鄔仲鑫 蔡煒龍 尹磊

胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率位居所有消化系統(tǒng)惡性腫瘤首位[1]。胃癌年病死率為25.2/10萬(wàn)人，占同期所有惡性腫瘤死亡的23.3%[2-4]。早期胃癌的預(yù)后較好，但是臨床上約90%胃癌患者就診時(shí)已處于進(jìn)展期，轉(zhuǎn)移率高，根治性切除率低，術(shù)后5年局部復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高達(dá)60%～70%，預(yù)后較差[5]。因此，探究促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找胃癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子，可為胃癌治療提供潛在的靶點(diǎn)，對(duì)提高患者預(yù)后具有重要意義。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)和計(jì)算機(jī)平臺(tái)的發(fā)展為非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)和分類(lèi)發(fā)揮了關(guān)鍵作用[6]。在這些非編碼RNA中，有一類(lèi)長(zhǎng)度大于200核苷酸的不具備蛋白編碼能力的RNA，稱(chēng)之為長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在調(diào)節(jié)基因表達(dá)的過(guò)程中發(fā)揮了非常重要的作用，其幾乎可以參與基因表達(dá)的各個(gè)階段，從而調(diào)控機(jī)體的各項(xiàng)生命活動(dòng)[7-9]。

腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程[10]。研究表明，lncRNA在腫瘤的生物學(xué)過(guò)程中扮演了重要角色，促進(jìn)了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11-13]。筆者通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中10對(duì)胃癌和癌旁組織RNA芯片結(jié)果進(jìn)行分析以及臨床樣本驗(yàn)證，篩選出胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)lncRNA BC015134，探究BC015134在胃癌發(fā)生、發(fā)展尤其是轉(zhuǎn)移方面的功能，為胃癌患者的治療提供潛在靶點(diǎn)，進(jìn)而改善預(yù)后。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃癌MGC-803細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；Trizol試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司；蛋白提取試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司；RNA pulldown試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo fisher scientific公司；Lipofectamine 2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；β-連環(huán)蛋白（β-Catenin）、神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）、上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；BC015134-shRNA質(zhì)粒、pcDNA3.1-BC015134過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、pcDNA3.1-β-Catenin過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、pBluescriptⅡSK-BC015134質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。人胃癌及癌旁組織取自2015年1月至2020年12月湖州市中心醫(yī)院行胃癌根治術(shù)患者80例，男49例，女31例，年齡40～78歲；病理檢查結(jié)果均為胃腺癌。本研究經(jīng)湖州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 MGC-803細(xì)胞置于含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，放置在含5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種至6孔板，第2天按照Lipofectamine 2000試劑的轉(zhuǎn)染步驟轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6 h后換液，48 h后用遺傳霉素（G418）2 mg/ml篩選4周。qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果后，得到穩(wěn)定敲減及過(guò)表達(dá)BC015134的感染細(xì)胞株。細(xì)胞株分為敲減對(duì)照組（sh-CTRL）、敲減BC015134組（sh-BC015134）、質(zhì)粒對(duì)照組（pcDNA3.1-CTRL）和質(zhì)粒過(guò)表達(dá)BC015134組（pcDNA3.1-BC015134）。

1.2.2 BC015134表達(dá)水平的檢測(cè) 采用Trizol試劑提取組織及細(xì)胞RNA，cDNA用PrimeScript?RT reagent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄，采用qRT-PCR檢測(cè)，使用SYBR?Premix Ex Taq?II試劑盒，GAPDH作為內(nèi)參。所有實(shí)驗(yàn)均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。選用GAPDH作為BC015134的對(duì)照基因。GAPDH引物序列：上游：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'；下游：5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。BC015134 引物序列：上游：5'-AGGCCCAAGTGTACCAATAAGC-3'；下游：5'-TGTTTAATAGACCTCAAAGCCAGAC-3'。采用 2-ΔΔCt定量計(jì)算基因表達(dá)水平。每組設(shè)3個(gè)副孔，結(jié)果取平均值。

