唐藝瑋

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610000）

茄科雷爾氏菌又名青枯菌，是一種土壤傳播的細(xì)菌病原體，是世界上許多作物生產(chǎn)的主要限制因素。該菌是馬鈴薯褐腐病，番茄、煙草、茄子的細(xì)菌性枯萎病或南方枯萎病的致病因子。整個(gè)物種的宿主范圍很廣，但物種內(nèi)不同的致病種會(huì)根據(jù)宿主的偏好發(fā)生。通常病原菌會(huì)侵染包括44 科在內(nèi)的數(shù)百種植物，以及茄科中具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的寄主植物[1]。

由于茄科雷爾氏菌的眾多致病性決定因素、廣泛的宿主范圍和強(qiáng)大的生存能力，使得控制青枯病變得困難，特別是應(yīng)用化學(xué)品和物理治療。銅化合物和其他農(nóng)用化學(xué)品的應(yīng)用對(duì)環(huán)境有很大的影響，并且通常與細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)，甚至與可行但不可以培養(yǎng)的狀態(tài)有關(guān)。因此世界上很多國(guó)家開(kāi)始實(shí)施了許多生物防治的方法，而這些防治策略具有環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)有的生物防治方法主要是利用拮抗微生物以及噬菌體兩種途徑。

1 青枯病的危害性

青枯病有馬鈴薯褐腐病、噴霧劑眼病、煙草格蘭維爾青枯病、香蕉莫科病和其他描述性名稱。據(jù)統(tǒng)計(jì)，受青枯病影響的植物包括但不限于以下作物，例如，主要作物馬鈴薯、水果作物如香蕉和西紅柿、油料作物向日葵和花生、香料作物、飼料、花卉、鐵木和桉樹以及許多觀賞性的植物。其可以感染50 多個(gè)科的450 多個(gè)作物的物種。青枯菌可在植物次生根的根端和腋部等滲出部位定植。隨后在細(xì)胞間感染內(nèi)皮層和維管薄壁組織，然后侵入原生木質(zhì)部血管，最終導(dǎo)致細(xì)胞壁的降解。青枯菌是植物致病菌中第二大破壞性病原菌，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)后果。Elphinstone 在2005 年報(bào)告青枯病造成的年度損失估計(jì)為10 億美元。在青枯菌物種復(fù)合體中的細(xì)菌與新的寄主聯(lián)系在一起，在世界范圍內(nèi)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。此外，由于青枯病的防治價(jià)值高，危害性大，在發(fā)達(dá)國(guó)家農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中的貨幣損失是非常大的，僅美國(guó)土豆和番茄產(chǎn)業(yè)的價(jià)值分別為37 億美元和16.7 億美元。而且這種病原體很容易通過(guò)灌溉用水、農(nóng)具和作物碎片傳播，對(duì)發(fā)展中國(guó)家的自給農(nóng)業(yè)也會(huì)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

青枯病的病害癥狀表現(xiàn)為整個(gè)植物突然枯萎，一般莖橫截面會(huì)出現(xiàn)黏液狀的細(xì)菌滲出液，香蕉莫科病和馬鈴薯褐腐病在香蕉果實(shí)和馬鈴薯塊莖上還會(huì)出現(xiàn)明顯的細(xì)菌定植[2]。

2 青枯菌的多樣性

作為一種高度多樣化的病原體，青枯病病原菌被認(rèn)為是一個(gè)物種綜合體（RSSC），數(shù)百種基因上有截然不同的茄科雷爾氏菌。歷史上，物種復(fù)合體被松散地根據(jù)寄主范圍劃分為種，根據(jù)從碳水化合物中產(chǎn)生酸的能力劃分為生物變種。

