趙凌昆 李葳 駱驚濤

原發(fā)灶不明癌（cancer of unknown primary，CUP）是一種侵襲性疾病，占所有惡性上皮性腫瘤的3%～5%。其中位生存時間為8～11 個月，僅25%患者超過1年，20%～50%的患者無法找到原發(fā)病灶。這導(dǎo)致在CUP 的診斷中，通常要依靠經(jīng)驗性化療，患者預(yù)后差，5年生存率較低。故急需確定腫瘤的來源并進(jìn)行針對性治療。近年來，已有多種方法可以用于CUP 的原發(fā)病灶定位，這些技術(shù)將有助于臨床上對CUP 進(jìn)行評估及診療，并較好的改善患者的預(yù)后。本文對原發(fā)灶不明癌的定位方法、研究進(jìn)展，以及溯源定位技術(shù)的應(yīng)用給予綜述，為臨床治療提供新的方法及理論依據(jù)。

1 CUP 的概述

流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)表明，CUP 占總癌癥的3%～5%，是發(fā)達(dá)國家最常見的10 種惡性腫瘤之一，也是癌癥相關(guān)的第四大死亡原因[1]。通常CUP 發(fā)病時的中位年齡約為60 歲，且男性的發(fā)病率略高于女性。在兒童中，CUP 在確診的實體瘤中所占比例不到1%[2]。荷蘭的一項研究報告中表明，患CUP 的風(fēng)險可能與吸煙和飲酒有關(guān)[3]，但有癌癥家族史并不是CUP 的獨立危險因素[4]。

1.1 CUP 的發(fā)生

CUP 不是一個單一的生物實體，而是由不相關(guān)的特定部位腫瘤組成的，且所有這些轉(zhuǎn)移腫瘤都具有逃避檢測的微小原發(fā)腫瘤的特性[5]。在CUP 患者中未發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤的原因可能是成像技術(shù)檢測微小腫瘤的靈敏度有限、原發(fā)腫瘤退化或保持休眠，以及干細(xì)胞源性[6]。目前的假說普遍認(rèn)為其是一種獨特的，但尚未被識別的病理實體，起源于特殊的、具有共同特性的干細(xì)胞。這種細(xì)胞可以在體外分離，并通過連續(xù)的移植在體內(nèi)繁殖，顯示出高致瘤性[7]。在對同一個CUP 患者的多個轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行基因和轉(zhuǎn)錄組分析后顯示出高度相似性，進(jìn)一步證明了其來自同一來源[8]。

1.2 CUP 的病理生理學(xué)

CUP 在臨床上表現(xiàn)多樣，淋巴結(jié)、肝、骨最常受累[3,9]，大多數(shù)CUP 起源于癌癥，85%～90 %起源于腺癌和低分化癌、5%～10%起源于鱗癌，5%起源于神經(jīng)內(nèi)分泌癌[9]。肺臟是CUP 病變的最常見的原發(fā)部位，其次是各種胃腸道腫瘤，而乳腺和前列腺則很少被確定為病變的主要部位[3]。CUP 患者往往死于肺部或肝部等其他器官的轉(zhuǎn)移[10]。研究顯示，CUP 患者存在著獨立于原發(fā)腫瘤的導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的遺傳特征，在對22例CUP 患者進(jìn)行下一代測序（next-generation sequencing，NGS）后，檢測到268 個基因的共600 個突變，且所有患者都有至少一個或多個基因的改變，如TP53、CDKN2A、SMAD4、BRAF 等[9]。Haratani 等[11]研究表明，CUP 中TP53 的突變率與在其他實體瘤中的突變率相當(dāng)，這證明TP53 的突變可能在CUP 的發(fā)生發(fā)展中不起主要作用。

1.3 CUP 的診治

20世紀(jì)70年代初，在尸檢未發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤的情況下才能診斷為CUP[12]。目前，關(guān)于原發(fā)灶不明癌的診斷方法主要包括具有特定標(biāo)志物的免疫組織化學(xué)檢測、胸部X 光成像技術(shù)、胸部、腹部和骨盆的計算機體層攝影（CT）以及磁共振成像（MRI）和正電子發(fā)射斷層掃描（PET）等，但是均未能較好的明確原發(fā)病灶的位置。在CUP 的治療中，通常采取經(jīng)驗性基于鉑的聯(lián)合化療方案，如紫杉醇+鉑，或吉西他濱+鉑等治療[12]，但患者的中位生存期僅為6～15 個月[13]。目前，迫切需要從分子層面上對原發(fā)灶不明癌進(jìn)行溯源，以提高治療的有效性和患者的生存率。一項回顧性研究表明，CUP 具有適合免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）治療的免疫特性，類似于對ICI 敏感的實體癌癥，因此ICIs 是CUP 治療的一個潛在選擇[11]。