1.2.3 MGC-803細(xì)胞侵襲及遷移能力的檢測(cè) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。取1.2.1中各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的的MGC-803 細(xì)胞，2×104個(gè)/孔接種到上層 8 μm Transwell小室中，下層孔板中加入700 μl完全培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，取出上層小室用PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染液染色15 min，PBS沖洗3遍，小室網(wǎng)篩上面殘留的細(xì)胞用棉棒擦除，置于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)穿透至小室篩網(wǎng)下面的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 富集蛋白的檢測(cè)及驗(yàn)證 采用RNA pulldown實(shí)驗(yàn)。BC015134的正義鏈和反義鏈RNA以pBluescriptⅡSK-BC015134質(zhì)粒為模版進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，同時(shí)進(jìn)行生物素標(biāo)記。用RNeasy Mini Kit純化RNA，定量后-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照Pierce?Magnetic RNAProtein Pulldown Kit試劑盒的步驟進(jìn)行RNA pulldown實(shí)驗(yàn)。對(duì)富集蛋白進(jìn)行凝膠電泳并銀染，觀察正義鏈及反義鏈RNA富集蛋白條帶的差異。采用Western blot法對(duì)富集蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 MGC-803細(xì)胞中 β-Catenin、N-cadherin、E-cadherin的表達(dá)測(cè)定 采用Western blot法。MGC-803細(xì)胞用PBS漂洗2遍，6孔板每孔加入200 μl RIPA細(xì)胞裂解液置冰上裂解30 min，放入低溫高速離心機(jī)中，8 000 r/min，4℃離心10 min，將蛋白上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，進(jìn)行蛋白定量后加入相應(yīng)體積的蛋白上樣緩沖液變性。配置電泳膠，上樣后電泳。根據(jù)蛋白分子量大小100 V恒壓轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后放入5%脫脂奶粉中封閉2 h，用PBST沖洗1遍。分別孵育1∶10 000稀釋的一抗（β-Catenin、N-cadherin、E-cadherin抗體，兔源）及1∶5 000稀釋的二抗（羊抗兔）。將孵育好抗體的膜放入顯影托盤(pán)中，滴加上適量的ECL顯影液，放入化學(xué)發(fā)光儀中顯影，曝光完成后選取最佳曝光時(shí)間的圖片進(jìn)行保存，觀察不同處理的細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；預(yù)后分析采用Pearson χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BC015134在胃癌組織中的表達(dá)情況 通過(guò)GEO數(shù)據(jù)檢索發(fā)現(xiàn)編號(hào)為GSE50710的芯片數(shù)據(jù)，該芯片最終篩選得到8條在胃癌和癌旁組織中差異表達(dá)的lncRNA。通過(guò)臨床樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BC015134在伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌原發(fā)灶中表達(dá)水平高于不伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的表達(dá)水平（圖1A）。進(jìn)一步在80對(duì)本院標(biāo)本庫(kù)中的臨床樣本上驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，高BC015134表達(dá)患者預(yù)后較差（圖1B）。BC015134全長(zhǎng)1 142個(gè)核苷酸（圖1C），通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心中的開(kāi)放閱讀框分析，確定了BC015134不具備蛋白編碼功能（圖1D）。

圖1 BC015134在胃癌組織中的表達(dá)情況（A：BC015134在胃癌原發(fā)灶有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)水平；B：高BC015134表達(dá)組及低BC015134表達(dá)組患者的生存曲線；C：BC015134的全長(zhǎng)序列；D：BC015134的開(kāi)放閱讀框分析）

2.2 轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后MGC-803細(xì)胞BC015134的表達(dá)及侵襲遷移能力 敲減BC015134組MGC-803細(xì)胞BC015134表達(dá)水平較敲減對(duì)照組明顯較少，質(zhì)粒過(guò)表達(dá)BC015134組表達(dá)水平較質(zhì)粒對(duì)照組明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)圖2A（插頁(yè)）。Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)BC015134能夠促進(jìn)MGC-803細(xì)胞侵襲及遷移（見(jiàn)圖2B，插頁(yè)），而敲減BC015134能夠抑制MGC-803細(xì)胞侵襲及遷移（圖2C，見(jiàn)插頁(yè)）。