隨著分子工具的發(fā)展，近10 年來(lái)茄科雷爾氏菌的分類發(fā)生了很大的變化。2005 年，F(xiàn)egan＆Prior 在分析了ITS（internal transcription spacer）區(qū)域、超敏反應(yīng)、致病機(jī)理B（hrpB）和內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase,egl）基因序列的基礎(chǔ)上，提出了一種新的分級(jí)分類。分析從世界各地分離到的140 株茄科雷氏菌菌株，發(fā)現(xiàn)該菌株可細(xì)分為4 個(gè)系統(tǒng)類型。這與菌株的地理來(lái)源有關(guān)，來(lái)自亞洲的菌株處于系統(tǒng)型Ⅰ，來(lái)自美洲的菌株處于系統(tǒng)型Ⅱ，來(lái)自非洲的菌株處于系統(tǒng)型Ⅲ，來(lái)自印度尼西亞、澳大利亞和日本的菌株處于系統(tǒng)型Ⅳ。而地理隔離和非寄主偏好是青茄菌株分離為4 種系統(tǒng)類型的主要驅(qū)動(dòng)因素。系統(tǒng)類型本身還可以進(jìn)一步細(xì)分為菌株組，稱為sequevars 或序列變異。到目前為止，已經(jīng)確定了50 多個(gè)sequevar。研究發(fā)現(xiàn)，新的RSSC 宿主的不斷出現(xiàn)與不斷擴(kuò)大的系統(tǒng)型I 物種群有關(guān)，茄科雷氏菌具有長(zhǎng)距離遷移和高重組潛力。此外，RSSC 還能通過(guò)其宿主特異性被分為5 個(gè)生理小種（Physiological Race），以及對(duì)6 種碳源（乳糖、麥芽糖和纖維二糖、甜醇、甘露醇和山梨醇）的利用能力被分成5 個(gè)不同的生化型（Biovar）：I、II、III、IV 和V[3]。

3 青枯菌的病原性因素

研究證明，青枯病菌主要致病性決定因素是Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS），此系統(tǒng)是一種注射器狀的膜附錄，將所謂的“效應(yīng)蛋白”（Ⅲ型效應(yīng)蛋白，簡(jiǎn)稱為T3E）注射到植物細(xì)胞胞漿中以促進(jìn)感染。Boucher 等（1992）發(fā)現(xiàn)任何大于20 hrp 或hrp 保守基因（hrc，編碼該分子注射器的結(jié)構(gòu)蛋白或調(diào)節(jié)蛋白）缺陷的突變都是非致病性的。胞外多糖（EPS）是一種松散的黏液，含異質(zhì)組成，它在青枯菌的致病性中也起著重要作用。EPS 具備助于木質(zhì)部血管閉塞的強(qiáng)大功效，最終會(huì)導(dǎo)致植物萎蔫癥狀。此外，Denny＆Baek（1991）發(fā)現(xiàn)EPS 在植物定植中也起重要作用。除這兩種主要的毒力決定因素以外，青枯菌還會(huì)產(chǎn)生一系列的其他因素，也有助于結(jié)腸化合癥狀的出現(xiàn)。其中包括Ⅱ型分泌的植物細(xì)胞壁降解酶、運(yùn)動(dòng)性或附著附體、趨氧轉(zhuǎn)導(dǎo)器、纖維素酶和果膠酶。如Kang 等（2001）研究證明參與抽搐運(yùn)動(dòng)、生物膜形成和根系附著的Ⅳ型菌毛，以及負(fù)責(zé)游泳運(yùn)動(dòng)的鞭毛有助于青枯菌對(duì)番茄的毒性。此外，運(yùn)動(dòng)和附著似乎在植物入侵過(guò)程中也發(fā)揮作用，這是由于大多數(shù)受這些能力影響的突變體在土壤中接種時(shí)是低致病性的，但在植物莖中直接接種時(shí)表現(xiàn)與野生型菌株一樣。最近Wairuri 等人的報(bào)告表明，F(xiàn)lp 菌毛引起的聚集也在青枯菌的致病性中起作用，因?yàn)檫@些菌毛缺乏的突變體會(huì)表現(xiàn)出野生型的游泳或抽搐運(yùn)動(dòng)，但它會(huì)導(dǎo)致馬鈴薯植株萎蔫的能力下降[4]。

