陳耀，王暉，王益友，王云霄，甘小平*，呂獻海*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學 理學院，合肥 230036；2.安徽凱博生物科技有限公司，合肥 230071)

大蒜(garlic)為百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)植物的地下鱗莖[1]。大蒜中含有豐富的蛋白質(zhì)和糖類，還含有脂質(zhì)、礦物質(zhì)等[2]。研究表明，大蒜具有天然的去自由基功能和良好的殺菌效果，與茶葉中的茶多酚和玫瑰中的花青素相似，大蒜中的大蒜素及其酶解產(chǎn)物具有抗氧化功能[3]，能幫助清除體內(nèi)各種自由基[4-5]。大蒜中提取的多組分硫醚化合物對真菌有抑制和殺滅作用，是天然高效的抗菌產(chǎn)品[6]。

從新鮮大蒜中提取的大蒜油是具有濃郁蒜香味的食品添加劑[7]，該食品添加劑在食品加工中經(jīng)500倍及以上稀釋后在深加工產(chǎn)品中仍會帶來純正的蒜香味，在國內(nèi)外食品工業(yè)中應用前景廣闊。我國與歐盟、俄羅斯、東南亞等國家和地區(qū)食品加工行業(yè)對水溶性大蒜油均有較大需求[8-9]。目前，大蒜精油的提取工藝主要有水蒸氣蒸餾法、溶劑萃取法、超臨界流體萃取法等[10-11]。本文研究的食品添加劑水溶性大蒜油(后文用大蒜油代替)是由安徽凱博生物科技有限公司經(jīng)水蒸氣蒸餾法制備的大蒜精油，與各組分乳化劑和食用酒精按一定比例混合制得[12]。該大蒜油中主要成分為二烯丙基三硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基一硫醚、二烯丙基四硫醚、烯丙基甲基二硫醚和二甲基三硫醚等[13]，在室溫陰涼處避光條件下可以儲存較長時間，但受到較高溫度儲存條件影響后，會產(chǎn)生氧化褐變，在食品深加工產(chǎn)業(yè)中的應用受到很大限制[14]。因此，本文提出用抗氧化劑和抗氧化增效劑的復配增效來解決水溶性大蒜油容易氧化褐變的思路[15]。

添加抗氧化劑和抗氧化增效劑為目前抑制水溶性大蒜油氧化的有效方式[16]。抗氧化劑是食品工業(yè)中經(jīng)常使用的物質(zhì)，用于生產(chǎn)、儲存、運輸和銷售中保護油脂性產(chǎn)品免受環(huán)境氧化，延長油脂性產(chǎn)品的保質(zhì)期[17]。但不同抗氧化劑對不同底物的抗氧化性能仍存在較大的差異性和局限性，且目前抗氧化劑大多單獨使用，不同抗氧化劑的復配增效技術研究較少，專門在大蒜油中應用的配方少見文獻報道，如何提升現(xiàn)有抗氧化劑的功效已成為亟待解決的問題。本文選用8種天然抗氧化劑及2種抗氧化增效劑為研究對象，通過多次優(yōu)化篩選協(xié)同性能最佳的抗氧化劑組合，系統(tǒng)探討該組合抑制大蒜油氧化的作用效果，并借助GC-MS檢測技術深入解析其協(xié)同抑制大蒜油氧化的作用機理[18-19]，為水溶性大蒜油的長效儲存提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大蒜精油(安徽凱博生物科技有限公司)、吐溫20、司盤20、食用酒精、玻璃瓶(50 mL)等材質(zhì)包裝材料、丁基羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、茶多酚(TP)、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺(PG)、D-異抗壞血酸(AA)、L-抗壞血酸棕櫚酸酯(AP)、植酸(IP6)、硫代二丙酸雙十二烷酯(DLTP)、檸檬酸(CA)等。

1.2 儀器與設備

分析天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；懸臂式恒速攪拌器 常州國宇儀器制造有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱 上海三發(fā)科學儀器有限公司；高效氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS) 安捷倫科技(中國)有限公司；阿貝折光儀 上海申光儀器儀表有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 單組分抗氧化劑的初篩

