姚啟悅，趙永亮，李飛寰，任軍華，趙春杰，安星亮，王歡

(河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，鄭州 450001)

油莎豆(Cyperusesculentus)又稱虎堅(jiān)果、油莎草，是莎草科莎草屬的一年生草本油料作物，原產(chǎn)于非洲北部[1]，現(xiàn)廣泛分布于非洲、歐洲、亞洲、北美洲和南美洲的熱帶、亞熱帶、溫帶地區(qū)[2]。油莎豆莖葉是優(yōu)質(zhì)牧草和編織原料，塊莖生長(zhǎng)于地下，形似花生，可直接食用，且含油量豐富，平均可達(dá)到20%～30%，其中不飽和脂肪酸占70%以上[3]，單位產(chǎn)量遠(yuǎn)高于其他油料作物，有“油料之王”的美稱，油莎豆生命力強(qiáng)、根系發(fā)達(dá)、繁殖快、生物量大、抗逆性廣，能夠適應(yīng)多種類型土壤，大規(guī)模利用邊際化土壤種植可起到防止水土流失、改善生態(tài)環(huán)境的作用[4]，目前在我國(guó)十幾個(gè)省廣泛種植，種植面積在25萬畝左右，一般畝產(chǎn)量為500～600 kg，主要分布在東北、西北、黃淮、長(zhǎng)江流域等沙性土壤地區(qū)[5]。油莎豆基本成分中水分、蛋白質(zhì)、脂肪、糖、淀粉平均含量分別為7.00%、8.00%、26.50%、23.32%、23.21%，檢出有機(jī)酸、甾類化合物、萜類化合物等功能性成分[6]；研究表明油莎豆具有降血脂[7-8]、降血糖[9-10]、抗氧化[11-12]、保肝[13-14]、護(hù)胃[15]等生理功能。油莎豆作為新型油料作物，對(duì)未來減少大豆進(jìn)口，提高食用油自給率，幫助改善環(huán)境與產(chǎn)業(yè)脫貧具有極大的發(fā)展前景與競(jìng)爭(zhēng)力[16]。

納豆(natto)是大豆等豆類經(jīng)納豆枯草芽孢桿菌發(fā)酵得到的具有特殊風(fēng)味和黏性多糖的發(fā)酵豆制品[17]，1980年日本學(xué)者須見洋行發(fā)現(xiàn)納豆能夠溶解人工血栓，隨后該團(tuán)隊(duì)從納豆中提取出具有溶栓功能的激酶，并命名為納豆激酶(nattokinase,NK)[18]。NK是由275個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽酶，是一種絲氨酸蛋白酶，分子量約為27 kDa，等電點(diǎn)在8.6左右[19]。NK在體內(nèi)外均表現(xiàn)出良好的溶栓效果[20]，現(xiàn)階段能夠溶解血栓的藥物及物質(zhì)非常多，常見的有尿激酶、鏈激酶等，相比于其他溶栓藥物，NK具有成本低、生物安全性好、副作用小、易被人體吸收、半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[21]。NK除了能夠溶解血栓外，還具有預(yù)防骨質(zhì)疏松[22]、降血壓[23]、降血脂[24]、減脂助消化[25]、免疫調(diào)節(jié)[26]等功能。隨著人口老齡化的加劇，以心腦血管疾病為主的老年群體常見疾病備受關(guān)注，鮮食納豆受銷售環(huán)境和本身風(fēng)味的影響推廣受限[27]，NK類保健食品和溶栓藥品的開發(fā)對(duì)老年群體的健康具有重大意義。

本研究以油莎豆粕為原料，以納豆枯草芽孢桿菌為發(fā)酵劑，以納豆激酶酶活為指標(biāo)，通過優(yōu)化發(fā)酵條件，獲取更高的單位酶活，增強(qiáng)油莎豆粕的產(chǎn)業(yè)價(jià)值，為油莎豆資源的高效利用拓展了新途徑。

1 材料與方法

1.1 菌種

納豆枯草芽孢桿菌N500：河南工業(yè)大學(xué)分子生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 原材料

油莎豆粕：購(gòu)自河北省定州市。

1.3 試劑

尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品(50 mg,50 000 U/g)：上海源葉生物科技有限公司；牛纖維蛋白原(1 g/瓶)、凝血酶(1 000 U)、瓊脂：北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；NaCl、NaOH、HCl(均為分析純)：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：酵母提取物0.5%，胰蛋白胨1%，氯化鈉1%，瓊脂2%，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：酵母提取物0.5%，胰蛋白胨1%，氯化鈉1%，調(diào)pH為7.0，121 ℃滅菌20 min。從4 ℃斜面保藏菌種中挑取1環(huán)接入10 mL種子培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)接至50 mL種子培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基：油莎豆粕9.65 g，加水20.35 mL，50 ℃水浴浸泡2 h，115 ℃滅菌30 min。發(fā)酵前，移取5%的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h。