4 青枯菌毒力基因的調(diào)控

已有研究發(fā)現(xiàn)控制青枯菌的主要毒力基因轉(zhuǎn)錄途徑。LysR 家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PhcA 發(fā)揮著核心作用。PhcA 激活EPS 和纖維素酶編碼基因，抑制游泳運(yùn)動(dòng)、T3SS 和鐵載體表達(dá)。PhcA 通過(guò)PehR 抑制一個(gè)果膠酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄，盡管其也稍微激活其他果膠酶基因的表達(dá)。此外，全局調(diào)控因子PhcA 的轉(zhuǎn)錄受青枯菌特異性細(xì)胞密度依賴機(jī)制的控制，包括內(nèi)膜蛋白PhcB 產(chǎn)生的3-羥基棕櫚酸甲酯（3-OH PAME）。在低細(xì)胞密度時(shí)，PhcA 的表達(dá)被PhcR 通過(guò)轉(zhuǎn)錄后機(jī)制抑制。當(dāng)3-羥基棕櫚酸甲酯的數(shù)量由于限制或細(xì)菌密度超過(guò)107 個(gè)細(xì)胞／mL 而增加時(shí)，分子激活了PhcS／PhcR雙組分系統(tǒng)。然后，PhcR 被磷酸化，PhcA 表達(dá)被去抑制。在高細(xì)胞密度條件下，PhcA 活化的主要結(jié)果之一是產(chǎn)生大量EPS。這種控制作用通過(guò)誘導(dǎo)XpsR 發(fā)揮作用，XpsR 直接激活EPS 操縱子的轉(zhuǎn)錄。已有研究表明，雙組分調(diào)控系統(tǒng)VsrA／VsrD 也需要完全激活xpsR 轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而激活EPS 合成。另一種雙組分體系VsrB／VsrC也被描述為控制EPS 合成和抑制果膠酶pglA 的轉(zhuǎn)錄，增加對(duì)EPS 合成的另一層控制。因此，XpsR 是EPS 調(diào)控的中心開(kāi)關(guān)，其整合了VsrAD＆PhcA 的輸入，直接調(diào)控EPS 啟動(dòng)因子，是EpsR 陰性調(diào)控和VsrC 陽(yáng)性調(diào)控所必需的。T3SS 的調(diào)控證明，在進(jìn)化過(guò)程中，水平轉(zhuǎn)移的操縱因子可以協(xié)同受體細(xì)菌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在青枯菌中，AraC-型調(diào)控因子HrpB 及其上游OmpR-樣雙組分響應(yīng)調(diào)控因子HrpG 控制hrp／hrc 基因的表達(dá)。HrpB 直接觸發(fā)T3SS 基因的轉(zhuǎn)錄，可能會(huì)與啟動(dòng)因子區(qū)域發(fā)現(xiàn)的hrpII 核子結(jié)合，其表達(dá)受HrpG 控制。當(dāng)細(xì)菌檢測(cè)到植物細(xì)胞壁成分時(shí)，會(huì)觸發(fā)HrpG 特異性誘導(dǎo)的上游調(diào)控因子，這是青枯菌所特有的。PrhA是感知這一信號(hào)的外膜受體，并通過(guò)連續(xù)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PrhJ、HrpG＆HrpB，將其轉(zhuǎn)移到膜相關(guān)蛋白PrhI＆PrhR，從而觸發(fā)hrp／hrc 的表達(dá)[5]。

5 青枯病的生物防治

目前青枯病生物防治主要集中在拮抗微生物（一般包括病原體和其他細(xì)菌物種菌株的無(wú)毒突變體）以及噬菌體的使用上。下面討論青枯病通過(guò)青枯菌的拮抗菌和噬菌體兩種途徑的生物防治。

