陳一帆，薛太強(qiáng)，陳思橋，張金鳳，周冬梅，魏利輝

(1.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇南京 210014)

生姜(ZingiberofficinaleRosc.)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。中國(guó)是世界上生姜栽培面積最大且生產(chǎn)總量最多的國(guó)家之一，也是全球生姜出口大國(guó)。由群結(jié)腐霉(Pythiummyriotylum)侵染引起的生姜莖基腐病，是生姜主要病害之一[2]，對(duì)生姜產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。該病害在生姜上的癥狀出現(xiàn)在地下根莖部位，表現(xiàn)為水漬狀褐色病變，導(dǎo)致塊莖腐爛、葉片變黃，最終使生姜萎蔫和壞死[5]。群結(jié)腐霉在世界各地都有分布，寄主范圍廣泛，除了生姜外還可以侵染花生等多種作物[6]。

植物病原菌按營(yíng)養(yǎng)攝取方式可分為3種類(lèi)型：活體營(yíng)養(yǎng)型、死體營(yíng)養(yǎng)型和半活體營(yíng)養(yǎng)型[7]?；铙w營(yíng)養(yǎng)型病原菌在其整個(gè)生命周期內(nèi)從活的寄主細(xì)胞內(nèi)攝取營(yíng)養(yǎng)；死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌從死亡(或垂死)的寄主細(xì)胞中攝取營(yíng)養(yǎng)；半活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌最初從活體寄主細(xì)胞攝取營(yíng)養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)變?yōu)閺乃劳龅募闹骷?xì)胞中攝取營(yíng)養(yǎng)。對(duì)3種類(lèi)型病原菌分泌的植物細(xì)胞壁降解酶(plant cell wall-degrading enzymes，PCWDEs)數(shù)量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌中的PCWDEs數(shù)量最多；其次，半活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌，最少的是活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌[7]。PCWDEs主要包含3種碳水化合物活性酶(CAZymes)，分別是糖苷水解酶(GH)、碳水化合物酯酶(CE)和多糖裂解酶(PL)[8]。植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素、果膠和結(jié)構(gòu)蛋白組成[9]，是阻止病原菌入侵的主要物理屏障[10-12]。病原菌分泌的大量PCWDEs(如：纖維素酶，果膠酶，蛋白酶和木聚糖酶)可降解不同細(xì)胞壁組分，促進(jìn)其侵染[13]。

纖維素和淀粉是生姜根莖中最主要的2種多糖[14]，其中，纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分。病原菌產(chǎn)生的纖維素酶在其侵染植物和定殖的過(guò)程中起到重要作用[15]。纖維素酶如β-1，4-葡聚糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶可降解纖維素生成葡萄糖，協(xié)同降解寄主細(xì)胞壁[16]。淀粉是植物中最重要的多糖之一，生姜根狀莖中的淀粉含量約11.4%。不同種類(lèi)的生姜淀粉中的直鏈淀粉所占的比例不同(約占18%～30%)，與馬鈴薯淀粉相似[17]。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖元等[18]，分解直鏈淀粉后的最終產(chǎn)物以麥芽糖為主，同時(shí)還有麥芽三糖及少量葡萄糖。

群結(jié)腐霉屬于死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌，基因組中含有大量PCWDEs編碼基因[19-20]，然而目前對(duì)這些PCWDEs的功能和特性知之甚少。本研究以群結(jié)腐霉在生姜粉末和葡萄糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌絲和環(huán)板中的培養(yǎng)液為材料，利用PCWDEs基因功能注釋、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析和酶活檢測(cè)等方法，研究群結(jié)腐霉PCWDEs基因表達(dá)情況和酶活特征，從而深入探究群結(jié)腐霉侵染生姜的致病機(jī)制，為該病害的防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 本試驗(yàn)于2021年3月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中進(jìn)行，供試菌株群結(jié)腐霉SWQ7[21]從山東生姜病樣中分離得到，保藏于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蔬菜病害防控實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制 V8培養(yǎng)基[21]：V8蔬菜汁340 mL，CaCO33.4 g，5 000 r/min離心10 min后棄沉淀，按1 ∶9的體積比加入蒸餾水，瓊脂1.5%，121 ℃ 滅菌20 min。

Plich液體培養(yǎng)基[22]：KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，(NH4)2SO45 g，L-天冬酰胺 1 g，β-谷甾醇 0.01 g，使用NaOH調(diào)pH值至6.0，1 000 mL 超純水，121 ℃滅菌15 min，加入硫胺素0.001 g。