1.5 主要儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS型立式壓力滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；THZ-312型臺(tái)式恒溫振蕩器、DK-8D型電熱恒溫水槽、SHP-150型生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Spark多功能酶標(biāo)儀 帝肯(上海)貿(mào)易有限公司；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；FE22 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 納豆枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的繪制

將活化的種子液按2%的接種量接種于液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，以無菌液體LB培養(yǎng)基作空白對(duì)照，測(cè)定A600 nm值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、A600 nm為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

2.2 納豆激酶酶活的測(cè)定

采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法[28-29]并稍作改進(jìn) 測(cè)定酶活。配制濃度梯度分別為100，80，60，40，20，10 U/mL的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取10 μL尿激酶溶液于打孔后的纖維蛋白平板上，設(shè)置3個(gè)平行，在37 ℃生化培養(yǎng)箱中恒溫孵育18 h,用游標(biāo)卡尺測(cè)量透明溶解圈的兩條垂直直徑，取其平均值計(jì)算其面積S=πd2/4，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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2.3 粗酶液的制備

豆粕培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)束后置于4 ℃冰箱中后熟12 h，按料液比(干納豆∶生理鹽水)為1∶5(g/mL)加入生理鹽水快速振蕩30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液，取10 μL粗酶液于打孔后的纖維蛋白平板上，設(shè)置3個(gè)平行，在37 ℃生化培養(yǎng)箱中恒溫孵育18 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量透明溶解圈的兩條垂直直徑，取其平均值計(jì)算面積，根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出粗酶液酶活。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 油莎豆粕含水量對(duì)納豆激酶活性的影響

油莎豆粕含水量影響發(fā)酵過程中菌體的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的溶解與傳遞，將其粗顆粒按照干重加入一定比例的蒸餾水,使其含水量分別為55%、60%、65%、70%、75%、80%，50 ℃水浴加熱浸泡2 h，115 ℃高溫高壓滅菌30 min，接種量為5%，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，后熟時(shí)間12 h，設(shè)置3個(gè)平行，考察豆粕含水量對(duì)產(chǎn)酶的影響。

2.4.2 納豆菌接種量對(duì)納豆激酶活性的影響

接種量影響納豆菌的發(fā)酵速度。豆粕含水量為70%，50 ℃水浴加熱浸泡2 h，115 ℃高溫高壓滅菌30 min，分別接入2%、5%、8%、11%、14%、17%的種子液，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，后熟12 h，設(shè)置3個(gè)平行，考察接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響。

2.4.3 發(fā)酵溫度對(duì)納豆激酶活性的影響

每種菌都有其最適的生長(zhǎng)溫度，其生長(zhǎng)和發(fā)酵過程中的溫度影響酶促反應(yīng)速率。豆粕含水量為70%，50 ℃水浴加熱浸泡2 h，115 ℃高溫高壓滅菌30 min，接種量為5%，發(fā)酵溫度分別為28，31，34，37，40，43 ℃，發(fā)酵時(shí)間為48 h，后熟12 h，設(shè)置3個(gè)平行，考察溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響。

2.4.4 發(fā)酵周期對(duì)納豆激酶活性的影響

發(fā)酵時(shí)間影響納豆菌的生長(zhǎng)周期和產(chǎn)酶代謝。豆粕含水量為70%，50 ℃水浴加熱浸泡2 h，115 ℃高溫高壓滅菌30 min，接種量5%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間分別為36，48，60，72，84，96 h，后熟12 h，設(shè)置3個(gè)平行，考察發(fā)酵周期對(duì)產(chǎn)酶的影響。

2.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇含水量、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵周期4個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化油莎豆粕發(fā)酵工藝。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用IBM SPSS Statistics 20分析軟件分析數(shù)據(jù)的顯著性，以P<0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)使用Origin 2018軟件繪圖。

c

3 結(jié)果與分析

3.1 納豆枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

采用比濁法測(cè)定納豆菌的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖1中a。納豆枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)基本符合微生物生長(zhǎng)周期的4個(gè)階段：0～2 h生長(zhǎng)緩慢，處于調(diào)整期；2～8 h納豆菌生長(zhǎng)迅速，處于對(duì)數(shù)期；8～14 h為穩(wěn)定期；14 h以后為緩慢衰亡期，應(yīng)接種8 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的納豆菌。

a

a

3.2 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法。以纖溶圈面積為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)尿激酶活力的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到曲線方程y=0.006 8x+0.286，R2=0.998；二者呈線性相關(guān)，因此可通過將粗酶液在瓊脂糖-纖維蛋白平板上的溶解圈面積代入回歸方程而求得對(duì)應(yīng)的尿激酶酶活。尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1中b。

b

b

3.3 單因素試驗(yàn)

