除體內(nèi)積累的ROS，這與玉米種子［7］在低溫脅迫下的萌發(fā)不一致，可能是兩者脅迫溫度不同所導(dǎo)致。MDHAR、GR 和APX 是AsA-GSH 循環(huán)中的關(guān)鍵酶，APX 可以清除H2O2，MDHAR 和GR 是保證AsA 和GSH 再生的關(guān)鍵酶，從而保證AsA-GSH 循環(huán)的順利進(jìn)行，以減輕ROS 對(duì)細(xì)胞帶來的傷害［34］。本研究中10 ℃下胚根線粒體MDHAR 和GR 活性總體呈下降的趨勢(shì)，這與趙寶龍等［35］的研究結(jié)果一致，說明紫花苜蓿種子在低溫脅迫下降低了GR 活性，從而影響了GSH 的再生，使得AsA-GSH 循環(huán)無法有序進(jìn)行。根據(jù)本試驗(yàn)的結(jié)果可以得出，紫花苜蓿種子在遭受低溫脅迫初期，通過提高抗氧化酶的活性以清除過量ROS，但隨著低溫脅迫的加重，大部分酶活性也會(huì)受到低溫影響無法正常發(fā)揮作用，導(dǎo)致種子線粒體抗氧化系統(tǒng)無法正常發(fā)揮作用，進(jìn)一步影響了種子的萌發(fā)進(jìn)程。

3.3 低溫脅迫對(duì)紫花苜蓿種子胚根線粒體內(nèi)抗氧化物及ROS 含量的影響

種子在吸脹萌發(fā)過程中伴隨著抗氧化能力的變化，主要包括抗氧化酶活性以及抗氧化劑含量的變化，抗氧化系統(tǒng)在種子吸脹過程中維持種子抗氧化狀態(tài)發(fā)揮著重要作用。AsA 和GSH 是AsA-GSH 循環(huán)系統(tǒng)中重要的抗氧化物質(zhì)，APX 以AsA 為電子供體，催化H2O2反應(yīng)生成H2O，AsA 也可以與ROS 直接反應(yīng)，參與ROS 的解毒作用。AsA 可 以 在DHAR 和MDHAR 的催化 下 生 成MDHA 和DHA［36］。GR 可 以 催 化GSSG 生成GSH［37］。本研究發(fā)現(xiàn)，10 ℃下吸脹初期胚根線粒體AsA 較高，這說明紫花苜蓿種子通過提升體內(nèi)抗氧化物的含量以抵御低溫脅迫，這與郭麗紅等［38］的研究結(jié)果相同，但是萌發(fā)后期胚根線粒體AsA 含量降低，出現(xiàn)這種情況可能是因?yàn)樵贏sA-GSH 循環(huán)中用來催化AsA 再生的MDHAR 的活性和催化GSH 再生的GR 活性受到了低溫的抑制，導(dǎo)致酶活性降低，從而影響胚根線粒體AsA 和GSH 的再生。在吸脹初期，胚根線粒體H2O2含量維持在一個(gè)相對(duì)較低的水平，說明此時(shí)抗氧化系統(tǒng)可以清除低溫脅迫產(chǎn)生的H2O2，而隨著低溫處理的時(shí)間延長(zhǎng)，抗氧化系統(tǒng)遭遇損傷，無法清除過量的ROS 導(dǎo)致ROS 在胚根線粒體中積累［39］。

3.4 紫花苜蓿種子胚根線粒體AsA-GSH 循環(huán)響應(yīng)低溫脅迫的規(guī)律

基于本研究的結(jié)果，依據(jù)紫花苜蓿種子在低溫下吸脹過程中胚根線粒體AsA-GSH 循環(huán)抗氧化酶和抗氧化劑含量變化規(guī)律，繪制了紫花苜蓿種子胚根線粒體AsA-GSH 循環(huán)響應(yīng)低溫脅迫的規(guī)律示意圖（圖8）。與20 ℃標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽溫度相比，10 ℃低溫脅迫處理下，紫花苜蓿種子胚根線粒體電子傳遞鏈泄漏電子，在線粒體中產(chǎn)生ROS。在種子吸脹初期，AsA-GSH 循環(huán)抗氧化酶和抗氧化劑及時(shí)清除ROS，隨著低溫脅迫的進(jìn)一步加重，胚根線粒體抗氧化能力降低，使得ROS 產(chǎn)生速率大于清除速率，最終導(dǎo)致ROS 在胚根線粒體中積累，限制了線粒體抗氧化能力，進(jìn)而延長(zhǎng)了紫花苜蓿種子的萌發(fā)進(jìn)程。

圖8 苜蓿種子胚根線粒體AsA-GSH 循環(huán)對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)示意圖Fig.8 Response diagram of mitochondrial AsA-GSH cycle in alfalfa seed radicle to low temperature stressI、II、III、IV 和V 分別表示NADH、琥珀酸氧化還原酶、細(xì)胞色素C 氧化還原酶、細(xì)胞色素C 還原酶和ATP 合成酶；□表示10 ℃/20 ℃，紅色代表上升，白色代表不變，藍(lán)色代表下降，從左到右依次為吸脹6、12 和24 h。I，II，III，IV and V represent NADH，succinic acid oxidoreductase，cytochrome C oxidoreductase，cytochrome C reductase and ATP synthase，respectively. Square represents 10 ℃/20 ℃，red square represents a significance increase，white square represents insignificance decrease，blue square represents a significance decrease，from left to right：Imbibition 6，12 and 24 h. MDHAR、DHAR、GSSG 和DHA 分別表示單脫氫抗壞血酸還原酶、脫氫抗壞血酸還原酶、谷胱甘肽和氧化型抗壞血酸。MDHAR，DHAR，GSSG and DHA represent monodehydroascorbate reductase，dehydroascorbate reductase，glutathione and oxidized ascorbate，respectively.

4 結(jié)論

低溫脅迫抑制紫花苜蓿種子的萌發(fā)及生長(zhǎng)，主要表現(xiàn)為降低種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)，增加平均發(fā)芽時(shí)間；通過降低AsA-GSH 循環(huán)中GR、MDHAR、POD 活性、AsA 和GSH 含量，使胚根線粒體內(nèi)的H2O2積累，產(chǎn)生氧化損傷，繼而延緩了種子萌發(fā)的正常進(jìn)程。