設計單組分抗氧化劑實驗組與空白組的大蒜油。在電子天平上分別稱量定量的抗氧化劑溶解于食用酒精后可用攪拌器充分攪拌溶解，經(jīng)觀察無沉淀。然后分別加入非離子表面活性劑吐溫20和司盤20，將吐溫20和司盤20用溶有抗氧化劑的食用酒精乳化。最后將大蒜油與上述溶液充分混合，使用攪拌器攪拌使其充分混合均勻，使含有抗氧化劑的充分乳化溶液和大蒜油兩相完全融合。分別將不加抗氧化劑及加不同抗氧化劑的大蒜油放入玻璃瓶中后置于烘箱內(nèi)，設定烘箱溫度為37 ℃，平行3組，每隔一定時間取樣觀察并測定，得到實驗數(shù)據(jù)。

1.3.2 抗氧化劑二元復配和三元復配工藝篩選

根據(jù)單組分抗氧化劑初篩的結果，設計抗氧化效果優(yōu)良的抗氧化劑二元復配和三元復配實驗組與空白組的大蒜油。在電子天平上分別稱量定量的多種抗氧化劑溶解于食用酒精后用攪拌器充分攪拌溶解，經(jīng)觀察無沉淀。然后分別加入非離子表面活性劑吐溫20和司盤20，將吐溫20和司盤20用溶有抗氧化劑的食用酒精乳化。最后將大蒜油與上述溶液充分混合，使用攪拌器攪拌使其充分混合均勻，使含有抗氧化劑的充分乳化溶液和大蒜油兩相完全融合。分別將加入不同復配工藝抗氧化劑的大蒜油放入玻璃瓶中后置于烘箱內(nèi)，設定烘箱溫度為37 ℃，平行3組，每隔一定時間取樣觀察并測定，得到實驗數(shù)據(jù)。

1.3.3 抗氧化劑與抗氧化增效劑復配工藝復篩

根據(jù)抗氧化劑二元復配和三元復配工藝篩選的結果，設計抗氧化效果優(yōu)良的二元復配或三元復配實驗組與抗氧化增效劑復配的大蒜油。在電子天平上分別稱量定量的多種抗氧化劑和抗氧化增效劑溶解于食用酒精后用攪拌器充分攪拌溶解，經(jīng)觀察無沉淀。然后分別加入非離子表面活性劑吐溫20和司盤20，將吐溫20和司盤20用溶有抗氧化劑和抗氧化增效劑的食用酒精乳化。最后將大蒜油與上述溶液充分混合，使用攪拌器攪拌使其充分混合均勻，使含有抗氧化劑和抗氧化增效劑的充分乳化溶液和大蒜油兩相完全融合。分別將加入二元復配和三元復配實驗組與抗氧化增效劑復配的大蒜油放入玻璃瓶中后置于烘箱內(nèi)，設定烘箱溫度為37 ℃，平行3組，每隔一定時間取樣觀察并測定，得到實驗數(shù)據(jù)。

1.3.4 加速實驗法(貨架期預測)

大蒜油的氧化誘導時間受溫度的影響很大，在低溫保存時產(chǎn)品品質(zhì)可在較長時間內(nèi)不變，在溫度較高的條件下大蒜油氧化褐變較迅速。大蒜油的常規(guī)儲存條件為室溫避光保存，若以此條件探究其氧化誘導時間，會浪費大量的時間，探究的效率會大大降低，為了解決這一問題，加速實驗被廣泛應用于放大產(chǎn)品缺陷，縮短大蒜油氧化誘導時間，將所得數(shù)據(jù)經(jīng)Arrhenius經(jīng)驗公式外推，就可以估計常規(guī)儲存條件下貨架壽命，本實驗過程中溫度均采用偏高于常溫的37 ℃。

根據(jù)Arrhenius經(jīng)驗公式，常規(guī)儲存條件的溫度約為20 ℃，每升高10 ℃，反應速度升高1倍，即:

K(T+10 ℃)/K(T)=2。

式中：K為反應速度常數(shù)。而反應速度常數(shù)與食品貨架壽命成反比，因此有：

N(T)/N(T+10 ℃)=2。

式中：N為食品貨架壽命。

可知溫度越高，反應速度常數(shù)越大，食品貨架壽命越短，呈指數(shù)相關。

1.3.5 感官要求和理化指標的測定

理化指標要滿足GB 1886.272-2016《食品安全國家標準 食品添加劑 大蒜油》的要求[20]，食品添加劑水溶性大蒜油的感官要求和理化指標應符合表1的規(guī)定。

表1 水溶性大蒜油感官要求和理化指標Table 1 Sensory requirements and physicochemical indexes of water-soluble garlic oil

目測法是將試樣置于比色管內(nèi),在光照條件下，可用目測法觀察大蒜油的色澤并和潘通色卡3 517 U色段比較，當飽和度低于3 517 U色段時，說明大蒜油的感官性狀良好，當飽和度大于或等于3 517 U色段時，說明大蒜油已完全氧化。

過氧化值的測定應避免在陽光直射下進行，將待測樣置于錐形瓶中，加入適量三氯甲烷與冰乙酸的混合液，輕輕振搖使試樣完全溶解。然后加入飽和碘化鉀溶液，經(jīng)處理后搖勻，用硫代硫酸鈉標準溶液滴定，滴定至淡黃色時加少量淀粉指示劑，繼續(xù)滴定并強烈振搖至溶液藍色消失為終點，同時進行空白實驗，平行3組。

折光指數(shù)可用阿貝折光儀測定，根據(jù)折射定律，先用標準樣品校準折光儀后，滴入1滴待測樣于阿貝折光儀玻片上，調(diào)節(jié)旋鈕至目鏡顯示出一條明顯的棱線，此時記錄讀數(shù)為待測樣的折光指數(shù)，使用時注意鏡面衛(wèi)生。

1.3.6 水溶性大蒜油的高效氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)檢測

色譜條件：計算方法：歸一法；定量基準：面積；柱箱溫度：程序升溫，見表2。進樣器溫度：200 ℃；載氣類型：氦氣；分流時間：1 min；不分流時間：5 min；FID溫度：245 ℃；輔助爐溫度：50 ℃；分流比：1∶80；計算周期：17 min。按以上條件測量大蒜油的高效氣相色譜-質(zhì)譜。

表2 柱箱升溫程序Table 2 Column box heating program

2 結果與分析

2.1 水溶性大蒜油氧化誘導時間

由圖1可知，大蒜油氧化誘導時間由過氧化值、折光指數(shù)、感官性狀3個指標中最先達到國標要求的最大限定值決定。具體要求分別是過氧化值小于0.1，折光率在1.550～1.590的范圍內(nèi)，目測顏色為黃色至橘紅色。

圖1 水溶性大蒜油氧化誘導時間的影響因素Fig.1 Influencing factors of the oxidation induction time of water-soluble garlic oil

選擇8種抗氧化劑BHA、BHT、TBHQ、TP、PG、AA、AP、IP6。測定大蒜油氧化誘導時間的3個影響因素數(shù)據(jù)，計算平行3組的平均值，分別得到對大蒜油抗氧化效果的研究結果，見圖2。

圖2 單組分抗氧化劑實驗組與空白組的水溶性大蒜油的氧化誘導時間Fig.2 Oxidation induction time of water-soluble garlic oil in single component antioxidant experimental groups and blank group

由圖2可知，蒜油的氧化誘導時間為13 d，各抗氧化劑均能延長其氧化誘導時間，抗氧化效果由大到小為TBHQ>AP>PG>AA>IP6>BHT>TP>BHA>CK，其中效果最好的TBHQ將氧化誘導時間延長2倍，PG、AP、AA效果均良好。

將圖2中效果最好的TBHQ與效果較好的PG、AP、AA進行二元復配和三元復配，測定大蒜油氧化誘導時間的3個影響因素數(shù)據(jù)，計算平行3組的平均值，得到加入二元復配和三元復配抗氧化劑實驗組與空白組的大蒜油氧化誘導時間，見圖3。

圖3 復配抗氧化劑實驗組與空白組的水溶性大蒜油的氧化誘導時間Fig.3 Oxidation induction time of water-soluble garlic oil in compound antioxidant experimental groups and blank group