2 CUP 的定位方法

近10年來，不同國家的CUP 的發(fā)病率呈總體下降的趨勢[14]，在一項研究報告中表明，接受癌癥特異性藥物治療的患者的生存時間比標(biāo)準(zhǔn)化療更長[9]。已有一些傳統(tǒng)的方法來預(yù)測原發(fā)病灶位置，如免疫組織化學(xué)法、胸部X 光等，其準(zhǔn)確度只有20%～30%[15]。有助于活檢和確定疾病程度的PET-CT 在CUP 的定位中也有一定的幫助，在原發(fā)病灶不明的宮頸癌患者中，44%患者通過PET-CT 發(fā)現(xiàn)了原發(fā)病灶[16]。目前，分子分類工具已逐漸成熟，如組織蛋白陣列、microRNA 微陣列、寡核苷酸微陣列等方法可以描述腫瘤中的基因或蛋白的表達(dá)。基于這些檢測方法，可以將CUP 的分子特征與已知腫瘤的分子特征進(jìn)行匹配，并完成原發(fā)病灶的定位。

2.1 光學(xué)顯微鏡和免疫組織化學(xué)法檢測

免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC）是確定腫瘤類型、亞型以及起源部位的重要的檢測工具，并可用于評估組織樣本中特定的蛋白表達(dá)以確認(rèn)癌組織的類型并進(jìn)行診斷[17]。目前，病理學(xué)和IHC 檢測仍是CUP 診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[18]。在原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌中，腫瘤通常表達(dá)一些組織特有的基因，而這種組織特異性是由調(diào)控基因或蛋白質(zhì)產(chǎn)物所決定的。在原發(fā)癌與轉(zhuǎn)移癌的表達(dá)譜有一致性的前提下，可應(yīng)用IHC 檢測腫瘤的譜系。雖然其準(zhǔn)確度僅有30%左右，但普遍認(rèn)為通過IHC 來尋找原發(fā)癌癥是可行的，并可以幫助患者制定更好的治療方案[18]。

2.2 DNA 微陣列

DNA 微陣列（DNA microarrays）可同時監(jiān)測數(shù)千個基因的表達(dá)，可作為癌癥分類的一種工具[19]。DNA微陣列有助于高通量地發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性標(biāo)記基因，臨床上最常使用仍是常規(guī)IHC 或其他傳統(tǒng)的方法。雖然大多數(shù)的實體瘤的分子marker 還未被最終確定[20]，但基于DNA 微陣列/基因芯片（genechip）的腫瘤基因表達(dá)譜已廣泛被用于癌癥的診斷[21]。在一項對14 種腫瘤類型的218 例腫瘤標(biāo)本和90 例正常組織標(biāo)本進(jìn)行寡核苷酸微陣列基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，該方法的總體分類準(zhǔn)確率達(dá)78%[22]。證明了對原發(fā)灶不明癌進(jìn)行分子分類的可能性，并為CUP 的診斷和臨床實施提供了一種新的思路。

在一項前瞻性隨機研究中，應(yīng)用基于微陣列的分類器已在約75%的患者中實現(xiàn)了對原發(fā)部位的準(zhǔn)確預(yù)測[23]，但目前基于微陣列的檢測是否具有臨床應(yīng)用所需的靈敏度、特異性尚不清楚，且這種檢測方式仍然受制于腫瘤的類型、數(shù)量、成本等。

2.3 DNA 甲基化

DNA 甲基化是一種穩(wěn)定的DNA 的標(biāo)記物，在不同的腫瘤類型中具有不同的特征[24]。DNA 甲基化的變化可以被用作癌癥檢測的一個可行的生物標(biāo)記物。在一項研究中用甲基化EPIC 芯片（Illumina Infinium MethylationEPIC 850k BeadChip）和測序技術(shù)分析檢測了甲狀腺癌組織樣本中的全基因組DNA 甲基化模式和基因表達(dá)譜，得出其差異甲基化的CpG 位置與區(qū)域幾乎覆蓋整個基因組，這為甲狀腺癌的腫瘤發(fā)生提供了新的線索[25]。同時，在使用該芯片對正常組織及宮頸癌組織的分析中表明，與正常組織相比，宮頸癌組織中的SEPT9 高度甲基化，為后續(xù)的臨床治療提供了可靠的支持與指導(dǎo)意義[26]。