1.1.3 主要試劑 葡萄糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生姜粉末，山東省萬(wàn)興食品有限公司；V8蔬菜汁，美國(guó)金寶湯公司；0.1 μm孔徑的聚碳酸酯膜，美國(guó)GVS過(guò)濾技術(shù)公司；對(duì)硝基苯酚，上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，上海麥克林生化科技有限公司；對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，上海麥克林生化科技有限公司；對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷，上海麥克林生化科技有限公司；TruSeq Stranded mRNA試劑盒，因美納科學(xué)器材有限公司。

1.1.4 主要儀器 單人雙面垂直凈化工作臺(tái)，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；pH計(jì)，上海奧豪斯儀器有限公司；電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海善治儀器設(shè)備有限公司；生物分析儀，安捷倫科技有限公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物細(xì)胞壁降解酶類(lèi)注釋 使用生物學(xué)軟件dbCAN2(http：//bcb.unl.edu/dbCAN2/)分析蛋白質(zhì)是否有CAZy結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)碳水化合物活性酶的基因。利用CAZy網(wǎng)站(http：//www.cazy.org/)[23]，根據(jù)CAZy家族或亞家族分類(lèi)推測(cè)含CAZy結(jié)構(gòu)域蛋白的對(duì)應(yīng)活性。PCWDEs指推測(cè)活性作用于植物細(xì)胞壁多糖組分或植物貯藏多糖的蛋白質(zhì)，根據(jù)推測(cè)的活性列出底物。

1.2.2 環(huán)板試驗(yàn) 將群結(jié)腐霉SWQ7轉(zhuǎn)接到含100 μg/mL氨芐青霉素的過(guò)濾V8培養(yǎng)基平板上，黑暗條件下于25 ℃培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)2 d。

本研究中使用一種稱(chēng)為環(huán)板的新型培養(yǎng)技術(shù)[24]。在環(huán)板的6個(gè)環(huán)形通道中加入含有 100 μg/mL 氨芐青霉素和適當(dāng)碳源的Plich液體培養(yǎng)基，將聚碳酸酯膜覆蓋在環(huán)板培養(yǎng)皿上，菌株轉(zhuǎn)接在聚碳酸酯膜上生長(zhǎng)，分別使用葡萄糖和生姜粉末作為碳源，制備濃度為1 mol/L葡萄糖原液并使用過(guò)濾滅菌，生姜粉末加入Plich培養(yǎng)基后高壓滅菌。環(huán)板培養(yǎng)液中的葡萄糖最終濃度為25 mmol/L，生姜粉末的最終濃度為1%。將高溫滅菌的聚碳酸酯膜覆蓋在環(huán)板上，在環(huán)板中心接種直徑為0.5 cm帶有新鮮菌絲的V8瓊脂塊。25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗生長(zhǎng)72 h后，分別收集環(huán)板中聚碳酸酯膜上的菌絲(用于轉(zhuǎn)錄組分析)和下方環(huán)形通道中培養(yǎng)液(用于酶活檢測(cè))，樣品收集后立即放于液氮中速凍保藏。

1.2.3 RNA提取、RNA-seq文庫(kù)制備、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析 RNA的提取與純化、RNA-seq文庫(kù)制備及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。使用Trizol試劑提取樣品中的RNA，在RNA樣品中加入DNA酶去除殘留的DNA。RNA的完整性采用生物分析儀來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證，使用分光光度計(jì)測(cè)量RNA純度。通過(guò)TruSeq Stranded mRNA試劑盒制備2×150 bp的配對(duì)文庫(kù)，并在Illumina HiSeq X平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。

對(duì)原始數(shù)據(jù)利用Trimmomatic軟件去除接頭序列和低質(zhì)量序列，獲得高質(zhì)量有效序列[25]。對(duì)處理后的序列采用UseGalaxy.eu中的軟件工具進(jìn)行下游分析[26]，采用HISAT2 Galaxy將序列映射至SWQ7基因組進(jìn)行組裝[27](https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/108473？genome_assembly_id=1746011)。使用HTSeq-count Galaxy統(tǒng)計(jì)所有比對(duì)質(zhì)量 ≥ 10序列，采用聯(lián)合模式處理重疊多個(gè)特征的序列，在它們映射至所有特征上計(jì)算非唯一映射序列[28]。利用DESeq2 Galaxy對(duì)計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，其中，默認(rèn)Cook距離截止值用于異常值過(guò)濾[29]。差異表達(dá)基因的判定標(biāo)準(zhǔn)為在FPKM(Fragment per kilo bases per million reads)>10的情況下，DESeqPadj<0.05，DESeq log2FC>1或<-1。FPKM值通過(guò)表達(dá)每Kb基因長(zhǎng)度的基因計(jì)數(shù)和每百萬(wàn)映射到所有基因的計(jì)數(shù)計(jì)算。