由圖3可知，抗氧化劑間分別存在協(xié)同作用和拮抗作用，抗氧化效果由大到小為TBHQ+AP=TBHQ+AP+AA>TBHQ+PG+AP>TBHQ+PG+AA>TBHQ+AA>TBHQ>TBHQ+PG>CK，其中效果最好的TBHQ+AP和TBHQ+AP+AA實驗組均將氧化誘導時間延長2.8倍，TBHQ+PG實驗組表現(xiàn)出拮抗作用，其余實驗組均表現(xiàn)出協(xié)同作用，將同一復配組合相互作用，計算所得復配組合之間的SYN 值，即協(xié)同或拮抗率：

SYN=(N-N0)/N×100%。

按以上SYN 值的計算公式，不同抗氧化劑間復配后對大蒜油抗氧化作用效果為TBHQ+AP(SYN：42.31%)、TBHQ+AA(SYN：11.54%)、TBHQ+PG+AP(SYN：30.77%)、TBHQ+PG+AA(SYN：15.38%)、TBHQ+AP+AA(SYN：42.31%),5個組合在對大蒜油抗氧化作用效果具有明顯的協(xié)同效應。對比TBHQ與其他抗氧化劑組合的結果時，有明顯的協(xié)同效應，而組合TBHQ+PG(SYN：-3.85%)顯示拮抗作用。該結果表明抗氧化劑的協(xié)同或拮抗作用不是由一種抗氧化劑主導，而是受到抗氧化劑或抗氧化劑與產(chǎn)品共同作用，如相互反應、作用機理不一致等多種因素影響。在食品工業(yè)中，食品生產(chǎn)加工應當盡可能少用或者不用食品添加劑，因此TBHQ+AP實驗組為最好的復配工藝。

將圖3中效果最好的TBHQ+AP復配工藝分別與抗氧化增效劑硫代二丙酸雙十二烷酯(DLTP)、檸檬酸(CA)復配，測定大蒜油氧化誘導時間的3個影響因素數(shù)據(jù)，計算平行3組的平均值，得到抗氧化劑與抗氧化增效劑復配工藝，見圖4。

圖4 抗氧化劑與抗氧化增效劑復配工藝組與空白組水溶性大蒜油的氧化誘導時間Fig.4 Oxidation induction time of water-soluble garlic oil in the compound process groups of antioxidant and antioxidation synergistic agents and blank group

由圖4可知，抗氧化增效劑能有效延長大蒜油的氧化誘導時間，抗氧化效果由大到小為TBHQ+AP+DLTP>TBHQ+AP+CA>TBHQ+AP>TBHQ>CK。其中效果最好的TBHQ+AP+DLTP實驗組將氧化誘導時間延長3.5倍，叔丁基對苯二酚(TBHQ)+L-抗壞血酸棕櫚酸酯(AP)+硫代二丙酸雙十二烷酯(DLTP)是最佳的復配工藝。

2.2 水溶性大蒜油的感官要求和理化指標測定結果

TBHQ+AP+DLTP復配工藝水溶性大蒜油的感官要求和理化指標測定結果見圖5，達到3 517 U臨界色段時(第45天)大蒜油的過氧化值始終為0，折光率始終保持在1.550～1.590，說明感官性狀是判斷大蒜油氧化誘導時間的先決條件。此數(shù)據(jù)也間接印證了大蒜油是天然的抗氧化劑，即使在感官性狀不良的狀態(tài)下，其本身的組分經(jīng)檢驗依然滿足過氧化值和折光指數(shù)的要求，且在研究過程中發(fā)現(xiàn)，橘紅色水溶性大蒜油依然澄清，且經(jīng)過稀釋后顏色會變淺。

圖5 水溶性大蒜油的過氧化值、折光系數(shù)、感官性狀Fig.5 Peroxide value,refraction coefficient and sensory properties of water-soluble garlic oil