研究顯示，基于微陣列DNA 甲基化特征（microarray DNA methylation signatures）建立了一個包含38 種腫瘤類型的分類器來確定原發(fā)病灶的位置，在通過光學(xué)顯微鏡以及IHC 等驗證后，其準(zhǔn)確度高達(dá)87%[27]。進(jìn)一步表明基于DNA 甲基化特征來判斷原發(fā)不明癌的原發(fā)病灶的位置是可行的。同時，探索更靈敏、更特異的DNA 甲基化檢測方法，對進(jìn)一步提高疾病的早期診斷水平具有重要意義，將DNA 甲基化作為診斷CUP 的工具，可作為一種預(yù)測最初未確定原發(fā)部位的一種方法。雖然仍需進(jìn)一步的前瞻性臨床研究來證明其提高患者的總體生存率，但分子治療將對腫瘤的特異性治療的發(fā)展至關(guān)重要，在確定原始腫瘤類型后進(jìn)行特定部位的治療可以改善患者的預(yù)后[27]。

2.4 MicroRNA

MicroRNA 是一種小的調(diào)節(jié)性RNA（約22nt），在癌癥中的表達(dá)紊亂，其差異表達(dá)與腫瘤的形成有關(guān)，其參與組織形態(tài)的發(fā)生、細(xì)胞凋亡等細(xì)胞過程，是癌癥分類和預(yù)后的組織標(biāo)記物[28]。MicroRNA 可以調(diào)節(jié)特定的mRNA 靶點的活性，并在廣泛的生理病理過程中發(fā)揮著重要的作用[29]。理想的MicroRNA 標(biāo)記物是在癌細(xì)胞上中高表達(dá)而在健康人的血漿中幾乎檢測不到[30]。MicroRNA 無論是在受損的樣本中，還是在生物體液中都具有高度的穩(wěn)定性和對RNase 酶的抵抗力，且無論組織樣本質(zhì)量如何，MicroRNA 均能被檢測到[31]。MicroRNA 的特點支持從FFPE 樣本中獲得其圖譜，進(jìn)而確定腫瘤的分子特征，并進(jìn)行快速的CUP溯源[32]。研究證明，在前列腺癌患者中，腫瘤表達(dá)的miRNA-141 的血清水平與健康人相比，有顯著的特異性和敏感性[32]。且高度穩(wěn)定的MicroRNAs 是癌癥診斷的理想的標(biāo)志物，有研究測量了64 個MicroRNA 來識別腫瘤的起源，并成功地區(qū)分了42 種腫瘤的類型[33]。Laprovitera 等[32]在分析了150 例患者的159份FFPE 樣本的89 個MicroRNA 后，推斷共53 例包括17 個腫瘤類型的原發(fā)病灶未確定的轉(zhuǎn)移性癌，并成功獲得了良好的預(yù)測準(zhǔn)確率?；贛icroRNA 分析雖有助于選擇治療方案，但仍缺乏大量的Ⅲ期臨床試驗，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的前瞻性臨床研究，以評估基于MicroRNA 的分類器在臨床上的使用情況，并證明其對CUP 患者生存的可能影響。

2.5 基因表達(dá)譜

與IHC 相比，基因表達(dá)譜（gene expression profile，GEP）在確定CUP 的原發(fā)部位方面有更高的準(zhǔn)確率，尤其是在中、低分化的病例中。依據(jù)2022年NCCN 指南，可以通過基因表達(dá)譜的分析來輔助CUP 的診斷與制定下一步診療計劃。

92 基因分子腫瘤譜（molecular tumor profiling，MTP）是一種基于GEP 的檢測方法，是一種由92 個基因組成的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)監(jiān)測方法，即通過RT-qPCR 的方法評估92 種基因特征的表達(dá)，需在活檢組織上進(jìn)行[34]。有報道[35]利用MTP 分析預(yù)測CUP 的原發(fā)組織，其準(zhǔn)確性為75%。但由于從甲醛固定-石蠟包埋（formalin-fixed paraffin-embedding，F(xiàn)FPE）中提取到的RNA 質(zhì)量不佳，導(dǎo)致GEP 分析受到限制。在其驗證性研究中，該方法可以預(yù)測85%的已知原發(fā)腫瘤患者的起源組織、可以確定多達(dá)30 種腫瘤類型的主要來源[32]。同時，在一項應(yīng)用該方法的前瞻性研究中，其可識別84%的原發(fā)腫瘤部位[16]，這表明與標(biāo)準(zhǔn)的臨床評估相比，該方法可以識別更明確的原發(fā)腫瘤部位，且在確定CUP 患者起源組織方面是標(biāo)準(zhǔn)病理評估的補充，特別是當(dāng)IHC 無法確定時，MTP 可以作為一種較好的手段來確定原發(fā)病灶位置，但由于可能會存在幾種腫瘤出現(xiàn)基因表達(dá)重疊、統(tǒng)計偏差、后續(xù)治療路線的選擇，以及原發(fā)癌癥的一致性等情況的出現(xiàn)，會導(dǎo)致對起源組織出現(xiàn)錯誤的判斷，從而無法得出確切的結(jié)論。該技術(shù)的臨床應(yīng)用已經(jīng)在一些前瞻性研究中進(jìn)行了評估，在一項多中心前瞻性Ⅱ期臨床試驗中，招募了CUP 患者并用該方法進(jìn)行檢測，在成功檢測的患者中有67%預(yù)測到了起源組織并接受定向治療，其中位總生存期為13 個月。這與經(jīng)驗性治療的中位生存期相比，結(jié)果有所改善[36]。