5.1 青枯菌拮抗菌的生物防治

植物根際促生長(zhǎng)細(xì)菌（PGPR）是存在于植物根際的一類兼有促生和生防功效的根際自生細(xì)菌。Maji＆Chakrabartty（2014）研究發(fā)現(xiàn)，PGPR 與植物根系以及根際其他微生物會(huì)相互作用，具有潛在的青枯病抑制作用，使病原微生物水平處于控制或低于閾限。因此，PGPR 被認(rèn)為可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)并控制青枯病，利用其進(jìn)行的生物防治屬于青枯菌拮抗菌的防治。

Beneduzi 等（2012）發(fā)現(xiàn)，PGPR 通過(guò)直接和間接的方式來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)。其直接機(jī)制包括氮的固定，產(chǎn)生螯合鐵的鐵載體，并使其作用于植物根系，促進(jìn)磷增溶以及植物激素合成；間接機(jī)制是通過(guò)抑制植物病原體來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，而PGPR 還利用多種作用方式來(lái)抑制青枯病病原體的生長(zhǎng)，如產(chǎn)生抗生素起拮抗作用，產(chǎn)生鐵載體螯合鐵，生成HCN 進(jìn)行空間和養(yǎng)分的競(jìng)爭(zhēng)以及系統(tǒng)性抗性的誘導(dǎo)。此外，某些特定PGPR 有可能是通過(guò)使用其中任何一種或多種機(jī)制來(lái)影響植物生長(zhǎng)的[6]。

Abd El-Rahman 等（2002）證明，假單胞菌屬具備很多適合作為PGPR 的特性，并且與青枯菌成拮抗作用，能抑制青枯病的發(fā)生。其中最有效的是熒光假單胞菌屬，其次為菜豆假單胞、蠟樣假單胞和枯草假單胞，而且只有熒光假單胞菌能產(chǎn)生氰化氫（HCN）和鐵載體。根際產(chǎn)生促生長(zhǎng)激素的鐵載體存在增加了植物對(duì)Fe3+的供應(yīng)，促進(jìn)了植物生長(zhǎng)，從土壤中螯合Fe3+會(huì)抑制競(jìng)爭(zhēng)性微生物的活性。HCN 在病原菌生物防治中發(fā)揮了有效作用。生物以HCN 形式分泌氰化物離子，這些離子代謝成較少的化合物。HCN 通過(guò)阻止電子的傳輸和停止向細(xì)胞提供能量而導(dǎo)致生物體死亡。其能夠抑制酶的功能和起首細(xì)胞色素氧化酶的作用，而且還可以可逆地抑制機(jī)制受體。此外，當(dāng)根瘤菌以非特異性關(guān)系定植于非豆科植物的根部時(shí)，該屬菌株也能表現(xiàn)為PGPR，其中芽孢桿菌是根際中最常見(jiàn)的屬。Akintokun等（2019）發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌（Bt）也可用于番茄青枯病的防治。報(bào)告表明，混合生物防治微生物可改善生物防治，與單獨(dú)使用拮抗菌株或兩種混合使用相比，3 種或4 種拮抗菌株的混合使用出現(xiàn)了最高的生長(zhǎng)促進(jìn)效果。此外，有效的拮抗細(xì)菌必須篩選其在自然條件下的表現(xiàn)，然后標(biāo)記為生物防治劑。這是因?yàn)樵谧匀粭l件下，其必須有效地在宿主植物的根際環(huán)境中定植，并需要與土壤微生物區(qū)系爭(zhēng)奪養(yǎng)分[7]。

5.2 青枯菌噬菌體的生物防治

目前，青枯病生物防治措施的進(jìn)展對(duì)噬菌體（特別是病毒）的興趣日益增加。噬菌體是環(huán)境中調(diào)節(jié)細(xì)菌種群數(shù)量最多的微生物，其具有潛在的生物防治作用。