圖2 BC015134表達(dá)及細(xì)胞侵襲遷移圖（A：MGC-803細(xì)胞中敲減及過(guò)表達(dá)BC015134后表達(dá)水平的比較，aP＜0.01，bP＜0.001；B：過(guò)表達(dá)BC015134促進(jìn)MGC-803細(xì)胞侵襲遷移，結(jié)晶紫染色，×200；C：敲減BC015134抑制MGC-803細(xì)胞侵襲遷移，結(jié)晶紫染色，×200）

2.3 富集蛋白的檢測(cè)及驗(yàn)證 RNA pulldown實(shí)驗(yàn)將與BC015134結(jié)合的蛋白進(jìn)行富集（圖3A，見(jiàn)插頁(yè)），發(fā)現(xiàn)其潛在結(jié)合蛋白β-Catenin。Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證BC015134能夠與β-Catenin相互結(jié)合（圖3B，見(jiàn)插頁(yè)）。在MGC-803細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BC015134，發(fā)現(xiàn)β-Catenin的表達(dá)水平也相應(yīng)增加（圖3C，見(jiàn)插頁(yè)），因此證明BC015134通過(guò)與β-Catenin相互結(jié)合促進(jìn)其表達(dá)。

圖3 RNA pulldown及Western blot結(jié)果圖（A：RNA pulldown實(shí)驗(yàn)后蛋白電泳膠進(jìn)行銀染實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B：BC015134與β-Catenin相互結(jié)合圖；C：過(guò)表達(dá)BC015134后β-Catenin電泳圖）

2.4 MGC-803細(xì)胞中β-Catenin、N-cadherin、E-cadherin的表達(dá) Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MGC-803細(xì)胞中過(guò)表達(dá)β-Catenin后，N-cadherin表達(dá)上調(diào)，而E-cadherin表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖4。

圖4 MGC-803細(xì)胞中過(guò)表達(dá)β-Catenin、N-cadherin及E-cadherin的電泳圖

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，早期發(fā)現(xiàn)率低，患者就診時(shí)往往合并淋巴結(jié)甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，可手術(shù)的患者術(shù)后也容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[5]。因此尋找調(diào)控胃癌轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)，探索其中的調(diào)控通路是亟需解決的問(wèn)題。lncRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)控作用越來(lái)越受到重視，筆者通過(guò)檢索GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出BC015134可能促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移的lncRNA。通過(guò)臨床樣本驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BC015134在伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌原發(fā)灶中表達(dá)水平高于不伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌原發(fā)灶中表達(dá)水平，且高BC015134表達(dá)的患者預(yù)后較差，這提示BC015134可能具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BC015134能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲遷移。以往的研究表明，lncRNA能夠與蛋白、mRNA、microRNA等相互作用發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，而其中最重要的就是與蛋白相互作用[9]。那么BC015134是否能與蛋白相互作用促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移呢？有研究發(fā)現(xiàn)β-Catenin在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮了非常重要的作用[14-16]。主要因?yàn)棣?Catenin能夠通過(guò)調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[17]。因此筆者推測(cè)BC015134是否能夠與β-Catenin相互結(jié)合促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移，通過(guò)RNA pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)合Western blot實(shí)驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)BC015134確實(shí)能夠與β-Catenin相互結(jié)合并進(jìn)一步促進(jìn)β-Catenin的表達(dá)。以往的研究表明，β-Catenin通過(guò)調(diào)節(jié)N-cadherin及E-cadherin的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14]。因此筆者在胃癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)β-Catenin后發(fā)現(xiàn)其確實(shí)發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。筆者考慮BC015134通過(guò)與β-Catenin相互結(jié)合促進(jìn)β-Catenin入核，進(jìn)而調(diào)控N-cadherin及E-cadherin的表達(dá)從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。那么BC015134是否能促進(jìn)β-Catenin入核以及具體是如何促進(jìn)β-Catenin入核的問(wèn)題需要進(jìn)一步探討，筆者在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將會(huì)進(jìn)行深入的研究。

綜上所述，BC015134在胃癌中高表達(dá)，其高表達(dá)提示患者預(yù)后較差。BC015134通過(guò)與β-Catenin相互結(jié)合誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。BC015134有望成為胃癌診斷和治療的新靶點(diǎn)。