2.6 NGS 技術(shù)

原發(fā)灶不明癌通常具有潛在的靶向性基因組的改變與突變。尤其是對于一些非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌和黑色素瘤等實體腫瘤的患者，識別有特定治療方法的基因組的異?？稍谂R床上輔助患者的治療，并對患者的預(yù)后有所改善[16]。

在一項對150 例原發(fā)灶不明癌進(jìn)行NGS 的回顧性研究中，有137 例（91%）出現(xiàn)了至少一種基因的改變，且45 例（30%）具有潛在的靶向性改變，如BRAF基因突變、ERBB2 基因擴增，F(xiàn)EFR 基因融合等[37]，說明靶向治療是可行的。該研究還發(fā)現(xiàn)，在接受靶向治療的患者中，其治療效果依舊不佳，最長的生存期僅為14 個月左右。近年來，隨著液體活檢技術(shù)的興起與成熟，通過檢測循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）來評估CUP 患者的基因組的變化逐漸所熟知，且對CUP 患者的ctDNA 分析顯示，其檢測出的基因突變率與從腫瘤組織中得出的結(jié)果相近。對442 例CUP 患者進(jìn)行ctDNA 的檢測發(fā)現(xiàn)，有290例（66%）至少有一種可能是致病性的基因組改變，如RET 基因融合等[38]，其可能會成為一種潛在的新型的檢測方法。

通過NGS 檢測的基因組異?；蚱渫蛔兡Ｊ脚c原發(fā)腫瘤的部位密切相關(guān)，有助于識別原發(fā)腫瘤的部位?；贜GS 技術(shù)開發(fā)的共含22 種癌癥類型的7 791個樣本的基因組學(xué)分類器可在其測試集中識別74.1%的腫瘤類型，并可在臨床上識別大于50%的可能起源組織，為患者的臨床治療帶來了改善[39]。隨著NGS 在轉(zhuǎn)移性癌癥中的日漸廣泛的應(yīng)用，基于NGS所建立的分類器可能會提供更多的機會來識別CUP中的腫瘤類型。

3 結(jié)語

CUP 是一種經(jīng)組織學(xué)證實的轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤，其原發(fā)腫瘤部位在標(biāo)準(zhǔn)評估和影像研究的基礎(chǔ)上無法識別。CUP 因無針對性診療措施、患者預(yù)后不良而被廣泛研究，并代表一組不同的惡性腫瘤，具有獨特的臨床行為和獨特的生物學(xué)特征，以侵襲性、早期轉(zhuǎn)移，以及不可預(yù)測的擴散模式為主要特點。大多數(shù)CUP 患者最初表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移性疾病，常累及淋巴結(jié)、肝臟、骨和肺臟。經(jīng)驗性化療如紫杉醇+鉑，或吉西他濱+鉑等是最常見的治療策略，手術(shù)和放療在化療中通常起到輔助治療效果的作用。目前，針對CUP 的化療方案尚未顯著改善患者的預(yù)后。由于無標(biāo)準(zhǔn)的CUP 化療方案，且經(jīng)驗性治療的獲益低，對起源組織的準(zhǔn)確識別和對特定部位的治療將有可能改善CUP 患者的狀況。尸檢結(jié)果表明，CUP 的原發(fā)部位主要集中于肺臟、胰腺、肝膽等部位，但現(xiàn)有的治療或檢測手段如IHC、PETCT、X 光等都無法較好的準(zhǔn)確定位原發(fā)病灶位置[27]。近年來，越來越多的更精準(zhǔn)的方法如NGS 技術(shù)、MicroRNA 檢測、DNA 甲基化芯片、基因表達(dá)譜等可在很大程度上確定原發(fā)病灶位置并可以指導(dǎo)臨床的下一步治療。隨著新的預(yù)測生物標(biāo)記物和靶向治療的確定，現(xiàn)代腫瘤學(xué)的治療越來越強調(diào)個性化，未來CUP 的原發(fā)病灶定位將更加精準(zhǔn)，將更好地輔助臨床治療并進(jìn)一步改善患者的預(yù)后與生存。