1.2.4 酶活測(cè)定 使用連接有對(duì)硝基苯酚(pNP)的底物進(jìn)行酶活測(cè)定，在96孔板中加入總體積為100 μL標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定緩沖液，其中含有Tris-HCl 20 mmol/L (pH值7.5)，連有對(duì)硝基苯酚的底物2.5 mmol/L，環(huán)板培養(yǎng)液或超純水20 μL。分別配制不同濃度的對(duì)硝基苯酚溶液(0、5、10、25、50、80、100、250 nmol/mL)，測(cè)定對(duì)硝基苯酚溶液在405 nm波長(zhǎng)處的數(shù)值，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)、測(cè)定數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在37 ℃反應(yīng)3～8 h后，加入100 μL濃度為0.25 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，并使用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)對(duì)硝基苯酚底物的水解量。酶活單位定義為1 μL培養(yǎng)基溶液1 h產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚(pNP)的nmol量。本試驗(yàn)使用對(duì)硝基苯酚連接的底物檢測(cè)酶活：使用對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷檢測(cè)α-葡萄糖苷酶活性；使用對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷檢測(cè)β-葡萄糖苷酶活性；使用對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷檢測(cè)β-木糖苷酶活性。連接對(duì)硝基苯酚的底物在雙蒸水中制備為50 mmol/L原液。試驗(yàn)中設(shè)置2個(gè)技術(shù)重復(fù)，4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果使用Student’s T-test檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 群結(jié)腐霉植物細(xì)胞壁降解酶的分析鑒定

通過(guò)生物學(xué)軟件dbCAN2和CAZy網(wǎng)站預(yù)測(cè)分析，由圖1和表1可知，得到群結(jié)腐霉中PCWDEs編碼基因共273個(gè)，其中，纖維素降解酶有92個(gè)、木聚糖降解酶16個(gè)、果膠降解酶76個(gè)和淀粉降解酶7個(gè)。通過(guò)與其他已報(bào)道的腐霉菌株相比，群結(jié)腐霉中PCWDEs數(shù)量顯著高于其他腐霉[30-35]；除了貴陽(yáng)腐霉和寡雄腐霉外，群結(jié)腐霉中纖維素降解酶、木聚糖降解酶、果膠降解酶和淀粉酶的數(shù)量是其他腐霉菌的2～3倍；值得注意，群結(jié)腐霉含有除瓜果腐霉和強(qiáng)雄腐霉以外，還含有其他腐霉菌不具有的木聚糖降解酶。

表1 群結(jié)腐霉和其他腐霉菌株中降解特定植物組分的PCWDEs數(shù)量

2.2 菌絲在環(huán)板上的生長(zhǎng)情況

為了解群結(jié)腐霉PCWDEs在侵染生姜過(guò)程中的基因表達(dá)特征和酶活特性，本試驗(yàn)使用生姜粉末模擬生姜環(huán)境，試驗(yàn)對(duì)照選擇最常作為簡(jiǎn)單碳源的葡萄糖為對(duì)照。由圖2可知，生長(zhǎng)72 h后觀察群結(jié)腐霉菌絲生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)群結(jié)腐霉在生姜粉末和葡萄糖培養(yǎng)基上能夠正常生長(zhǎng)，但不能穿透聚碳酸酯膜生長(zhǎng)至下方培養(yǎng)液中，但生姜粉末培養(yǎng)基中菌絲比葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)得更加致密茂盛。

2.3 轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析

由轉(zhuǎn)錄組結(jié)果(表2)可知，以生姜粉末FPKM值>10，P<0.05，log2FC>1或<-1作為差異表達(dá)基因的判定標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)，與葡萄糖培養(yǎng)基相比，群結(jié)腐霉在生姜粉末培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)有12個(gè)PCWDEs基因表達(dá)上調(diào)，這些基因編碼的PCWDEs中的主要底物為淀粉和纖維素。其中，上調(diào)最高的2個(gè)基因?yàn)镻m_g10935.t1和Pm_g3514.t1，在CAZy家族中屬于糖苷水解酶GH13_32，具有α-淀粉酶活性，其底物為淀粉。