2.3 水溶性大蒜油的高效氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)檢測結果

按上述色譜條件，測定大蒜油的高效氣相色譜-質(zhì)譜。大蒜油的高效氣相色譜-質(zhì)譜圖見圖6。

圖6 新制的大蒜油的高效氣相色譜-質(zhì)譜圖Fig.6 GC-MS diagram of newly prepared garlic oil

對圖6進行積分計算整理，得到水溶性大蒜油的主要組成成分和所占比例，見表3。

表3 水溶性大蒜油的主要組成成分和所占比例Table 3 Main components and their proportions of water-soluble garlic oil

續(xù) 表

由表3可知，大蒜油中最主要的6種硫醚化合物占大蒜油的95%，而植物油主要由油酸和亞油酸組成，可見大蒜油與其他植物油的成分差異很大。

2.4 貨架期預測結果

根據(jù)Arrhenius經(jīng)驗公式，常規(guī)儲存條件的溫度為20 ℃，電熱恒溫鼓風干燥箱控制37 ℃下的速率為20 ℃下的21.7倍，使用電熱恒溫鼓風干燥箱控制37 ℃下加速實驗法的1 d大約相當于20 ℃下貯藏3.25 d，大蒜油在37 ℃條件下氧化誘導時間為13 d，根據(jù)加速實驗的貯藏時間可外推得到20 ℃下油品最佳貯藏時間為42 d。TBHQ+AP+DLTP最佳復配工藝的水溶性大蒜油在37 ℃條件下氧化誘導時間為45 d，根據(jù)加速實驗的貯藏時間可外推得到20 ℃下大蒜油最佳貯藏時間為146 d。

3 結論

本文以水溶性大蒜油為研究對象，利用8種抗氧化劑和2種抗氧化增效劑進行抗氧化復配，經(jīng)多次篩選得到協(xié)同作用最好的復配工藝為TBHQ+AP+DLTP。該組合對水溶性大蒜油氧化穩(wěn)定性具有較好的協(xié)同作用。三者產(chǎn)生協(xié)同作用主要是因為在多組分硫醚氧化的過程中均發(fā)揮關鍵作用，經(jīng)GC-MS判斷，新鮮大蒜提取的大蒜油中主要成分為硫醚化合物。為高效研究水溶性大蒜油穩(wěn)定性配方，將已知的抗氧化劑分別添加在大蒜油中，篩選出性能較好的抗氧化劑TBHQ為主要抗氧化成分，然后將TBHQ與PG、AP、AA進行二元復配和三元復配，篩選出協(xié)同性能高的抗氧化復配組合，并優(yōu)化其配方比例；通過比較氧化誘導時間得到最佳的復配工藝。依據(jù)過氧化值、折光指數(shù)、感官性狀3個指標得到大蒜油的氧化誘導時間，說明該產(chǎn)品被認定為氧化變質(zhì)只是因為感官性狀不被人接受，即使在感官性狀不良的狀態(tài)下，其本身的組分經(jīng)檢驗依然滿足過氧化值和折光指數(shù)的要求，此研究結果也說明大蒜油是天然的抗氧化劑。且在研究過程中發(fā)現(xiàn)，橘紅色水溶性大蒜油依然澄清透明，且經(jīng)過稀釋后會恢復澄清的淺黃色液態(tài)。為日后水溶性大蒜油的生產(chǎn)、儲存提供了新的探究思路，即是否可以將感官性狀不良的高濃度大蒜油稀釋成顏色可接受的低濃度大蒜油繼續(xù)使用。

本文在初篩抗氧化劑前，期望較大的是對大多數(shù)油脂類植物油抗氧化效果均有良好表現(xiàn)的BHT、BHA等，后來發(fā)現(xiàn)BHT、BHA的效果一般，原因可能是BHT、BHA是作用于高溫油脂類抗氧化劑，通過GC-MS可以看出，經(jīng)新鮮大蒜提取的大蒜油中主要成分為硫醚化合物，可見大蒜油與其他油脂性食品的成分差異很大。我們也發(fā)現(xiàn)水溶性大蒜油中氧化劑發(fā)揮作用時，產(chǎn)品的性狀變化較緩慢，當水溶性大蒜油開始出現(xiàn)褐化現(xiàn)象后，會迅速加快褐化成橘紅色。水溶性大蒜油的氧化是一個復雜的過程，亦會產(chǎn)生諸多副反應，應當對這些副反應進行后續(xù)探討。