噬菌體對(duì)青枯病病原菌具有溶解或溶源作用，溶解性噬菌體增殖會(huì)破壞宿主細(xì)菌細(xì)胞，對(duì)目標(biāo)細(xì)菌更有效，而溶原性噬菌體是將其基因組整合到宿主細(xì)菌的基因組中并復(fù)制而不破壞細(xì)菌細(xì)胞。因此，細(xì)菌感染性疾病可以通過(guò)噬菌體的作用來(lái)治療，這是一種生物防治方法，也被稱作噬菌體療法。此方法被認(rèn)為是一種非常有前途的防治青枯病的策略[8]。

到現(xiàn)在為止，科學(xué)界已經(jīng)發(fā)表了3 項(xiàng)與青枯病生物防治有關(guān)的專利。第一項(xiàng)是Bhunchoth 等（2015）從日本的土壤中分離到3 種具有殺滅病原菌活性的茄根瘤菌噬菌體。其通過(guò)測(cè)定噬菌體的基因組大小和寄主范圍，初步鑒定該噬菌體對(duì)從煙草植物中分離出的6種日本品系青枯菌菌株的侵染能力。第二項(xiàng)是日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)一種名為ΦRSA1 的新型噬菌體，與之前的噬菌體相比，其宿主范圍更廣泛。第三項(xiàng)是日本科學(xué)家開(kāi)發(fā)了一種預(yù)防青枯病的藥劑和方法，包括將感染Φrsm1 型絲狀噬菌體的菌株M4S、Ps29、Ps65 和Ps74，或Φ rsm3型絲狀噬菌體感染的菌株C319、Ps72 和Ps74，分別注射到植株8～105 個(gè)細(xì)胞／g 處的莖中。這項(xiàng)專利的重點(diǎn)是預(yù)防青枯病，因?yàn)樽⑷牒姓显谄浠蚪M中的絲狀噬菌體的細(xì)菌細(xì)胞的植物，顯示出對(duì)病原菌的抗性增加至少2 個(gè)月[9]。

噬菌體生物生產(chǎn)和配方用于可持續(xù)和環(huán)境友好型農(nóng)業(yè)的生物農(nóng)藥將是必要的。另外，在綜合防治方案中，將噬菌體作為生物防治劑與其他生物防治策略相結(jié)合也是提高對(duì)青枯病療效的一種有前途的方法。

6 結(jié)論

青枯病作為重要作物生產(chǎn)的主要病害之一，嚴(yán)重威脅著世界范圍內(nèi)的作物生產(chǎn)。而青枯菌具備致病性決定因素眾多、寄主范圍廣、生存能力強(qiáng)等特點(diǎn)。青枯病的生物防治主要利用青枯菌拮抗菌以及噬菌體這兩種途徑。

青枯菌拮抗菌可利用多種作用方式來(lái)抑制青枯病病原體的生長(zhǎng)。例如，可以產(chǎn)生抗生素起拮抗作用，生成HCN，產(chǎn)生鐵載體螯合鐵，進(jìn)行空間和養(yǎng)分的競(jìng)爭(zhēng)以及系統(tǒng)性抗性的誘導(dǎo)等。其中假單胞菌屬中的熒光假單胞菌屬對(duì)青枯菌的拮抗作用最強(qiáng)，還包括根瘤菌屬中的芽孢桿菌。此外，混合拮抗菌株的生物防治還可改善青枯病的生物防治效果。

噬菌體對(duì)青枯病病原菌具有溶解或溶源作用，其中溶解性噬菌體增殖會(huì)破壞宿主細(xì)菌細(xì)胞，對(duì)目標(biāo)細(xì)菌更有效。噬菌體治療青枯病被認(rèn)為是一種非常有前途的防治青枯病的策略。研究表明，將噬菌體作為生物防治劑與其他生物防治策略相結(jié)合也是提高青枯病防治效果的一種有研究?jī)r(jià)值的方法[10]。