2.4 酶活分析

由于群結(jié)腐霉可產(chǎn)生降解淀粉和纖維素的α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶以及大量的木聚糖酶，因此，本研究檢測(cè)了環(huán)板培養(yǎng)基中3種酶活性。由圖3可知，群結(jié)腐霉在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)3種酶活均存在顯著差異，在生姜粉末培養(yǎng)液中α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶活性顯著高于葡萄糖培養(yǎng)液對(duì)照。α-葡萄糖苷酶酶活為0.035 nmol/(h·μL)，較對(duì)照高0.030 nmol/(h·μL)；β-葡萄糖苷酶的酶活為0.115 nmol/(h·μL)，較對(duì)照高0.080 nmol/(h·μL)；β-木糖苷酶活性為0.025 nmol/(h·μL)，較對(duì)照高0.019 nmol/(h·μL)。

表2 群結(jié)腐霉在生姜粉末培養(yǎng)基與葡萄糖培養(yǎng)基相比上調(diào)表達(dá)的PCWDEs基因

3 討論

本研究通過(guò)生物學(xué)軟件dbCAN2和CAZy網(wǎng)站對(duì)群結(jié)腐霉PCWDEs基因進(jìn)行分析和功能注釋?zhuān)A(yù)測(cè)了PCWDEs基因編碼的酶和對(duì)應(yīng)的底物。將群結(jié)腐霉中的PCWDEs基因與其他腐霉菌株對(duì)比發(fā)現(xiàn)，群結(jié)腐霉中以各種植物組分為底物的降解酶數(shù)量均遠(yuǎn)大于其他腐霉菌株。不同植物的細(xì)胞壁組成存在一定差異，但主要由纖維素、半纖維素、果膠和結(jié)構(gòu)蛋白等多種成分構(gòu)成，群結(jié)腐霉PCWDEs對(duì)應(yīng)多種底物，可協(xié)調(diào)降解細(xì)胞壁[36]，這可能與群結(jié)腐霉能侵染多種寄主有關(guān)。

轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，群結(jié)腐霉在生姜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，上調(diào)的PCWDEs基因有12個(gè)，其中，淀粉降解酶的數(shù)量最多，其次是纖維素降解酶，這可能與生姜和腐霉細(xì)胞壁組成相關(guān)。袁甜甜等使用酸水解法測(cè)定在去除水分加工后的生姜中淀粉含量為87.8%[37]，Chen等用蒽酮試劑測(cè)定出生姜組織樣本粉末中纖維素占生姜根莖中纖維的70%，因此群結(jié)腐霉需要分泌大量的淀粉降解酶來(lái)破壞生姜組織[38]。此外，腐霉細(xì)胞壁的主要成分是2種類(lèi)型的纖維素微纖維[39]，推測(cè)纖維素降解酶數(shù)量比淀粉降解酶少的主要原因可能是過(guò)高水平的纖維素酶會(huì)降解腐霉的細(xì)胞壁導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

利用連有對(duì)硝基苯酚底物的酶促反應(yīng)檢測(cè)群結(jié)腐霉中的酶活特征，發(fā)現(xiàn)生姜粉末培養(yǎng)基的α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶活性均比葡萄糖培養(yǎng)基中的酶活性高。這與轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)的生姜粉末培養(yǎng)基中纖維素、淀粉和木聚糖為底物基因表達(dá)上調(diào)的結(jié)果一致。Geethu等檢測(cè)果膠酶、木聚糖酶和纖維素酶的活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們的活性都隨著群結(jié)腐霉的生長(zhǎng)而增加[15]。本研究中也檢測(cè)了類(lèi)似活性，但Geethu等在試驗(yàn)中使用百分?jǐn)?shù)作為各項(xiàng)酶活之間的對(duì)比，2個(gè)試驗(yàn)間的數(shù)據(jù)難以進(jìn)行比較。然而，群結(jié)腐霉在葡萄糖環(huán)板上生長(zhǎng)時(shí)檢測(cè)到了所有酶活，這與Geethu等之前檢測(cè)時(shí)在蔗糖為底物時(shí)檢測(cè)到纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶和蛋白酶的結(jié)果[15]相似。

使用環(huán)板對(duì)群結(jié)腐霉的PCWDEs基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)具有一定的局限性，環(huán)板試驗(yàn)中使用的碳源經(jīng)過(guò)高溫滅菌，而在自然條件下植物宿主中的其他因素可誘導(dǎo)群結(jié)腐霉產(chǎn)生PCWDEs[40]，在侵染過(guò)程中發(fā)揮不同的作用，因此后續(xù)仍需進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件。

本研究通過(guò)PCWDEs基因功能注釋、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析和酶活檢測(cè)分析，表明淀粉和纖維素對(duì)群結(jié)腐霉中PCWDEs基因表達(dá)有重要作用，其功能分析需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究為后續(xù)解析群結(jié)腐霉致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為群結(jié)腐霉引起的生姜莖基腐病的防治提供了理論依據(jù)。