不同單因素對(duì)納豆激酶活性的影響見圖2。

當(dāng)接種量為5%、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，考察含水量對(duì)納豆激酶酶活的影響，結(jié)果見圖2中a。油莎豆粕含水量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響較大，當(dāng)油莎豆粕含水量為70%時(shí)，發(fā)酵后納豆激酶活性最高。含水量過少時(shí)，納豆菌難以生長(zhǎng)，產(chǎn)酶降低；豆粕含水量過高時(shí)，表面會(huì)形成一層白膜，影響發(fā)酵基質(zhì)空氣交換，納豆菌供氧不足，生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致酶產(chǎn)量降低。因此，試驗(yàn)最佳豆粕含水量選取70%。

當(dāng)含水量為70%、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，考察接種量對(duì)納豆激酶酶活的影響，結(jié)果見圖2中b。隨著菌液接種量的增大，納豆激酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，接種量過小時(shí)，菌體在豆粕培養(yǎng)基中無法充分生長(zhǎng)，需要較長(zhǎng)時(shí)間繁殖積累，無法發(fā)酵完全，從而延長(zhǎng)發(fā)酵周期；接種量過大時(shí)，菌體繁殖旺盛，加速發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的消耗及有害代謝產(chǎn)物的積累，導(dǎo)致其次級(jí)代謝被抑制，產(chǎn)酶量降低。接種量為5%時(shí)，菌體生長(zhǎng)速率適中，既能實(shí)現(xiàn)菌體的大量積累，次級(jí)代謝也可正常進(jìn)行，酶活最高。因此，試驗(yàn)最佳菌液接種量選取5%。

當(dāng)含水量為70%、接種量為5%、發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，考察發(fā)酵溫度對(duì)納豆激酶酶活的影響，結(jié)果見圖2中c。隨著發(fā)酵溫度的升高，納豆激酶的活性顯現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵溫度為40 ℃時(shí)，納豆激酶活性最高；當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí)，酶活逐漸減弱。微生物都有其最適的生長(zhǎng)溫度，一定范圍內(nèi)，溫度升高能提高菌體的生長(zhǎng)速率、酶促反應(yīng)速率及蛋白合成速率；溫度過高時(shí)，生長(zhǎng)及產(chǎn)酶能力均會(huì)下降，導(dǎo)致酶活降低。因此，試驗(yàn)最佳發(fā)酵溫度選取40 ℃。

當(dāng)含水量為70%、接種量為5%、發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，考察發(fā)酵周期對(duì)納豆激酶酶活的影響，結(jié)果見圖2中d。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，納豆激酶活性呈現(xiàn)先升高后緩慢降低的趨勢(shì)，在發(fā)酵36～72 h過程中，納豆激酶活性呈升高趨勢(shì)；發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，酶活性最高；發(fā)酵時(shí)間超過72 h后，油莎豆粕培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以支撐納豆菌的正常代謝，同時(shí)次級(jí)代謝副產(chǎn)物逐漸增加，影響了納豆激酶分泌，從而導(dǎo)致納豆激酶酶活緩慢降低。因此，試驗(yàn)最佳發(fā)酵周期選取72 h。

3.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取A含水量、B接種量、C發(fā)酵溫度和D發(fā)酵周期4個(gè)因素為變量，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),試驗(yàn)因素水平表見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Orthogonal test results and analysis

由表2可知，各因素對(duì)納豆激酶活性的影響程度大小為A>C>B>D，最佳納豆激酶酶活的試驗(yàn)方案為A3B2C1D3,即油莎豆粕含水量是影響產(chǎn)酶的主要因素，其次是發(fā)酵溫度，接種量和發(fā)酵周期對(duì)產(chǎn)酶的影響較小。

由表3可知，油莎豆粕含水量和發(fā)酵溫度對(duì)納豆激酶酶活的影響極顯著(P<0.01)，接種量和發(fā)酵周期對(duì)納豆激酶酶活的影響不顯著。綜合T檢驗(yàn)和方差分析可知，正交試驗(yàn)優(yōu)化后確定的最適發(fā)酵條件是豆粕含水量75%、接種量5%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵周期84 h，所得納豆激酶酶活為10 382.90 U/g。

表3 各因素對(duì)油莎豆粕培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶活性的方差分析Table 3 Variance analysis of various factors on the activity of nattokinase produced from Cyperus esculentus meals media fermentation

4 結(jié)論與討論

通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化后，得出油莎豆粕發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的最佳工藝條件是豆粕含水量75%、接種量5%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵周期84 h。在此優(yōu)化條件下，所得納豆激酶平均酶活為10 382.90 U/g，氨臭味較輕。

劉野等[30]利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，以黃豆為原料對(duì)納豆發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到納豆激酶活性為2 493.33 U/g。張紅運(yùn)等[31]通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，以豆渣為原料優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶工藝，得到酶活為1 734 U/g。郭玩湘等[32]利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化以豆粕與麩皮為原料的納豆激酶固態(tài)發(fā)酵工藝，最高酶活達(dá)到6 642 U/g。本試驗(yàn)優(yōu)化得到的納豆激酶活性最高達(dá)到10 382.90 U/g，明顯高于以大豆及其豆粕為原料發(fā)酵得到的納豆激酶酶活，單位酶活力提高了56.32%，為油莎豆粕的利用和納豆激酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了參考途徑。